王世偉，王卿惠，翟麗萍，劉軍，于志丹，向文勝*

多組學(xué)分析在解淀粉芽孢桿菌相關(guān)功能機(jī)制研究中的應(yīng)用進(jìn)展

王世偉1,2，王卿惠3，翟麗萍1,2，劉軍1,2，于志丹1,2，向文勝3*

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161005；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

解淀粉芽孢桿菌()具有多種有益生物學(xué)特性，可產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，具有重要的生理生化功能，如生物膜形成與定殖、促進(jìn)植物生長、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生耐鹽性等。綜述了基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等多組學(xué)分析方法在解淀粉芽孢桿菌的抗菌活性、定殖、促生、植物耐鹽性誘導(dǎo)等方面的研究進(jìn)展。

解淀粉芽孢桿菌；多組學(xué)分析；鑒定；功能；分子機(jī)制

解淀粉芽孢桿菌()屬革蘭陽性菌，能產(chǎn)生多種酶類和抗菌活性物質(zhì)，具有生物膜形成、定殖和促生等重要生理功能；因此，在種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、果蔬采后病害防治、環(huán)保、食品安全等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[1–2]。隨著基因組測序的進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)盡管解淀粉芽孢桿菌基因序列比較保守，但其基因結(jié)構(gòu)仍存在差異[3]。筆者歸納了近年來利用多組學(xué)分析對解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行的生理生化特性及相關(guān)功能的研究，旨在將成果更好地應(yīng)用于實踐。

1　解淀粉芽孢桿菌基因組學(xué)研究

基因組學(xué)分析是系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要方法，它包括以全基因組測序為目標(biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)。解淀粉芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的1個種。為鑒定該菌種，常通過其形態(tài)學(xué)，如細(xì)胞大小、芽孢形態(tài)、位置和菌落等特征加以研究；在此基礎(chǔ)上再根據(jù)其生理生化特征進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。該種與枯草芽孢桿菌()在形態(tài)學(xué)上十分相似，單憑上述方法難以準(zhǔn)確鑒定；因此，需要通過16 SrRNA基因序列比對和比較DNA回旋酶A亞基基因()或B亞基基因()等分子方法才能更準(zhǔn)確地鑒定。隨著解淀粉芽孢桿菌全基因組測序技術(shù)的不斷完善，可通過全基因組測序技術(shù)對該菌進(jìn)行鑒定。

1.1　解淀粉芽孢桿菌的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究

自從2007年完成解淀粉芽孢桿菌FZB42全基因組測序，迄今已對50多株菌株的全基因組進(jìn)行了測序。通過測序，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)有以下特點(表1)：①染色體一般呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)；②已測序基因組大小平均為3 990.462 kb，已測序并發(fā)表的15株解淀粉芽孢桿菌平均編碼蛋白質(zhì)基因3 927.86個；③包含的RNA基因的數(shù)目不一，如有的菌有63或87個tRNA基因，有的菌有7、16或27個rRNA基因，有的菌有6個sRNA基因，有的菌有86、69、80、109、117個不同RNA基因。

表1　部分解淀粉芽孢桿菌的全基因組測序結(jié)果及基因的結(jié)構(gòu)和功能

從表1還可以看出，解淀粉芽孢桿菌功能基因組有如下幾個特征：①含質(zhì)?；驘o質(zhì)粒，G+C高(分別為46.50%、46.45%)；②有串聯(lián)重復(fù)序、重疊群(contigs)；③含有微衛(wèi)星或大衛(wèi)星DNA；④一些菌基因組中心部分倒置，可能是前噬菌體或CRISPR結(jié)構(gòu)域；⑤含有核糖體合成多肽基因(如細(xì)菌素)；⑥含有非核糖體肽合成酶(NRPS)基因，如表面素(surfactin)、芬薺素(fengycin)，伊枯草菌素(iturin)、桿菌肽的合成基因，以及聚酮類大基因簇；⑦含有產(chǎn)酶基因，如α–淀粉酶基因；⑧含有植物生長、防御、促生、生物膜形成基因，如吲哚三乙酸和乙偶姻相關(guān)基因；⑨含有抗毒、耐受性和揮發(fā)物合成基因；⑩含有基因、調(diào)節(jié)基因()等。可見，解淀粉芽孢桿菌基因結(jié)構(gòu)決定了其生理功能。

