徐海云，王帥帥#，譚成杰，胡菊芳，陳小軍*

鉤吻醇提物對(duì)兔離體腸肌的舒張作用及其機(jī)制

徐海云1,2，王帥帥1,2#，譚成杰1,2，胡菊芳1，陳小軍1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省獸藥工程中心，湖南 長(zhǎng)沙 410311)

采用BL–420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，觀察鉤吻醇提物對(duì)兔離體腸肌自主收縮及對(duì)工具藥乙酰膽堿(Ach)、BaCl2和組胺(HA)所致痙攣性收縮的影響，并探討肌漿網(wǎng)Ryanodine受體阻斷劑釕紅(RR)、三磷酸肌醇(IP3)受體阻斷劑肝素鈉(HP)和一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯(L–NAME)對(duì)鉤吻醇提物作用的影響。結(jié)果表明：終質(zhì)量濃度0.16~0.64 mg/mL鉤吻醇提物可劑量依賴性抑制離體腸肌自主收縮頻率和張力；終質(zhì)量濃度0.32 mg/mL鉤吻醇提物對(duì)BaCl2、HA誘導(dǎo)的離體腸肌收縮頻率和張力具有顯著抑制作用(＜0.05)，對(duì)Ach誘導(dǎo)的離體腸肌的收縮頻率具有顯著抑制作用(＜0.05)，對(duì)張力有極顯著抑制作用(＜0.01)；RR、HP和L–NAME對(duì)經(jīng)鉤吻醇提物預(yù)處理的離體腸肌的收縮頻率和張力分別表現(xiàn)為無(wú)影響、顯著增強(qiáng)和顯著拮抗(<0.05)。

兔；離體腸??；鉤吻醇提物；舒張作用；工具藥；阻斷劑；抑制劑

鉤吻(Benth)又名胡蔓藤、大茶藥、斷腸草等。據(jù)其產(chǎn)地可分為2類：一類是美洲鉤吻，主產(chǎn)地在美洲；另一類主產(chǎn)地在亞洲，如中國(guó)的浙江、福建、廣東、廣西、湖南、貴州、云南等地[1]。適當(dāng)劑量的鉤吻對(duì)牛、豬、羊等有增肥作用，廣東、廣西、福建等地常將鉤吻稱為豬人參，伴飼以促進(jìn)豬生長(zhǎng)[2]。本課題組在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將一定劑量的鉤吻醇提物(GEBEE)添加到飼料中，可有效防治仔豬腹瀉。

腹瀉與各種原因?qū)е碌奈改c蠕動(dòng)過(guò)快和胃腸內(nèi)液體過(guò)多密切相關(guān)。平滑肌收縮依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，而細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度取決于內(nèi)鈣釋放和外鈣流入，外鈣流入需鈣通道的開(kāi)放。BaCl2是非受體作用的有毒化合物，是臨床藥理試驗(yàn)中常用作研究胃腸運(yùn)動(dòng)的工具藥，可直接刺激胃腸黏膜促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+釋放而誘導(dǎo)胃腸平滑肌收縮[3]；乙酰膽堿(Ach)作為神經(jīng)遞質(zhì)，能激動(dòng)平滑肌上的M受體，M受體耦聯(lián)G蛋白，促進(jìn)肌漿網(wǎng)內(nèi)第二信使三磷酸肌醇(IP3)和二?；视退缴?，進(jìn)而引起Ca2+釋放和底物蛋白磷酸化，激發(fā)平滑肌產(chǎn)生收縮效應(yīng)[4]；組胺(HA)作用于腸平滑肌上的H1受體，打開(kāi)細(xì)胞膜上的Na+–K+–Ca2+通道，使細(xì)胞膜去極化，從而使電壓依賴性鈣通道開(kāi)放，Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高而引起腸肌收縮[5–6]。

鉤吻抗腹瀉作用是否與抑制胃腸蠕動(dòng)有關(guān)，尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究中，利用BL–420E生物機(jī)能系統(tǒng)觀察鉤吻醇提物對(duì)兔離體腸肌運(yùn)動(dòng)的影響，并利用相關(guān)工具藥研究鉤吻醇提物對(duì)兔離體腸肌運(yùn)動(dòng)調(diào)控的機(jī)制，以期為更好地開(kāi)發(fā)鉤吻提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

同批次健康家兔30只(雌雄各半)，體質(zhì)量為2.5~3.0 kg，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)生物科技有限公司。

