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        氣相串接質(zhì)譜聯(lián)用法確證人尿中44種外源性蛋白同化類激素

        2020-08-27 08:42:08景晶王杉劉欣楊聲鄧靜張玉梅楊志勇張力思張亦農(nóng)
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)方法

        景晶 王杉 劉欣 楊聲 鄧靜 張玉梅 楊志勇 張力思 張亦農(nóng)

        國(guó)家體育總局反興奮劑中心(北京100029)

        蛋白同化類固醇(anabolic androsgenic steroids)是一類能夠促進(jìn)肌肉和力量增長(zhǎng),加快訓(xùn)練后恢復(fù)的激素,因此常常被運(yùn)動(dòng)員使用來(lái)提高競(jìng)技能力,但長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)運(yùn)動(dòng)員的身體造成傷害[1-3],并且是對(duì)體育競(jìng)賽的公平公正原則的極大挑釁,1974 年國(guó)際奧委會(huì)規(guī)定體育運(yùn)動(dòng)中禁止使用該類物質(zhì)[4]。

        上世紀(jì)60 至70 年代采用放射免疫方法檢測(cè)該類物質(zhì)[5],這種方法因?yàn)樘禺愋圆?、適用范圍局限等原因很快就被氣相質(zhì)譜法取代[5-6]。目前,世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(World Anti-Doping Agency,WADA)對(duì)于蛋白同化激素檢出能力的要求(Minimum Required Perfor?mance Levels,MRPL)一般在2~5 ng/ml,對(duì)檢測(cè)能力提出了更高的要求。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,相對(duì)于單極質(zhì)譜而言,氣相串接質(zhì)譜具有去干擾能力更強(qiáng)、靈敏度更高等優(yōu)點(diǎn),可以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、科學(xué)性。目前,WADA 認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室普遍采用氣相串接質(zhì)譜進(jìn)行外源性蛋白同化類激素的初篩和確證[7]。

        與初篩目的不同,WADA在技術(shù)文件TD2015IDCR[8]中規(guī)定了確證方法需要滿足相對(duì)保留時(shí)間和離子豐度比的要求,對(duì)確證方法提出了更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊?。盡管如此,WADA 并沒(méi)有頒布統(tǒng)一的關(guān)于確證方法驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)。因此,本研究結(jié)合興奮劑檢測(cè)實(shí)際需求,建立一種適應(yīng)常規(guī)檢測(cè)、符合技術(shù)文件TD2015IDCR 要求的外源性蛋白同化類激素的確證方法。該方法涵蓋WA?DA歷年陽(yáng)性檢出率較高、WADA要求實(shí)驗(yàn)室必須檢測(cè)出(符合技術(shù)要求)的44種外源性蛋白同化類激素,能更好地為興奮劑檢測(cè)工作提供科學(xué)、準(zhǔn)確的保障。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與設(shè)備

        氣相串接質(zhì)譜(GC-MS/MS):7693/7010Agilent Te?chonlogies;電熱恒溫水浴箱:HW1,北京醫(yī)療設(shè)備廠;離心機(jī),Thermo fisher 公司;Vortex-2 渦旋混勻器:Sci?entific Industries 公司;氮吹儀:北京洼里醫(yī)療機(jī)械廠;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;冷凍機(jī),Xutemp公司;10 mL螺紋試管:Corning公司。

        1.2 材料與試劑

        44 種外源性蛋白同化類激素對(duì)照品溶液:澳大利亞計(jì)量院(NMI);甲睪酮對(duì)照品:美國(guó)Sigma公司;氘代內(nèi)標(biāo)d4-雄酮-葡萄糖醛酸和d5-本膽烷醇酮(d4-An?drosterone-glucuronid acid,d5-Etiocholanlone)對(duì)照品:澳大利亞計(jì)量院(NMI);β-葡萄糖醛酸苷酶E. Coli IXA 型:美國(guó)Sigma 公司;叔丁基甲醚:美國(guó)Dikma 公司;N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA):美國(guó)Sigma 公司;碘化銨(NH4I):北京J&Kchemical 公司;乙硫醇(Ethanethiol)美國(guó)Sigma 公司;0.2M 磷酸鹽緩沖液、20%碳酸鈉:碳酸氫鈉(1∶1)緩沖液等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        2 實(shí)驗(yàn)步驟

