段海明，李可文

解淀粉芽孢桿菌SJ06脂肽粗提物與吡唑醚菌酯協(xié)同對(duì)玉米小斑病菌的抑制效果

段海明，李可文

(安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

運(yùn)用對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定解淀粉芽孢桿菌SJ06菌株對(duì)玉米小斑病菌的拮抗活性；采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定發(fā)酵上清液、脂肽粗提物對(duì)玉米小斑病菌的抑菌活性，以及SJ06脂肽粗提物與吡唑醚菌酯復(fù)配的協(xié)同抑菌活性。結(jié)果表明：對(duì)峙培養(yǎng)SJ06對(duì)玉米小斑病菌的抑制率為71.43%；SJ06發(fā)酵上清液和脂肽粗提物對(duì)病菌的50值分別為0.88 μL/mL和0.23 μL/mL，吡唑醚菌酯對(duì)病菌的50值為1.10 μg/mL；SJ06脂肽粗提物與吡唑醚菌酯復(fù)配對(duì)玉米小斑病菌的毒性比均大于1，說明復(fù)配對(duì)病菌的抑制效果均為增效作用，其中，復(fù)配體積比為4∶6時(shí)毒性比為1.21，增效作用最強(qiáng)。

解淀粉芽孢桿菌；玉米小斑??；脂肽粗提物；吡唑醚菌酯；協(xié)同作用

玉米小斑病主要為害玉米葉片，影響玉米光合作用，一般年份可造成20%以上的產(chǎn)量損失[1]。玉米小斑病的防治主要包括利用抗病品種、化學(xué)防治和生物防治3種方式。由于玉米小斑病菌生理小種多變，常導(dǎo)致抗病品種抗性喪失，高抗玉米小斑病品種的推廣力度較小，玉米小斑病發(fā)生流行風(fēng)險(xiǎn)依然較大[2–4]。玉米小斑病的化學(xué)防治相關(guān)研究以麥角甾醇生物合成抑制劑、二甲酰亞胺類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑及其復(fù)配劑報(bào)道[5–8]較多。運(yùn)用哈茨木霉SH2303、青霉TS67和芽孢桿菌等生物防治手段能夠較好地防治玉米小斑病，但防效和穩(wěn)定性尚需提升[9–11]。葉云峰等[12]分離到1株番茄內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌()B47，能產(chǎn)生對(duì)多種植物病原菌有抑制作用的環(huán)肽類物質(zhì)，該抗菌物質(zhì)用量0.3 g/L時(shí)對(duì)玉米小斑病的田間防治效果為53.05%。鹿秀云等[13]通過平板對(duì)峙、溫室盆栽試驗(yàn)和田間小區(qū)試驗(yàn)，篩選到1株對(duì)玉米葉斑病(彎孢葉斑病、大斑病和小斑病)具有較好防效的枯草芽孢桿菌ST–87–14，溫室盆栽試驗(yàn)顯示其對(duì)玉米小斑病的防效達(dá)87.60%，田間小區(qū)試驗(yàn)防效為48.16%。這說明，篩選到的芽孢桿菌對(duì)玉米小斑病具有一定的防治效果，但僅憑生防菌本身難以達(dá)到防效優(yōu)異的目的，通過其他手段提高生防菌(代謝產(chǎn)物)的抑菌活性非常必要。倪璇等[14]研究表明，蕓苔素內(nèi)酯可以減少苯甲·丙環(huán)唑的用量，且能達(dá)到相同的防病效果，從而降低化學(xué)藥劑對(duì)環(huán)境的污染。微生物源活性物質(zhì)脂肽對(duì)多種植物病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，在協(xié)同抑菌方面具有較高的利用價(jià)值[15]。筆者以前期分離得到的拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌SJ06為材料，研究其和玉米小斑病菌的對(duì)峙培養(yǎng)、以及發(fā)酵上清液、脂肽粗提物及其與吡唑醚菌酯的聯(lián)合抑菌活性，以期為拓寬拮抗菌的用途和化學(xué)藥劑的減量防病提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1　材料

解淀粉芽孢桿菌() SJ06和玉米小斑病菌()為安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院保存。96%吡唑醚菌酯原藥由安徽省錦江農(nóng)化有限公司提供，用丙酮溶解，配制成1.0×104μg/mL母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。按照文獻(xiàn)[16]的方法，配制PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基。

1.2　方法

1.2.1測(cè)定SJ06對(duì)玉米小斑病菌的拮抗效果

在PDA培養(yǎng)基上活化玉米小斑病菌96 h；在NA培養(yǎng)基上活化SJ06 48 h；在PDA培養(yǎng)基上采取對(duì)峙培養(yǎng)法[17]測(cè)定拮抗菌SJ06對(duì)病菌的抑制活性，計(jì)算抑制率。

1.2.2測(cè)定SJ06發(fā)酵上清液和脂肽粗提物對(duì)玉米小斑病菌的抑制活性

參照段海明等[18]方法，提取SJ06的發(fā)酵上清液和脂肽粗提物。發(fā)酵上清液分別稀釋400、800、1 200、1 600、3 200倍，脂肽粗提物分別稀釋600、1 000、4 000、8 000、12 000倍，采用菌絲生長(zhǎng)速率法[19]測(cè)定SJ06發(fā)酵上清液和脂肽粗提物對(duì)玉米小斑病菌的抑制活性，采用SPSS13.0軟件計(jì)算其對(duì)玉米小斑病菌的50值。