1.1.2主要供試藥品

鉤吻醇提物由湖南泰谷生物科技股份有限公司提供，其總生物堿含量為6.44%。工具藥：乙酰膽堿(Ach，批號(hào)為D17O8B46022)和組胺(HA，批號(hào)為Y14J8J39911)為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；氯化鋇(BaCl2，批號(hào)為20170823)為上海山蒲化工有限公司產(chǎn)品；釕紅(RR，批號(hào)為170720)為上海如吉生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；左旋硝基精氨酸甲酯(L–NAME，批號(hào)為20171032)和肝素鈉(HP，批號(hào)為704D023)為北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3主要試劑及儀器

臺(tái)式液中NaCl、CaCl2、KCl、MgCl2、NaHCO3、KH2PO4、葡萄糖的質(zhì)量濃度分別為8.0、0.2、0.2、0.1、1.0、0.05、1.0 g/L。BL–420E生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)為成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品；JH–2型張力傳感器為中國(guó)北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所產(chǎn)品；水浴恒溫振蕩器為江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1兔離體腸肌的制備

將家兔禁食不禁水24 h后，猛擊兔頭枕部處死，用剪刀快速打開(kāi)腹腔，取出十二指腸，置于裝有4 ℃臺(tái)氏液的玻璃培養(yǎng)皿中，輕輕洗凈腸內(nèi)容物，并沿腸壁剝離腸系膜，將其剪成2~3 cm的腸段，備用。

1.2.2腸肌收縮活動(dòng)的記錄

根據(jù)BL–420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)操作說(shuō)明書(shū)，并參照王慧等[7]的方法進(jìn)行操作，待腸肌收縮穩(wěn)定后，開(kāi)始試驗(yàn)。

1.2.3鉤吻醇提物對(duì)兔離體腸肌收縮影響的測(cè)定

除GEBEE用0.2%乙醇溶解外，其余試劑均以臺(tái)氏液溶解。待腸管收縮穩(wěn)定后，分別先后加入臺(tái)氏液和0.2%乙醇作為正常對(duì)照組(CK)和溶劑對(duì)照組(CK1)。然后用微量加樣器往藥槽加入GEBEE，每次0.05 mL，加藥間隔時(shí)間為5 min，累計(jì)加入終質(zhì)量濃度分別為0.16、0.32、0.48、0.64 mg/mL(分別記為T(mén)1、T2、T3、T4組)。每組5個(gè)重復(fù)。記錄腸肌的收縮頻率和平均張力，并參照王慧等[7]的方法計(jì)算抑制率，結(jié)果采用張力百分比和頻率百分比表示。

1.2.4鉤吻醇提物對(duì)BaCl2、Ach、HA致腸肌痙攣性收縮影響的測(cè)定

將兔離體腸隨機(jī)分為3組：BaCl2+GEBEE、Ach+GEBEE、HA+GEBEE。每組5個(gè)重復(fù)。分別記錄腸肌的正常收縮頻率和張力作為給藥前對(duì)照，然后3組分別加入終質(zhì)量濃度12 μg/mL BaCl2、1 μg/mL Ach、4 μg/mL HA，當(dāng)腸肌收縮穩(wěn)定后，記錄腸肌的收縮頻率和平均張力，再加入0.32 mg/mL GEBEE，記錄腸肌的收縮頻率和平均張力，并計(jì)算張力百分比和頻率百分比。

1.2.5RR、HP和L–NAME對(duì)鉤吻醇提物抑制離體腸肌影響的測(cè)定

將離體腸肌隨機(jī)分為3組：GEBEE+RR、GEBEE+HP、GEBEE+L–NAME。每組5個(gè)重復(fù)。待腸肌收縮穩(wěn)定，分別記錄腸肌的正常收縮頻率和張力作為給藥前對(duì)照，隨后3組均加入0.32 mg/mL GEBEE，待腸肌收縮穩(wěn)定后記錄腸肌的收縮頻率和張力，再分別加入10 μmol/L RR、50 mg/L HP、100 μmol/L L–NAME作用10 min，記錄腸肌的收縮頻率和平均張力，并計(jì)算張力百分比和頻率百分比。