        2.1 試劑與材料的制備

        混合對(duì)照品工作液:將已稀釋成100 ng·μL-1的對(duì)照品工作液從保干器中取出,用移液器分別量取44種對(duì)照品工作液(100 ng·μL-1)20 μL至10 mL螺紋試管中,55℃下氮?dú)庀麓蹈?。加入甲醇定容? mL加蓋混勻,配制成混合對(duì)照品工作液。

        內(nèi)標(biāo)溶液:取出安瓿瓶恢復(fù)至室溫,加入200 μL甲醇,分3次轉(zhuǎn)移至1.5 mL螺口小瓶中,置于55℃下氮?dú)庀麓蹈?。用移液器加?56 μL(說(shuō)明書(shū)中質(zhì)量為0.956 mg)甲醇定容后密封混勻,配制成濃度為1 mg·mL-1的d4-雄酮-葡萄糖醛酸對(duì)照品母液。如上所述分別配制濃度為1 mg·mL-1的d5-本膽烷醇酮和甲基睪酮對(duì)照品母液。

        用移液器分別量取上述母液64、40、20 μL 至10 mL 螺紋試管,加入甲醇定容至5 mL,混勻密封置于4℃冰箱保存。根據(jù)尿樣中內(nèi)標(biāo)d4-雄酮-葡萄糖醛酸/d5-本膽烷醇酮(結(jié)合/游離)判斷樣品酶解效率,確保葡萄糖結(jié)合型代謝產(chǎn)物酶解效果。

        0.2 M 磷酸鹽緩沖液:稱取108 g 磷酸二氫鉀和240 g 十二水合磷酸氫二鈉,加入4000 mL 純水,振搖至完全溶解,pH在6.0~7.0之間。

        β-葡萄糖醛酸苷酶工作液:取適量β-葡萄糖醛酸苷酶凍干粉,倒入50 ml 離心管,然后加入0.2M磷酸緩沖液配制成濃度為50 units/μl的工作液,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        20%碳酸鈉∶碳酸氫鈉(1∶1)緩沖液:分別稱取碳酸鈉和碳酸氫鈉各500 g,加入4000 mL 純水,振搖至完全溶解,pH為9.0~10.0之間。

        衍生化試劑:取適量MSTFA、NH4I 和Ethanethiol,配制成1000∶2∶6(w∶w∶v)的衍生化試劑。

        2.2 樣品前處理

        所有受試尿樣放置室溫下,取2 mL 尿樣置于10 mL 螺紋試管中,加入1 mL 磷酸鹽緩沖液和50 μl β-葡萄糖醛酸苷酶工作液,渦旋器混勻,置于55℃恒溫水浴中酶解2小時(shí),取出?;謴?fù)至室溫后加入20%碳酸鈉︰碳酸氫鈉(1︰1)緩沖液500 μl,然后加入4 mL叔丁基甲醚,加蓋渦旋器混勻。將試管放入離心機(jī)3000 rpm/min離心3分鐘,取出試管置于-30℃冰浴中,充分冷凍后取上清液至潔凈試管中,置于55℃下氮?dú)庀麓蹈?。加?0 μl 衍生化試劑,渦旋器混勻,用移液器轉(zhuǎn)移至已在70℃電熱干燥箱中干燥1小時(shí)的1.5 mL的進(jìn)樣小瓶中。加蓋密封,于70 ℃下反應(yīng)30 分鐘后進(jìn)樣分析。

        2.3 色譜質(zhì)譜條件

        色譜柱:HP-1 毛細(xì)管色譜柱(25 m×0.2 mm i.d.×0.11 μm);載氣:氦氣,進(jìn)樣口溫度:280℃;接口溫度:300℃;采用恒壓模式,柱壓20 psi;分流比:10∶1;進(jìn)樣量2 μl;升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?77℃,以3℃/min 速率升至245℃,然后以17℃/min 的速率升至320℃,保持2.5 min。