1.2　解淀粉芽孢桿菌基因組的總體特征

從不同角度對解淀粉芽孢桿菌基因組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌基因組的相關(guān)基因具有多樣性、保守型、可塑性和進(jìn)化性等特征。

1) 多樣性。NIAZI等[27]對解淀粉芽孢桿菌UCMB5113基因組進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)其染色體由3 889 532 bp組成，能編碼3 656種蛋白，含有能促進(jìn)植物生長的基因(如吲哚–3–乙酸、乙酰膽堿酯酶合成基因及鐵載體生產(chǎn)基因)、負(fù)責(zé)非核糖體次級代謝產(chǎn)物合成的基因、與菌株環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)的抗藥物合成基因及抗金屬基因，以及編碼一系列分泌蛋白(降解根際大分子)、初級和次級代謝酶、碳水化合物活性酶和膜轉(zhuǎn)運(yùn)體基因?？梢姡湍硞€菌株而言，基因組相關(guān)功能基因比較豐富，具有多樣性。

2) 相對保守性。HOSSAIN等[28]對12個芽孢桿菌基因組進(jìn)行了測序。研究發(fā)現(xiàn)，盡管芽孢桿菌基因家族基因組存在比較寬泛的相似度(32%～90%)，但其基因組存在高度保守性。對其核心基因組中2 839個基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其中73個基因與生物控制以及根、葉定殖有關(guān)；盡管編碼次生代謝產(chǎn)物合成基因簇不同，但在亞種內(nèi)聚酮生物合成、編碼地非西丁和麥克勞汀的基因簇高度保守?？梢?，對大多數(shù)解淀粉芽孢桿菌菌株而言，其基因組特定功能基因具有相對的保守性。

3) 可塑性。BELBAHRI 等[29]以所有已測序的解淀粉芽孢桿菌基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同菌株促進(jìn)植物生長的策略不同，其次級代謝產(chǎn)物具有多樣性。推測正是因為這種基因組的可塑性區(qū)域，塑造了基因組結(jié)構(gòu)和功能的差異，并控制菌株適應(yīng)不同生態(tài)位。

4) 進(jìn)化性。解淀粉芽孢桿菌在進(jìn)化過程中受到植物宿主和植物病原菌的影響，其基因組基因進(jìn)化源于多種因素。ZHANG等[30]分析了31株在進(jìn)化地位上比較接近的枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌全基因組序列，這些菌株包括來源于植物生境菌株(PA)和非植物生境菌株(NPA)。研究發(fā)現(xiàn)，與NPA菌株相比，PA菌株核心基因組中間代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的豐度更高，并存在額外植物源底物利用和抗生素合成專門基因。這些“特化”基因只有少數(shù)是在最初分化過程中由PA菌株獲得，而大多數(shù)是由不同PA菌株亞群在進(jìn)化過程中依次獲得。可見，來源于不同生境的芽孢桿菌基因組的變化很大程度受植物生境的影響，不同生境對其基因組的影響是逐步發(fā)生的，從而導(dǎo)致不同菌株生理功能的變化。解淀粉芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌(sp.)的抑制作用較強(qiáng)，然而鐮刀菌也能產(chǎn)生多種重要的酶類，包括纖維酶、果膠酶和木聚糖水解酶等[31]；因此，在研究解淀粉芽孢桿菌基因組變化時，不但要考慮生境對其進(jìn)化的影響，還要考慮其所抑制的植物病原真菌對其進(jìn)化的影響。