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析中的LSD法比較組間差異。

2　結(jié)果與分析

2.1　溶劑和鉤吻醇提物對(duì)兔離體腸肌運(yùn)動(dòng)的影響

由圖1可知，溶劑對(duì)照組離體腸肌的收縮頻率和張力與正常對(duì)照組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明用0.2%乙醇溶解GEBEE對(duì)后續(xù)的試驗(yàn)無(wú)影響。與CK相比，0.16 mg/mL GEBEE顯著抑制腸肌張力(＜0.05)，0.32~0.64 mg/mL GEBEE極顯著抑制腸肌張力(＜0.01)；0.16~0.48 mg/mL GEBEE顯著抑制腸肌收縮頻率(＜0.05)，0.64 mg/mL GEBEE極顯著抑制收縮頻率(＜0.01)。

與CK相比，“*”和“**”分別示P＜0.05和P＜0.01。

2.2　鉤吻醇提物對(duì)BaCl2和Ach與HA致腸肌痙攣性收縮的影響

由圖2可知，與CK相比，12 μg/mL BaCl2可顯著增強(qiáng)腸肌收縮頻率和張力(＜0.05)，加入0.32 mg/mLGEBEE對(duì)BaCl2誘導(dǎo)的腸平滑肌收縮頻率和張力具有顯著抑制作用(＜0.05)；1 μg/mL Ach可極顯著增加離體腸肌的收縮張力(＜0.01)，顯著增加收縮頻率(＜0.05)，加入0.32 mg/mLGEBEE對(duì)Ach誘導(dǎo)的離體腸肌的收縮頻率具有顯著抑制作用(＜0.05)，對(duì)張力有極顯著抑制作用(＜0.01)；4 μg/mL HA可顯著增強(qiáng)離體腸肌的收縮張力(＜0.05)，對(duì)收縮頻率無(wú)顯著影響(＞0.05)；加入0.32 mg/mLGEBEE對(duì)HA誘導(dǎo)的離體腸肌的收縮張力及頻率具有顯著抑制作用(＜0.05)。

2.3　RR和HP與L–NAME對(duì)鉤吻醇提物抑制兔離體腸肌收縮的影響

由圖3、圖4和圖5可知，0.32 mg/mL GEBEE對(duì)離體腸肌的收縮頻率及張力具有顯著抑制作用(＜0.05)；10 μmol/L RR對(duì)鉤吻醇提物抑制小腸平滑肌收縮張力及頻率無(wú)顯著影響(＞0.05)；50 mg/L HP能顯著增強(qiáng)鉤吻醇提物對(duì)腸肌張力的抑制作用(＜0.05)，對(duì)抑制腸肌收縮頻率無(wú)顯著性影響(>0.05)；100 μmol/L L–NAME能顯著拮抗鉤吻醇提物對(duì)腸肌張力和頻率的抑制作用(<0.05)。

GEBEE與CK相比，“*”示P＜0.05。

GEBEE與CK相比，“*”示P＜0.05；GEBEE+HP與GEBEE相比，“#”示P＜0.05。

Fig 4The percent rate of the tension and frequency of isolated rabbit intestinal muscles induced by GEBEE after adding HP

GEBEE與CK相比，“*”和“**”分別示P＜0.05和P＜0.01；GEBEE+L–NAME與GEBEE相比，“#”示P＜0.05。

Fig 5The percent rate of the tension and frequency of isolated rabbit intestinal muscles induced by GEBEE after adding L-NAME

3　結(jié)論與討論

胃腸平滑肌攣縮可致腹痛腹瀉。本研究中，終質(zhì)量濃度0.16~0.64 mg/mL鉤吻醇提物對(duì)兔離體腸肌自發(fā)性收縮張力與頻率有明顯劑量依賴性抑制效應(yīng)，可能是臨床上鉤吻有效防治仔豬腹瀉的原因之一。鉤吻具有抗炎[8]、增強(qiáng)免疫[9]、改善腸道形態(tài)、調(diào)整盲腸菌群[10]等作用，防治腹瀉可能是鉤吻多種藥理作用的綜合發(fā)揮。本研究結(jié)果表明，鉤吻醇提物可拮抗BaCl2、Ach和HA所致腸肌痙攣性收縮作用，推測(cè)鉤吻醇提物對(duì)腸肌的舒張作用可能與阻斷M受體和H1受體有關(guān)，具有鈣通道阻滯作用，能抑制胞外Ca2+內(nèi)流，亦可抑制胞內(nèi)Ca2+釋放。