        質(zhì)譜離子源為EI 源,源溫度為230℃,電子能量70 eV,采集模式為MRM。各化合物硅烷化衍生物的檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 特異性和選擇性

        選擇10份男女性別各半、比重分布在1.001~1.035之間、pH分布在5.5~9之間、不同色澤與渾濁度的空白尿樣2mL,按照2.2的前處理方法進(jìn)行處理,然后用2.3所述方法檢測(cè),確認(rèn)10份尿樣中在目標(biāo)化合物出峰處無(wú)明顯干擾,說(shuō)明該方法選擇性良好。在這些尿樣中添加WADA要求的MRPL濃度下44種目標(biāo)化和物。按照2.2 和2.3 所述方法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10 份樣品中目標(biāo)化合物的相對(duì)保留時(shí)間和離子豐度比均符合TD2015IDCR的要求,說(shuō)明在MRPL濃度下該方法特異性良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

        表1 44種外源性蛋白同化激素的MRM參數(shù)

        (續(xù)表1)

        (續(xù)表1)

        3.2 提取回收率

        本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在高(5倍MRPL)、中(MRPL)和低(1/2倍MRPL)三種濃度下進(jìn)行。按照3.1所述原則選擇10份空白尿樣,每個(gè)濃度平行取2 份尿樣,1 份在前處理之前加入上述3個(gè)濃度的待測(cè)目標(biāo)化合物(峰面積用A表示),在萃取液中添加內(nèi)標(biāo);1份在前處理之后的萃取液中加入上述3 個(gè)濃度的目標(biāo)化合物(峰面積用B 表示)和內(nèi)標(biāo);按照2.2 和2.3 所述方法進(jìn)行檢測(cè)。2 份樣品的相對(duì)峰面積之比,即為回收率。按照下述公式進(jìn)行計(jì)算:

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,44 種外源性蛋白同化激素的提取回收率較好,能夠滿足常規(guī)檢測(cè)的需要。

        3.3 基質(zhì)效應(yīng)

        按照3.1 所述原則選擇10 份空白尿樣,按照2.2 所述方法進(jìn)行前處理,在獲得提取液中加入MRPL 水平濃度的待測(cè)物質(zhì),吹干,衍生化上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)得到峰面積A。另外,在上述方法衍生化步驟之前加入上述濃度的目標(biāo)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo),吹干,衍生化,上機(jī)檢測(cè)得到峰面積B?;|(zhì)效應(yīng)可用下述公式計(jì)算:

        基質(zhì)效應(yīng)=[ peak area(A)/ ISTD(A)] / [peak area(B)/ ISTD(B)]

        從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,尿樣基質(zhì)不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成顯著影響。

        3.4 穩(wěn)定性

        按照3.1 所述原則選擇10 份空白尿樣,在這些尿樣中添加MRPL 濃度的44 種目標(biāo)化合物。按照2.2 和2.3所述方法進(jìn)行檢測(cè),10份樣品中目標(biāo)化合物的相對(duì)保留時(shí)間和離子豐度比均符合TD2015IDCR 的要求,分析完成后將小瓶重新密封置于-20℃冰柜保存,7天后再次檢測(cè),目標(biāo)化合物能檢出并且符合2015IDCR的要求,說(shuō)明樣品衍生化后在-20℃條件下密封保存,7天內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        3.5 攜帶污染

        攜帶污染主要是體現(xiàn)樣品之間的污染程度,對(duì)定量物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生較大影響,一般要求攜帶污染的信號(hào)強(qiáng)度應(yīng)低于最低定量限的20%。

        取本方法驗(yàn)證中添加5 倍MRPL 濃度目標(biāo)化合物的樣品,同一序列中隨行1個(gè)空白尿樣作為陰性質(zhì)控,未發(fā)現(xiàn)攜帶污染。

        4 結(jié)論

        采用氣相色譜串接質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了一種檢測(cè)人尿中44 種外源性蛋白同化類激素的檢測(cè)方法。經(jīng)過(guò)方法驗(yàn)證,篩選出特異性和選擇性良好的檢測(cè)參數(shù),能有效降低基質(zhì)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的影響,穩(wěn)定性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法可檢測(cè)人尿中44 種外源性蛋白同化類激素。

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