1.3　解淀粉芽孢桿菌基因的調(diào)控研究

解淀粉芽孢桿菌基因調(diào)節(jié)受多種原件控制，其中啟動子、σ因子D、膠原蛋白基因、和基因以及DegU的調(diào)節(jié)作用尤為明顯。

1.3.1有關(guān)解淀粉芽孢桿菌啟動子的研究

啟動子(promoter)的強(qiáng)弱直接影響轉(zhuǎn)錄率，因此，對解淀粉芽孢桿菌強(qiáng)啟動子的篩選具有重要意義。LIAO等[32]構(gòu)建了啟動子探針載體pBE–，鑒定出266個含活性啟動子成分菌，其中啟動子P41在大腸埃希菌和解淀粉芽孢桿菌中表現(xiàn)出較強(qiáng)β–gal活性。核糖體結(jié)合位點從p41變成p382的優(yōu)化，使β–gal活性提高200%?？梢?，獲得強(qiáng)啟動子對該菌基因表達(dá)具有重要意義。為解除嘌呤合成途徑中嘌呤操縱子的調(diào)控，優(yōu)化呼吸鏈能量生產(chǎn)，提高解淀粉芽孢桿菌XH7鳥苷生產(chǎn)量，LIAO等[33]在啟動子取代突變子的研究中發(fā)現(xiàn)，與XH7相比，XH7purE::P41獲得了最高鳥苷生產(chǎn)量(16.3 g/L)，在XH7purE::P41突變菌株中，嘌呤操縱子基因(,和) 相對表達(dá)水平被上調(diào)，嘌呤代謝途徑中的主要中間產(chǎn)物(次黃苷–磷酸，IMP)濃度大幅度增加，XH7pure::p41突變體最終鳥苷產(chǎn)量比XH7突變體增加41%?？梢?，要提高某種產(chǎn)物的產(chǎn)量，可以選用強(qiáng)啟動子，也可以在此基礎(chǔ)上，破壞5非翻譯區(qū)的某些原件、結(jié)合啟動子突變和修飾呼吸鏈上的某些酶來提高中間產(chǎn)物產(chǎn)量，最終提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。

1.3.2有關(guān)解淀粉芽孢桿菌σ因子D的研究

σ因子作為一種非專一性蛋白，是DNA依賴的RNA聚合酶固有組分，能識別啟動子共有序列并與全酶結(jié)合。在桿菌中，σ因子D負(fù)責(zé)鞭毛蛋白、甲基接受趨化因子和自溶素的合成。解淀粉芽孢桿菌某些菌株的σ因子對功能基因的調(diào)節(jié)也起著重要的作用。FAN等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在解淀粉芽孢桿菌FZB42突變子中，敲除σ因子D，將使一整套基因下調(diào)；在轉(zhuǎn)錄水平上，該菌株的σ因子D能控制8個基因(、、、、、、和)，其中4個基因功能未知，2個基因在模式菌株168中不存在(為解淀粉芽孢桿菌特有的基因)，這8個基因參與解淀粉芽孢桿菌孢子形成、生物膜形成以及代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)等功能?？梢?，對解淀粉芽孢桿菌σ因子D的研究有助于揭示解淀粉芽孢桿菌許多特殊的重要功能和相關(guān)功能基因的調(diào)控機(jī)制。

1.3.3有關(guān)解淀粉芽孢桿菌膠原蛋白基因及和基因功能的研究

膠原蛋白(CLPs)基因簇對解淀粉芽孢桿菌生理功能的發(fā)揮具有重要作用。ZHAO等[35]研究了解淀粉芽孢桿菌FZB42中推斷的CLPs，運(yùn)用掃描電鏡和疏水值檢測技術(shù)，研究了CLPs突變細(xì)胞的形態(tài)和表面結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLPs對細(xì)菌自聚集和根系粘附具有一定作用；在生物膜形成和細(xì)菌–植物相互作用中，位于細(xì)菌細(xì)胞外的CLPs發(fā)揮了重要作用，敲除任何一個基因都將產(chǎn)生獨特的形態(tài)表型。表明解淀粉芽孢桿菌生物膜形成與特定基因有關(guān)，并受其他調(diào)控因子調(diào)控。