本研究中，相同濃度鉤吻醇提物處理的不同腸肌，其收縮張力和頻率具有一定的差異，這可能是由于不同離體腸段試驗(yàn)時(shí)離體時(shí)長(zhǎng)差異所致，這與王慧等[7]、羅學(xué)婭等[11]的研究結(jié)果一致。胞內(nèi)Ca2+的釋放是通過(guò)肌漿網(wǎng)內(nèi)IP3受體和Ryanodine受體完成[12]，為進(jìn)一步研究鉤吻醇提物對(duì)內(nèi)鈣釋放的影響，觀察了IP3受體阻斷劑HP和Ryanodine受體阻斷劑RR對(duì)鉤吻醇提物預(yù)處理腸肌后的影響。結(jié)果顯示，IP3受體阻斷劑HP可顯著增強(qiáng)鉤吻醇提物對(duì)離體腸肌張力的抑制作用(＜0.05)；Ryanodine受體阻斷劑RR對(duì)鉤吻醇提物舒張離體腸肌的作用無(wú)明顯影響(＞0.05)。由此推斷，鉤吻醇提物可能介導(dǎo)了IP3受體途徑，抑制了胞內(nèi)Ca2+的釋放，但與Ryanodine受體途徑所引起的胞內(nèi)Ca2+釋放無(wú)關(guān)。據(jù)報(bào)道，神經(jīng)遞質(zhì)NO通過(guò)激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使胞質(zhì)內(nèi)cGMP濃度增高，Ca2+濃度下降，誘導(dǎo)胃腸平滑肌舒張[13]。NO合酶抑制劑L–NAME可以降低組織中NO濃度[14]。本研究結(jié)果表明，L–NAME可顯著拮抗鉤吻醇提物舒張平滑肌的作用(＜0.05)，表明鉤吻醇提物對(duì)腸平滑肌的抑制作用可能與NO途徑有關(guān)，但對(duì)其下游的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶有無(wú)影響尚需進(jìn)一步研究。

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Relaxed effect ofBenth extraction by ethanol on intestinal smooth muscle of rabbit in vitro and its mechanism

XU Haiyun1,2，WANG Shuaishuai1,2#, TAN Chengjie1,2, HU Jufang1, CHEN Xiaojun1,2*

(1.College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Engineering Research Center of Veterinary Drugs of Hunan Province, Changsha, Hunan 410311, China)

In this experiment, the BL-420E biological function experiment system was used to investigate the effect ofBenth extraction by ethanol(GEBEE) on the independent contraction of isolated intestinal muscles in rabbits and the spasmodic contraction induced by Ach, BaCl2and HA, and to explore the effect of sarcoplasmic reticulum Ryanodine receptor blocker RR, IP3receptor blocker HP and nitric oxide synthase inhibitor L-NAME on GEBEE. The results showed that 0.16-0.64 mg/mL of GEBEE could inhibit the voluntary contraction frequency and tension of isolated rabbit intestinal muscles in a dose-dependent manner. The 0.32 mg/mL of GEBEE significantly inhibited the contraction frequency and tension of isolated rabbit intestinal muscles induced by BaCl2and HA(<0.05) and the contraction frequency of isolated rabbit intestinal muscles induced by Ach(<0.05), while highly significantly inhibited the contraction tension of isolated rabbit intestinal muscles induced by Ach(<0.01). For the contraction frequency and tension of isolated rabbit intestinal muscles pretreated with GEBEE, RR, HP and L-NAME showed no effect, significant enhancement and significant antagonism(<0.05), respectively.

rabbit; intestinal smooth muscle;Benth extraction by ethanol; relaxed effect; tool medicine; blocker; inhibitor

S816.7；S859.79+7

A

1007-1032(2020)04-0461-05

10.13331/j.cnki.jhau.2020.04.013

徐海云，王帥帥，譚成杰，胡菊芳，陳小軍．鉤吻醇提物對(duì)兔離體腸肌的舒張作用及其機(jī)制[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(4)：461–465．

XU H Y，WANG S S, TAN C J, HU J F, CHEN X J. Relaxed effect ofBenth extraction by ethanol on intestinal smooth muscle of rabbit in vitro and its mechanism[J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences), 2020, 46(4): 461–465.

http://xb.hunau.edu.cn

2019–05–21

2019–09–02

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)(2017YFD0501403)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572563)

徐海云(1995—)，女，新疆阿克蘇人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究，2762615882@qq.com；

#并列第一作者，王帥帥(1994—)，男，山東濱州人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究，m15165558513@163.com；

，陳小軍，副教授，主要從事植物功能成分藥理研究，xj92e2@163.com

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正