車路陽(yáng)，趙曉東，陳麗萍，李晶哲

（1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心急救部，北京 100037；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100007）

銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa，PA），舊稱綠膿桿菌，是院內(nèi)感染的最常見條件致病菌，在長(zhǎng)期使用抗生素的高齡患者及其他免疫力低下患者中具有較高感染率[1-3]。目前，銅綠假單胞菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，且耐藥譜呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(shì)[4-7]，PA引起的下呼吸道感染特別是銅綠假單胞菌肺炎（PAP）遷延難愈，病死率高[5,8]，加之易產(chǎn)生耐藥菌株，治療難度大，是臨床高度關(guān)注和亟待解決的急癥。

目前下呼吸道銅綠假單胞菌感染常使用化學(xué)合成抗生素進(jìn)行聯(lián)合治療[9-10]，但銅綠假單胞菌廣泛耐藥性，加之長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素引起的菌群失調(diào)和肝腎損害等不良反應(yīng)。復(fù)合中藥方劑可從多種途徑發(fā)揮抗菌作用[11-14]。黃連解毒湯最早記載于《肘后備急方》，方劑以黃連為君，黃柏為臣，配以黃芩、梔子，通泄三焦之火，是清熱解毒的代表方?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃連解毒湯具有抗炎[15]，控制血糖[16]，降血脂改善動(dòng)脈粥樣硬化[17]等功效。在前期細(xì)菌體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)黃連解毒湯草藥的提取物對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)具有抑制作用。而在臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯全方劑對(duì)改善細(xì)菌性肺炎患者喘憋、呼吸困難等癥狀具有良好作用；且與單獨(dú)使用抗生素的患者相比，聯(lián)合應(yīng)用黃連解毒湯的患者的白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白（CRP）等感染、炎癥指標(biāo)明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有文獻(xiàn)研究表明，黃連解毒湯聯(lián)合抗菌藥物能夠降低體外殺滅PA抗菌藥物使用濃度[18]。本研究旨通過(guò)小鼠模型探究黃連解毒湯的抗銅綠假單胞菌機(jī)制。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料 銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa O1，ATCC.PA15692）。8周齡BABL/c小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。LB培養(yǎng)基（Merck?VetecTM），MH培養(yǎng)基（Merck? VetecTM）。PA菌液接種至LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)16 h，取出菌液調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠞岫却?。黃連解毒湯藥材（黃連、黃柏、黃芩、梔子）購(gòu)于同仁堂，過(guò)濾滅菌制成原液，以黃連計(jì)1 280 mg/mL；麥?zhǔn)蠞岫扔?jì)（中國(guó)食品藥品檢定研究院），細(xì)胞因子試劑盒（BD552364,BD Biosciences,USA），細(xì)菌總RNA提取試劑盒（天根DP430），Reverse Transcription System（A3500,Promega,USA），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201,TOYOBO,Japan）。

2.2 黃連解毒湯對(duì)銅綠假單胞菌相關(guān)基因的影響

2.2.1 最低抑菌濃度MIC測(cè)定 黃連解毒湯、頭孢他啶以MH培養(yǎng)基按照倍比稀釋法分別加入96孔板，每孔50 μL，每組8個(gè)復(fù)孔。通過(guò)前期工作經(jīng)驗(yàn)，黃連解毒湯（1 280 mg/mL，以黃連計(jì)）、頭孢他啶（1 024 μg/mL）配制初始濃度母液，以MH培養(yǎng)基倍比稀釋11個(gè)濃度，每孔50 μL。0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊你~綠假單胞菌液用MH培養(yǎng)基稀釋100倍后加入上述96孔板，每孔50 μL?？瞻捉M為稀釋后的菌液和不含藥MH培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)16 h后觀察細(xì)菌抑制狀況，確定黃連解毒湯和頭孢他啶的最低抑菌濃度。

2.2.2 黃連解毒湯對(duì)mucA、mraY、algD基因的影響 根據(jù)MIC值確定黃連解毒湯和頭孢他啶濃度作用于銅綠假單胞菌，使用MH培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)6 h及16 h后提取細(xì)菌總RNA，RT-PCR測(cè)定。引物序列見表1。藥物分組：空白、頭孢他啶、黃連解毒湯及黃連解毒湯加頭孢他啶。

表1 引物序列

2.3 黃連解毒湯對(duì)小鼠銅綠假單胞菌下呼吸道感染的治療

2.3.1 銅綠假單胞菌下呼吸道感染小鼠模型的建立 96只同窩8周齡BABL/c小鼠SPF環(huán)境飼養(yǎng)。小鼠隨機(jī)分為4組（A.空白組，B.頭孢他啶組，C.黃連解毒湯組，D.黃連解毒湯加頭孢他啶組），各組雌雄各12只。無(wú)菌術(shù)條件下小鼠麻醉后，頸前切開暴露氣管，其中B、C、D組向氣管內(nèi)注入0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊腜A菌液10 μL，A組注入無(wú)菌生理鹽水10 μL，縫合各層組織。