解淀粉芽孢桿菌和基因?qū)Χㄖ澈痛偕哂姓{(diào)控作用。BUDIHARJO 等[36]以轉(zhuǎn)座子突變?yōu)榛A(chǔ)，建立轉(zhuǎn)座子文庫，篩選參與植物多細(xì)胞行為和根系生物膜形成的基因，并通過救援克隆和DNA測序確定了轉(zhuǎn)座子的插入位點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZB42中的A和基因產(chǎn)物對細(xì)菌定殖于植物具有重要作用；A突變體的生長、生物膜形成以及在瓊脂平板上群集運(yùn)動均受到限制；基因在枯草芽孢桿菌類群中出現(xiàn)的頻率很低，直接參與促進(jìn)植物生長。

2　多組學(xué)分析運(yùn)用于解淀粉芽孢桿菌功能的研究

轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析是細(xì)胞表型和功能研究的重要手段。與基因組不同，轉(zhuǎn)錄組定義中包含時間和空間限定。同一細(xì)胞在不同生長時期及生長環(huán)境下，其基因表達(dá)不完全相同。解淀粉芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄組分析能揭示其重要功能基因表達(dá)的時空性。蛋白質(zhì)組學(xué)是指利用各種技術(shù)研究蛋白質(zhì)組的一門新學(xué)科，其主要目的是研究生物體內(nèi)所有蛋白質(zhì)種類、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)，以了解蛋白質(zhì)之間的相互聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)的功能。

2.1　解淀粉芽孢桿菌對植物病原菌的抗性的研究

2.1.1利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析研究解淀粉芽孢桿菌對植物抗病原菌的抗性

雖然控制特定代謝物基因簇轉(zhuǎn)錄的起始蛋白已經(jīng)確定，但影響轉(zhuǎn)錄延伸的蛋白質(zhì)還未被廣泛研究。GOODSON等[37]分析了轉(zhuǎn)錄延伸蛋白NusG家族的系統(tǒng)發(fā)育，發(fā)現(xiàn)其包括1個連貫的旁系外群(LoaP)，通常位于代謝產(chǎn)物基因簇之間或內(nèi)部；解淀粉芽孢桿菌LoaP作為此蛋白亞群的一個范例，調(diào)節(jié)位于2種不同抗生素生物合成操縱子終止位點的轉(zhuǎn)錄讀取。LIU等[38]篩選了2株對大豆赤霉菌有抑制作用的芽孢桿菌(淀粉樣芽孢桿菌JDF3和枯草芽孢桿菌RSS–1)，應(yīng)用比較轉(zhuǎn)錄組分析法研究了大豆赤霉菌在解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌脅迫下的反應(yīng)。結(jié)果表明，大豆赤霉菌表達(dá)基因發(fā)生了顯著變化，共檢測到1 616個差異表達(dá)基因(DEGs)；解淀粉芽孢桿菌參與2種主要類型的監(jiān)管，即“殊性監(jiān)管”和“共性監(jiān)管”，通過抑制大豆赤霉菌核糖體活性來抑制其生長；同時解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液可誘導(dǎo)活性氧迸發(fā)(Active oxygen burst)，產(chǎn)生NO，使愈傷組織沉積和木質(zhì)化，從而對植物起到保護(hù)作用。

