李磊 崔鶴蓉 王鵬龍

[摘要] 目的 研究藏藥普爾那不同部位不同提取物的體外抗耐藥菌和抗腫瘤活性。 方法 對藏藥普爾那莖和葉分別采用無水乙醇、乙酸乙酯進行成分提取。采用K-B紙片法、比濁法及平板劃線法，評價不同提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的抑菌活性。MTT法檢測不同提取物對人肝癌細胞系HepG2細胞、人宮頸癌細胞系HeLa細胞的抑制率。 結(jié)果 37℃培養(yǎng)18 h后，普爾那葉無水乙醇提取物（100.00 mg/mL）對MRSA（1×107 cfu/mL）抑制作用最強（5.00 mm），最低抑菌濃度（MIC）為1.25 mg/mL，最低殺菌濃度（MBC）為5 mg/mL。高濃度（500.00 μg/mL）普爾那葉乙酸乙酯提取物對人肝癌細胞系HepG2細胞、人宮頸癌細胞系HeLa細胞均表現(xiàn)出最佳的抑制活性。 結(jié)論 普爾那葉乙醇提取物對MRSA體外抑耐藥菌效果更佳，而普爾那葉乙酸乙酯提取物抗腫瘤活性更好。

[關(guān)鍵詞] 藏藥;普爾那;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;抗耐藥菌;抗腫瘤

[中圖分類號] R291.4 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）07（b）-0017-04

[Abstract] Objective To study on anti-drug resistant bacteria and antitumor activity of different parts from different parts of Tibetan medicine Artemisia vestita in vitro. Methods Stem and leaf of Artemisia vestita were extracted with absolute ethanol and ethyl acetate respectively. The antibacterial activity of different extracts on Methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） was evaluated by K-B paper method， turbidimetric method and flat line marking method. The MTT method was used to detect the inhibition rate of different extracts on human hepatoma cell line HepG2 cells and human cervical cancer cell line HeLa cells. Results After incubation at 37°C for 18 h， the Artemisia vestita leaf absolute ethanol extract （100.00 mg/mL） had the strongest inhibitory effect （5.00 mm） on MRSA （1×107 cfu/mL）， and the lowest inhibitory concentration （MIC） was 1.25 mg/mL， the minimum germicidal concentration （MBC） was 5 mg/mL. Highconcentration （500.00 μg/mL） Artemisia vestita leaf ethyl acetate extract showed the best inhibitory activity against human hepatoma cell line HepG2 cells and human cervical cancer cell line HeLa cells. Conclusion Artemisia vestita leaf ethanol extract has better anti-drug resistance to MRSA in vitro， while Artemisia vestita leaf ethyl acetate extract has better antitumor activity.

[Key words] Tibetan medicine; Artemisia vestita; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Anti-drug resistant bacteria; Antitumor

普爾那是菊科植物毛蓮蒿的地上部分，味苦、辛，性寒，具有清熱解毒、殺蟲、止血等功效[1-3]。普爾那中主要含有揮發(fā)油、香豆素、有機酸、黃酮、甾體類等多種成分[4-8]，具有抗寄生蟲[9-10]、抗炎[11-12]、抗腫瘤[13]、抑菌[14-16]等作用。細菌的耐藥問題及腫瘤的高發(fā)病率、高死亡率嚴重威脅人類健康[17-19]。本研究對藏藥普爾那莖和葉分別采用無水乙醇、乙酸乙酯進行成分提取，再對提取物進行體外抗耐藥菌及抗腫瘤活性研究，從而為促進藏藥開發(fā)及從天然產(chǎn)物中尋找抗耐藥菌、抗腫瘤的藥物提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠）;水浴鍋（DF-101SA，瑞力儀器設(shè)備源頭廠家）;十萬分之一天平（BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;生物安全柜，（BSC-1500ⅡA2-X，濟南圣科環(huán)?？萍加邢薰荆?恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LHS-250HC-11，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;壓力蒸汽滅菌器（MSG.N 180L，山東威高集團醫(yī)用高分子制品股份有限公司）;數(shù)控超聲波清洗器（KQ-100DE，昆山市超聲儀器有限公司）;酶標儀（FC，Labsystems）;半徑10 cm離心機（H-1600RW，西安超杰儀器設(shè)備有限公司）;倒置熒光顯微鏡（IX71，Olympus）;高壓蒸氣滅菌鍋（CLG-40M，ALP）。

1.2 試劑

所用藥材采于2013年西藏昌都地區(qū)的普爾那，由西藏自治區(qū)藥材鑒定專家嘎務(wù)副教授鑒定。無水乙醇（C0691510226，南京試劑有限公司）;乙酸乙酯（141-78-6，南京試劑有限公司）;氯化鈉（7647-14-5，南京試劑有限公司）;蒸餾水（7732-18-5，南京試劑有限公司）;瓊脂粉（DE0010，北京拜爾迪生物科技有限公司）;蛋白胨（PO0262D，北京拜爾迪生物科技有限公司）;酵母提取物（CM0019，北京拜爾迪生物科技有限公司）;氯化鈉（DE0008，北京拜爾迪生物科技有限公司）;磷酸鹽緩沖液（Corning，北京拜爾迪生物科技有限公司），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（M8560-250 g，Solarbio）;Gibco胎牛血清（FBS，北京拜爾迪生物科技有限公司）;DMEM培養(yǎng)液（SH30022.01B，黑龍江久豐生物工程有限公司）;二甲基亞砜（DMSO，北京化工廠）。