2.3.2 藥物治療與觀察 通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)和查閱資料，黃連解毒湯對(duì)小鼠細(xì)菌感染基本治療濃度是700 mg/kg（以黃連計(jì)）[19]，頭孢他啶對(duì)小鼠PA感染的治療濃度是65 mg/kg[20]，黃連解毒湯與頭孢他啶分別配制為1 500 mg/mL與500 mg/mL的母液。按體質(zhì)量計(jì)算藥液量，黃連解毒湯、頭孢他啶均灌胃給藥。空白組使用滅菌生理鹽水代替藥物。

2.3.3 組織病理檢查與血液檢查 于第3、第5天取小鼠全血，以抗凝管收集血液1 mL，CBA法測(cè)定細(xì)胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6/10/12p70）。于第3、第10天解剖獲取肺組織，制作石蠟切片，觀察組織變化。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 MIC值的測(cè)定 藥物梯度96孔板培養(yǎng)16 h后觀察細(xì)菌濁度，黃連解毒湯160 mg/mL（以黃連計(jì)）、頭孢他啶8 μg/mL時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制。黃連解毒湯和頭孢他啶的MIC分別為160 mg/mL和8 μg/mL。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將以這2個(gè)濃度為基礎(chǔ)。

3.2 聯(lián)合用藥 可以抑制mucA、mraY、algD等基因的表達(dá) 。如表2（培養(yǎng)6 h）和表3（培養(yǎng)16 h）所示，黃連解毒湯加強(qiáng)了頭孢他啶對(duì)mraY表達(dá)的抑制作用。同時(shí)，與黃連解毒湯共培養(yǎng)后明顯抑制了mucA和algD基因的表達(dá)，并且在與頭孢他啶聯(lián)合用藥后，上述兩基因的表達(dá)抑制更加明顯（P＜0.05），頭孢他啶能夠加強(qiáng)黃連解毒湯對(duì)mucA和algD兩種基因表達(dá)的抑制。數(shù)據(jù)為至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。

表2 mucA、mraY、algD表達(dá) （第6小時(shí)取樣測(cè)定）（，n =3）

表2 mucA、mraY、algD表達(dá) （第6小時(shí)取樣測(cè)定）（，n =3）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；## P ＜0.01

表3 mucA、mraY、algD表達(dá) （第16小時(shí)取樣測(cè)定）（，n =3）

表3 mucA、mraY、algD表達(dá) （第16小時(shí)取樣測(cè)定）（，n =3）

注：與空白組比較，### P ＜0.001

3.3 銅綠假單胞菌下呼吸道感染小鼠模型的治療實(shí)驗(yàn)

3.3.1 聯(lián)合用藥可以降低血液中炎性因子群的含量 PAP小鼠治療實(shí)驗(yàn)，在第3、第5天各治療方案血液炎性因子檢測(cè)結(jié)果分別如表4、表5所示。取樣的2個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用頭孢他啶或黃連解毒湯治療相比，兩者聯(lián)合用藥治療后，各取樣時(shí)間點(diǎn)血液中TNF-α，IFN-γ，IL-6/10/12p70等炎性因子下降效果顯著。且黃連解毒湯組的TNF-α、IL-6、IL-10等指標(biāo)顯著低于頭孢他啶組。黃連解毒湯具有輔助頭孢他啶進(jìn)行抗炎治療的作用。

表4 血漿炎性因子群的表達(dá)（3 d）（，n =3）

表4 血漿炎性因子群的表達(dá)（3 d）（，n =3）

注：與頭孢他啶組或黃連解毒湯組比較，# P ＜0.05；與頭孢他啶組比較，△P ＜0.05

表5 血漿炎性因子群的表達(dá)（5 d）（，n =3）

表5 血漿炎性因子群的表達(dá)（5 d）（，n =3）

注：與頭孢他啶組或黃連解毒湯組比較，# P ＜0.05；與頭孢他啶組比較，△P ＜0.05

3.3.2 聯(lián)合用藥可以加快肺組織腫脹恢復(fù)和炎癥消退 小鼠肺臟不同時(shí)間點(diǎn)石蠟切片HE染色結(jié)果圖1所示，由圖可見，單獨(dú)應(yīng)用黃連解毒湯治療，與頭孢他啶相比，第3天時(shí)肺泡間隔腫脹略嚴(yán)重，但炎細(xì)胞浸潤(rùn)更少。而聯(lián)合用藥組在第10天時(shí)組織腫脹和炎細(xì)胞浸潤(rùn)均優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用頭孢他啶組，肺泡形態(tài)基本接近陰性對(duì)照（正常）。

4 討論

圖1 小鼠PA感染肺石蠟切片HE染色

黃連解毒湯作為清熱解毒的中藥經(jīng)典方劑。PA肺炎小鼠模型治療實(shí)驗(yàn)中，與單純使用頭孢他啶相比，黃蓮解毒湯聯(lián)合頭孢他啶治療后，小鼠血液中炎性指標(biāo)明顯下降，肺組織腫脹和炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕且恢復(fù)較快。聯(lián)合用藥組小鼠進(jìn)食、飲水及其他活動(dòng)明顯多于其他組。說(shuō)明黃連解毒湯對(duì)小鼠PA下呼吸道感染具有治療作用。