2.1.2利用多組學(xué)分析研究解淀粉芽孢桿菌抗植物病原菌、抗腫瘤的特性

解淀粉芽孢桿菌對多種植物病原菌具有抗性。TANG等[39]篩選了生防劑淀粉芽孢桿菌GJ1，用于苗圃植物柑橘黃龍病(HLB) 的控制。轉(zhuǎn)錄組和等壓標(biāo)記RNA序列相對和絕對定量蛋白質(zhì)組分析顯示，經(jīng)解淀粉芽孢桿菌GJ1處理和未經(jīng)處理的亞洲鼠李菌感染柑橘的解毒反應(yīng)存在差異。蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組相關(guān)分析顯示，蛋白質(zhì)表達(dá)顯著不同，在GO和KEGG 通路中基因表達(dá)也顯著不同。解淀粉芽孢桿菌Q–426能產(chǎn)生具有抗真菌活性脂肽類化合物，起始pH對脂肽化合物生產(chǎn)影響很大。ZHAO等[40]采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)、二維電泳技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)對解淀粉芽孢桿菌 Q–426 進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)pH 5.0時，一共鑒定出24個差異表達(dá)蛋白點；某些蛋白專門用于調(diào)節(jié)細(xì)菌素和芬薺素的合成，其中包括3種與壓力反應(yīng)相關(guān)的誘導(dǎo)性蛋白質(zhì)(焦磷酸硫胺素依賴乙酰膽堿酯酶、丁二醇脫氫酶、2ABC型寡肽運(yùn)輸系統(tǒng)蛋白)和2個組成反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(DegU、分支酸變位酶PheB)。說明在不同pH條件下，解淀粉芽孢桿菌Q–426抗性存在天然差異，其原因是解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生了相關(guān)的誘導(dǎo)性蛋白質(zhì)。

LU等[41]從解淀粉芽孢桿菌X030中分離到脂肽–桿菌霉素 Lb，發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤細(xì)胞(如 SMMC–7721和MDA–MB–231)具有抑制活性；全基因組和生長蛋白組學(xué)分析表明，桿狀霉素 Lb 生物合成基因簇、關(guān)鍵酶基因、調(diào)控蛋白基因(、、和)以及其初級代謝相關(guān)基因與桿狀霉素Lb合成之間具有相關(guān)性；添加氨基酸(如谷氨酸)和蔗糖的發(fā)酵上清液具有顯著的抗腫瘤活性，說明其在代謝調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。

2.2　多組學(xué)分析運(yùn)用于解淀粉芽孢桿菌與植物共生分子機(jī)制的研究

2.2.1轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析運(yùn)用于解淀粉芽孢桿菌生物膜形成及植物促生機(jī)理的研究

解淀粉芽孢桿菌與植物可形成共生關(guān)系，促進(jìn)植物生長。FAN等[42]為了解細(xì)菌–植物共生分子機(jī)制，在根際模擬生長條件下，利用差分RNA測序(drna–seq)系統(tǒng)分析了FZB42菌株初級轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)有4 877個編碼蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，確定了不同生長條件下的差異表達(dá)基因，并糾正了許多以前錯誤注釋的基因；研究還發(fā)現(xiàn)，大量核糖開關(guān)和順式編碼反義RNA，以及可能在芽孢桿菌基因調(diào)控中起重要作用的反式小非編碼RNA，提高了根桿菌與宿主的相互作用。KR?BER等[43]在轉(zhuǎn)錄水平上研究了解淀粉芽孢桿菌FZB42生物膜的形成機(jī)制，并在生物膜形成和浮游生長條件下，對菌株整個轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫進(jìn)行了高通量測序。通過比較轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了1組與基本細(xì)胞功能有關(guān)的常見高度轉(zhuǎn)錄基因；在2種生長條件下，菌體細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄最快的基因為編碼抗菌肽(AMP)基因；相比之下，在生物膜形成細(xì)胞中，編碼抗菌特性次級代謝產(chǎn)物合成基因簇僅被適度轉(zhuǎn)錄，而不被誘導(dǎo)；轉(zhuǎn)錄組中有331個基因明顯上調(diào)，230個基因下調(diào)；在最高上調(diào)基因中，出現(xiàn)操縱子，它編碼與乳鏈菌肽(class I bacteriocin)抗性有關(guān)的產(chǎn)物，在果糖胺代謝中起作用的操縱子產(chǎn)物得到增強(qiáng)；在FZB42生物膜中，參與細(xì)胞外生物膜基質(zhì)生產(chǎn)基因、胞外多糖基因()和編碼纖維合成的操縱子在其轉(zhuǎn)錄過程中被上調(diào)；而鞭毛器合成、組裝和調(diào)節(jié)基因以及芳香化合物降解基因和銅分泌等相關(guān)基因被強(qiáng)烈下調(diào)。