1.3 耐藥菌株與細胞

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）臨床分離株1902115號，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院檢驗科細菌室提供。人肝癌細胞系HepG2細胞、人宮頸癌細胞系HeLa細胞由中國科學(xué)院納米科研中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 普爾那不同部位待測樣品的制備

取普爾納的莖和葉的粉末加入80%乙醇進行超聲提取，再分別用乙酸乙酯、無水乙醇溶劑進行萃取，用含DMSO的溶液配制成相應(yīng)濃度的待測樣品。

2.2 菌種活化及菌懸液制備

取儲藏菌少許接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18～24 h使菌種活化。用無菌生理鹽水將MRSA菌液調(diào)整濃度為1×107、1×108 cfu/mL備用。

2.3 K-B紙片法

采用K-B紙片法分別測定不同濃度的普爾那莖或葉的無水乙醇提取物或乙酸乙酯提取物對MRSA抑菌環(huán)直徑。所有無菌操作均在生物安全柜中規(guī)范進行。DMSO對MRSA抑菌圈直徑為0 mm，無抑制作用。待測樣品濃度相同，MRSA菌液濃度越高，抑菌環(huán)直徑越小;MRSA菌液濃度相同，待測樣品濃度越高，抑菌環(huán)直徑越大。與其他待測樣品濃度比較，普爾那葉無水乙醇提取物（100 mg/mL）對MRSA菌液（1×107 cfu/mL）抑菌活性最強（5.00 mm）。見表1。

2.4 比濁法

采用試管稀釋法測定不同濃度普爾那葉無水乙醇提取物對MRSA的MIC值及MBC值。所有無菌操作均在生物安全柜中規(guī)范進行。普爾那葉無水乙醇提取物濃度為10.00、5.00 mg/mL時，肉眼觀察試管內(nèi)澄清，濃度為2.50 mg/mL時可見菌絲。濃度為1.25、0.63 mg/mL時渾濁。陰性對照組（空白培養(yǎng)基）澄清，陽性對照組（濃度為0.00 mg/mL）渾濁。隨著藥物濃度的增加，對MRSA菌液（1×107 cfu/mL）抑菌活性逐漸增強。見表2。

2.5 平板劃線法

采用平板劃線法測定不同濃度普爾那葉無水乙醇提取物對MRSA的MIC值及MBC值。所有無菌操作均在生物安全柜中規(guī)范進行。普爾那葉無水乙醇提取物濃度為10.00、5.00 mg/mL時，肉眼觀察培養(yǎng)基相應(yīng)區(qū)域內(nèi)無菌生長。普爾那葉無水乙醇提取物濃度為2.50、1.25 mg/mL時，可見少量菌生長。普爾那葉無水乙醇提取物濃度為0.63 mg/mL時明顯可見大量菌生長，陽性對照組明顯可見大量菌生長。結(jié)果顯示，普爾那葉無水乙醇提取物對MRSA菌液（1×107 cfu/mL）的MIC值為1.25 mg/mL，MBC值為5.00 mg/mL。見圖1。

2.6 細胞株的培養(yǎng)及鋪板

將人肝癌細胞系HepG2細胞、人宮頸癌細胞系HeLa細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清，1%雙抗DMEM的細胞培養(yǎng)液中，放置于37°C培養(yǎng)箱備用。計算出所需數(shù)量的細胞液，加入新鮮培養(yǎng)液稀釋，3×103/孔的細胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中，將細胞培養(yǎng)板放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.7 配藥及給藥

分別稱取普爾那莖的待測樣品，加入適量的DMSO配制成10 mg/mL的儲備液。取出鋪有細胞的96孔板，給藥組每孔加入100 μL不同濃度的待測樣品液，細胞對照組和空白對照組分別加入100 μL新鮮培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

2.8 MTT法

待給藥細胞培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT溶液，將細胞放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后取出，加入150 μL/孔DMSO，用酶標儀測定490 nm下OD值，根據(jù)以下公式計算抑制率（%）。抑制率（%）=[1-（OD給藥組-OD空白組）/（OD正常組-OD空白組）]×100%。高濃度普爾那葉-酯部位對人肝癌細胞系HepG2細胞表現(xiàn)出最佳的抑制活性（21.70±0.86）%;高濃度普爾那葉-酯部位對人宮頸癌細胞系HeLa細胞表現(xiàn)出最佳的抑制活性（41.90±0.18）%。見表3。

4 討論

《藍琉璃》記載了普爾那具有抗菌解毒、治腫塊及瘡瘍的功效[2]。Yin等[12]發(fā)現(xiàn)普爾那中香豆素具有抗耐藥菌的作用;許涼涼[16]發(fā)現(xiàn)普爾那中揮發(fā)油具有抗菌抗炎的活性;Sun等[13]發(fā)現(xiàn)普爾那中提取的高車前素具有抑制血管再生及胰腺腫瘤的作用;還有研究發(fā)現(xiàn)普爾那中提取的冬凌草素為抗腫瘤物質(zhì)[20]。然而，目前關(guān)于普爾那抗菌及抗腫瘤的研究報道仍較少。本研究選取MRSA、人肝癌細胞系HepG2細胞、人宮頸癌細胞系HeLa細胞作為研究對象，比較普爾那不同部位的不同提取物的抗耐藥菌及抗腫瘤活性。結(jié)果顯示，普爾那葉的無水乙醇提取物抗菌活性更好，普爾那葉的乙酸乙酯提取物抗腫瘤作用較好，與傳統(tǒng)普爾那的功效及現(xiàn)代藥理研究結(jié)果相一致。對于普爾那葉無水乙醇提取物及乙酸乙酯提取物中活性成分的分離鑒定及分子機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2019-12-24）