研究表明，黃連解毒湯方劑能有效抑制IL-2、TNF-α、IFN-γ 等炎性因子的形成[21]，其內(nèi)梔子苷、黃芩苷等單藥有效成分亦有一定的抗炎作用[22]。有研究認(rèn)為，抗炎作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)代謝產(chǎn)物和酶，從而影響巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)[23]。本研究中，PA肺炎小鼠通過(guò)單獨(dú)使用黃連解毒湯治療，其中一些炎性因子例如TNF-α，IL-6/10等甚至低于單純抗生素治療組。前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，無(wú)論藥物治療還是自然病程，在第3天時(shí)血液炎癥指標(biāo)達(dá)到最高峰。聯(lián)合用藥組中，第5天時(shí)，各種炎性指標(biāo)明顯低于單獨(dú)用藥組，肺組織切片中，單獨(dú)應(yīng)用黃連解毒湯或與頭孢他啶聯(lián)合應(yīng)用，在10天時(shí)肺部炎細(xì)胞浸潤(rùn)少于單獨(dú)應(yīng)用頭孢他啶組。這些現(xiàn)象證明黃連解毒湯本身具有抗炎作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21-23]。而且這種抗炎作用能夠加強(qiáng)頭孢他啶的治療效果，這對(duì)于促進(jìn)呼吸困難、喘憋等炎性浸潤(rùn)癥狀的緩解，特別是改善高齡患者預(yù)后具有重要意義。

銅綠假單胞菌（PA）是假單胞菌屬的代表菌，其特征是需氧有鞭毛，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。引起PA產(chǎn)生多重耐藥的機(jī)制主要包括：1）分泌β-內(nèi)酰胺酶等蛋白酶類降解抗生素；2）通過(guò)增加主動(dòng)外排藥物和減少膜孔蛋白等方式降低細(xì)胞膜通透性，使藥物難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；3）藥物作用位點(diǎn)突變，使藥物作用位點(diǎn)（如氟喹諾酮類殺菌重要位點(diǎn)拓?fù)洚悩?gòu)酶II）不再能與藥物穩(wěn)定結(jié)合；4）生物膜的形成[9,24]。

為研究黃連解毒湯對(duì)PA的抗菌作用和可能機(jī)制，根據(jù)我們的前期研究以及查閱相關(guān)資料，選擇了觀察mucA、mraY、algD等3種基因在治療過(guò)程中的表達(dá)狀況。磷酸-N-乙酰胞壁酸酯-胸腺噴丁轉(zhuǎn)位酶（mraY）是PA細(xì)胞壁主要成分肽聚糖合成的重要酶，可作為細(xì)胞壁合成的標(biāo)志[25-26]。mucA基因與PA菌生物膜形成[24,27]、特別是生物膜重要成分藻酸鹽合成[28]相關(guān)。algD基因則是與PA藻酸鹽合成相關(guān)的直接基因[29-30]，處于mucA基因下游，有文獻(xiàn)報(bào)道，mucA基因突變可導(dǎo)致algD基因表達(dá)去阻遏，藻酸鹽過(guò)量表達(dá)[31]。因此，algD與mucA基因一起，可作為PA生物膜形成的標(biāo)志物。

生物膜是包被于外界物體表面（在本實(shí)驗(yàn)中是包被于感染的肺組織之外）的復(fù)雜細(xì)菌組織，包括實(shí)現(xiàn)復(fù)雜物質(zhì)互通的細(xì)菌群落及其分泌的蛋白質(zhì)、多糖、肽聚糖等形成的覆蓋于其表面的復(fù)雜黏液被膜。生物膜具有復(fù)雜的代謝過(guò)程，對(duì)于抗生素和受感染宿主的本身免疫反應(yīng)具有很強(qiáng)的抵抗力，破壞生物膜的穩(wěn)定性能夠大大減少細(xì)菌的耐藥程度[32-33]。

頭孢他啶是第三代頭孢菌素，其殺菌原理和其他β-內(nèi)酰胺類抗生素一致，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。藥物共培養(yǎng)試驗(yàn)可見。頭孢他啶組mraY基因表達(dá)明顯下降，殺菌原理與文獻(xiàn)報(bào)道一致[34]。而黃連解毒湯與PA菌共培養(yǎng)后，無(wú)論是否聯(lián)合頭孢他啶，mucA、algD兩組基因表達(dá)均較陰性、陽(yáng)性對(duì)照組明顯下降。證明黃連解毒湯能夠通過(guò)抑制藻酸鹽的合成從而破壞PA細(xì)菌生物膜的形成，達(dá)到殺菌的作用。

黃連解毒湯對(duì)PA下呼吸道感染小鼠具有治療作用，該方能夠通過(guò)破壞PA細(xì)菌生物膜的穩(wěn)定性起到殺菌作用，聯(lián)合頭孢他啶使用時(shí)明顯增強(qiáng)抗菌效果；同時(shí)能夠通過(guò)抗炎作用，緩解PA感染帶來(lái)的機(jī)體炎癥反應(yīng)，促進(jìn)癥狀緩解，減少病死率。