IRIZARRY等[44]利用基因芯片和RT–qPCR 檢測了接種解淀粉芽孢桿菌的棉花幼苗根系中基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)接種解淀粉芽孢桿菌的棉花幼苗根系中有252個轉(zhuǎn)錄體差異表達(dá)，139個轉(zhuǎn)錄體上調(diào)，113個轉(zhuǎn)錄體下調(diào)；部分上調(diào)的轉(zhuǎn)錄體與硝酸鹽同化、細(xì)胞生長、激素分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生以及抗氧化作用有關(guān)；接種解淀粉芽孢桿菌的棉花幼苗根系中活性氧和木質(zhì)素積累量較大，同時出現(xiàn)了多種功能基因的差異表達(dá)。說明解淀粉芽孢桿菌能引起幼苗根系復(fù)雜的遺傳反應(yīng)。GAMEZ等[45]對威廉姆斯香蕉中芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的植物根際促生菌(PGPR)進(jìn)行了評估，研究發(fā)現(xiàn)，植物體接種了解淀粉芽孢桿菌菌株Bs006和熒光假單胞菌Ps006之后，22個威廉姆香蕉基因中，大部分有差異表達(dá)。說明解淀粉芽孢桿菌Bs006 和熒光假單胞菌Ps006在不同時間點刺激不同基因群的定殖過程和水平受單獨細(xì)菌的影響。

2.2.2蛋白質(zhì)組學(xué)分析運(yùn)用于解淀粉芽孢桿菌的定殖、促生的研究

SHAHZAD等[46]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加2%和3.5%甲醇的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌RWL–1顯著生長；在甲醇存在下，RWL–1產(chǎn)生的IAA水平明顯提高，但ABA水平降低；酶抗氧化劑和功能性氨基酸(谷氨酸和丙氨酸)明顯上調(diào)，并表達(dá)出8種不同類型蛋白質(zhì)(包括解毒蛋白、抗氧化特性酶、蛋白酶、代謝酶、核糖體蛋白、抗氧化蛋白、伴侶蛋白和熱休克蛋白)；RWL–1在補(bǔ)充甲醇的培養(yǎng)基中生長時，可產(chǎn)生植物激素，特異性蛋白和不同生物化學(xué)物質(zhì)的表達(dá)增加。QIU等[47]為了鑒定用于根系定殖和生物膜形成的關(guān)鍵蛋白，比較研究了浮游和根系定殖的解淀粉芽孢桿菌SQR9蛋白質(zhì)譜系。研究表明，當(dāng)SQR9菌株定殖于根部時，共鑒定出了755種蛋白質(zhì)，其中有78種蛋白質(zhì)顯著增加，95種蛋白質(zhì)顯著減少，它們多是與根部定殖密切相關(guān)的功能性蛋白，包括生物控制、脫毒、生物膜形成、細(xì)胞運(yùn)動和趨化、運(yùn)輸和植物多糖降解等功能蛋白；與浮游狀態(tài)相比，雙組分系統(tǒng)蛋白ResE增加了100倍；基因損傷可通過spooa–sini–yqxm途徑調(diào)節(jié)雙組分系統(tǒng)蛋白，推遲了細(xì)胞生物膜形成，降低了根系定殖能力?？梢姡琒QR9蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)為篩選植物根桿菌中的關(guān)鍵蛋白提供了有價值的線索。

2.3　轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析運(yùn)用于解淀粉芽孢桿菌誘導(dǎo)植物耐鹽性的研究

解淀粉芽孢桿菌FZB42能誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生系統(tǒng)耐鹽性。LIU等[48]利用Illumina測序技術(shù)對鹽脅迫下生長的擬南芥幼苗組織進(jìn)行了大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果表明：FZB42接種后，在0 mmol/L NaCl處，有1 461個基因差異表達(dá)，其中953個基因上調(diào)，508個基因下調(diào)；在100 mmol/L NaCl處，有1 288個基因差異表達(dá)，其中1 024個基因上調(diào)，264個基因下調(diào)；FZB42接種后，鹽敏感性降低，鹽適應(yīng)性增強(qiáng)； FZB42通過激活植物ET/JA信號而非ABA依賴途徑誘導(dǎo)植物耐鹽性。CHAUHAN等[49]選擇解淀粉芽孢桿菌–SN13和水稻()研究了鹽脅迫下植物與PGPR相互作用的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)，脅迫期間，接種SN13能顯著提高水稻生物量、相對含水量、脯氨酸和可溶性總糖含量，降低脂質(zhì)過氧化和電解質(zhì)滲漏；在SN13 脅迫下，水稻根系轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)也發(fā)生了廣泛變化，與鹽脅迫或單獨接種SN13 相比，根際細(xì)菌在鹽脅迫下誘導(dǎo)了大量與光合作用、激素和脅迫反應(yīng)相關(guān)基因以及細(xì)胞壁和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，表明根際細(xì)菌SN13 能減少鹽脅迫的有害影響。為了驗證RNA–seq數(shù)據(jù)，對不同功能類別(包括代謝、調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)和轉(zhuǎn)運(yùn)體)的表達(dá)基因進(jìn)行了qRT–PCR。結(jié)果表明，在應(yīng)力和非應(yīng)力條件下，根系對SN13的響應(yīng)存在質(zhì)和量的差異，表明SN13在逆境中發(fā)揮了重要作用。

亞精胺誘導(dǎo)植物產(chǎn)生耐鹽性的機(jī)理正在不斷被揭示。CHEN等[50]研究發(fā)現(xiàn)，接種淀粉芽孢桿菌SQR9能提高擬南芥和玉米的耐鹽性；利用不同截留分子量透析袋對SQR9分泌的分子進(jìn)行了分離，發(fā)現(xiàn)亞精胺有助于提高植物耐鹽性，SQR9精胺缺乏突變體無法誘導(dǎo)植物耐鹽性；而與谷胱甘肽(GSH)生物合成途徑相關(guān)基因的突變，能破壞植物耐鹽性誘導(dǎo)。實時定量PCR證實，由SQR9產(chǎn)生的精胺可導(dǎo)致谷氨酰胺合成酶和谷胱甘肽還原酶基因表達(dá)增加，從而導(dǎo)致谷胱甘肽水平升高，這對清除活性氧物質(zhì)至關(guān)重要。由SQR9衍生的精胺也上調(diào)了和的表達(dá)，后者將Na+隔離到液泡中，并將Na+從細(xì)胞中排出，從而降低離子毒性?？梢?，亞精胺有助于誘導(dǎo)植物產(chǎn)生耐鹽性，其原因是它能提高谷胱甘肽(GSH)水平，產(chǎn)生一系列連鎖反應(yīng)，并提高相關(guān)基因表達(dá)，最后使植物產(chǎn)生耐鹽性。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組研究，解淀粉芽孢桿菌某一功能發(fā)揮作用是多種基因上調(diào)和下調(diào)聯(lián)合效應(yīng)引起的。由此推斷，解淀粉芽孢桿菌某種生理功能呈現(xiàn)是多基因共同協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，通過轉(zhuǎn)錄組變化研究解淀粉芽孢桿菌–植物–病原菌之間作用是一條有效途徑。

3　解淀粉芽孢桿菌基因洗牌與功能變化的比較蛋白組學(xué)分析

基因組洗牌是基因組工程的重要手段，比較蛋白組學(xué)分析運(yùn)用于解淀粉芽孢桿菌基因洗牌菌株功能變化的研究是當(dāng)前的一個熱點。ZHAO等[51]運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析了檢測親本菌株和基因組洗牌菌株FMB38蛋白表達(dá)情況，通過二維電泳和質(zhì)譜分析了蛋白質(zhì)組。通過凝膠成像，檢測到解淀粉芽孢桿菌基因洗牌菌株FMB38有51個差異表達(dá)蛋白點，具有2倍高光斑密度；通過銀染和進(jìn)一步質(zhì)譜分析，檢測到另外的46個蛋白質(zhì)點。結(jié)果說明，在基因組洗牌突變子中，引起特別表達(dá)的46個蛋白質(zhì)點中有15個與代謝相關(guān)，5個與DNA復(fù)制、重組和修復(fù)有關(guān)，6個與轉(zhuǎn)錄和后轉(zhuǎn)錄修飾有關(guān)，1個與細(xì)胞分泌和信號傳導(dǎo)機(jī)制有關(guān)，3個與表面活性素合成相關(guān)，2個與能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換相關(guān)，14個與其他方面的功能相關(guān)。說明通過基因組洗牌，突變子代謝能力得到提高和改善。ZHAO等[52]利用基因重組技術(shù)提高了原菌株解淀粉芽孢桿菌ES–2–4的芬薺素產(chǎn)量。經(jīng)過兩輪基因組重組，獲得了1株高產(chǎn)重組FMB72菌株，產(chǎn)量增加了8.30倍；采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法，篩選出50個不同表達(dá)的斑點(<0.05)，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫，確定了44個蛋白斑點；在44種已鑒定的蛋白質(zhì)中，信號蛋白ComA 和 Spo0A可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控芬薺素的合成。可見，通過蛋白組學(xué)分析可以揭示解淀粉芽孢桿菌更多的功能及分子機(jī)制。

4　展望

結(jié)合解淀粉芽孢桿菌多組學(xué)分析研究進(jìn)展，分析歸納其功能分子機(jī)制，包括抗性形成、生物膜形成、定殖、促生、誘導(dǎo)植物耐鹽性等機(jī)制。隨著多組學(xué)研究深入，其重要功能機(jī)理將進(jìn)一步被闡明。但要看到，其生理功能不僅依賴于自身基因組，也受環(huán)境(生境)、相關(guān)植物病原菌影響。今后的研究需從兩方面入手：①研究其生理功能基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，明確功能機(jī)制復(fù)雜性，使用多組學(xué)聯(lián)合闡明其分子機(jī)理；②研究“解淀粉芽孢桿菌–植物宿主–植物病原菌”復(fù)雜關(guān)系，挖掘三者相互作用規(guī)律，全面闡明其生理功能的分子機(jī)制。

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Advances in application of multi-component analysis on the functional mechanism study of

WANG Shiwei1,2, WANG Qinghui3, ZHAI Liping1,2, LIU Jun1,2, YU Zhidan1,2, XIANG Wensheng3*

(1.College of Life Sciences and Agriculture and Forestry, Qiqihar University, Qiqihar, Heilongjiang 161005, China; 2.Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Preservation of Biodiversity in Cold Areas, Qiqihar, Heilongjiang 161005, China; 3.School of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030, China)

have beneficial biological characteristics and can produce many kinds of antimicrobial active substances. They own important physiological and biochemical functions, such as biofilm formation and colonization in plants, promoting plant growth and induction of salt tolerance in plants, etc. In this review, we summarized the molecular mechanisms study using multi-omics analysis progress ofin studying antimicrobial activity, colonization, growth promotion and salt tolerance induction of plants, with the aim of better application of.

; multi-omics analysis; identification; function; molecular mechanisms

S476；Q811.4

A

1007-1032(2020)04-0410-09

10.13331/j.cnki.jhau.2020.04.005

王世偉，王卿惠，翟麗萍，劉軍，于志丹，向文勝．多組學(xué)分析在解淀粉芽孢桿菌相關(guān)功能機(jī)制研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2020，46(4)：410–418．

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http://xb.hunau.edu.cn

2019–10–02

2019–11–28

黑龍江省教育廳基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)科研項目(No.135309482)

王世偉(1965—)，男，山東肥城人，博士，教授，主要從事微生物遺傳與發(fā)酵工程研究，wsw888535@shou.com；

，向文勝，博士，教授，主要從事酶反應(yīng)機(jī)制和代謝途徑的研究，xiagwensheng@yahoo.com.cn

責(zé)任編輯：毛友純

英文編輯：柳正