1.2.3測(cè)定吡唑醚菌酯及其與SJ06脂肽粗提物復(fù)配對(duì)玉米小斑病菌的抑制效果

分別配制0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.8 μg/mL吡唑醚菌酯溶液，采用菌絲生長(zhǎng)速率法，求出藥劑對(duì)玉米小斑病菌的50；采用陳福良等[20]的方法，設(shè)計(jì)SJ06脂肽粗提物和吡唑醚菌酯體積比分別為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9，測(cè)定復(fù)配劑對(duì)玉米小斑病菌的抑菌活性，計(jì)算毒性比。

2　結(jié)果與分析

2.1　SJ06對(duì)玉米小斑病菌的抑制率

對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌SJ06對(duì)玉米小斑病菌的菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制效果(圖1)，抑制率可達(dá)71.43%。

圖1　SJ06對(duì)玉米小斑病菌的拮抗效果

2.2　SJ06發(fā)酵上清液對(duì)玉米小斑病菌的抑制率

隨著SJ06發(fā)酵上清液稀釋倍數(shù)的提高，其對(duì)玉米小斑病菌的抑制率逐漸下降(圖2)。發(fā)酵上清液稀釋400倍時(shí)，對(duì)玉米小斑病菌的抑制率為83.20%；上清液稀釋3 200倍時(shí)，其對(duì)病菌的抑制率下降至7.51%。發(fā)酵上清液對(duì)玉米小斑病菌的50值為0.88 μL/mL。毒力回歸方程：=2.70+ 0.12，2=0.95。

1　對(duì)照；2、3、4、5、6　分別示SJ06發(fā)酵上清液稀釋.400、800、1 200、1 600、3 200倍。

2.3　SJ06脂肽粗提物對(duì)玉米小斑病菌的抑制率

由圖3可知，隨著SJ06脂肽粗提物的稀釋倍數(shù)逐漸升高，其對(duì)玉米小斑病菌的抑制活性降低。脂肽粗提物稀釋600倍時(shí)，對(duì)玉米小斑病菌的抑制率為82.07%；脂肽粗提物稀釋12 000倍時(shí)，其對(duì)玉米小斑病菌的抑制率下降至17.72%。脂肽粗提物對(duì)玉米小斑病菌的50值為0.23 μL/mL。毒力回歸方程：=1.29+0.87，2=0.96。脂肽粗提物對(duì)玉米小斑病菌的抑制效果比發(fā)酵上清液的稍好。

1　對(duì)照；2、3、4、5、6分別示SJ06脂肽粗提物分別稀釋600、1 000、4 000、8 000 和12 000倍。

2.4　吡唑醚菌酯對(duì)玉米小斑病菌的抑制率

隨著吡唑醚菌酯質(zhì)量濃度的升高，其對(duì)玉米小斑病菌的抑制率增大。吡唑醚菌酯質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL時(shí)，對(duì)玉米小斑病菌的抑制率為12.77%；吡唑醚菌酯質(zhì)量濃度為4.8 μg/mL時(shí)，其對(duì)病菌的抑制率提高至90.21%。吡唑醚菌酯對(duì)玉米小斑病菌的50值為1.10 μg/mL。毒力回歸方程：=1.65–0.07，2=0.95。

2.5　SJ06脂肽粗提物與吡唑醚菌酯復(fù)配對(duì)玉米小斑病菌的毒性比

由表1可見，脂肽粗提物與吡唑醚菌酯復(fù)配組合對(duì)玉米小斑病菌的毒性比均大于1，說明二者復(fù)配對(duì)玉米小斑病菌的抑制效果均為增效作用，其中，復(fù)配比為4∶6時(shí)，毒性比為1.21，增效作用最強(qiáng)。

表1　SJ06脂肽粗提物與吡唑醚菌酯復(fù)配對(duì)玉米小斑病菌的毒性比

3　討論

解淀粉芽孢桿菌代謝所產(chǎn)生的脂肽、抗菌蛋白、揮發(fā)性物質(zhì)等對(duì)植物病菌具有抗菌活性[21]。謝蘭芬等[22]分離的解淀粉芽孢桿菌B9601–Y2，其發(fā)酵液、上清液和芽孢對(duì)玉米小斑病菌的抑制率分別達(dá)88.04%、82.85%和5.63%，說明其抑菌活性物質(zhì)大多存在于胞外代謝產(chǎn)物中。微生物發(fā)酵產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，與活體生防微生物相比，具有抑菌活性高、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)和防效穩(wěn)定等特點(diǎn)，在推廣應(yīng)用方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[23]。本研究制備的SJ06發(fā)酵上清液和脂肽粗提物對(duì)玉米小斑病菌有較好的抑制效果，且與吡唑醚菌酯復(fù)配表現(xiàn)出普遍的增效活性，但還需盆栽和田間小區(qū)防效試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。生防菌還具有誘導(dǎo)抗病和促生等重要功能，對(duì)作物根系健康、產(chǎn)量提高具有促進(jìn)作用[24]。孫黃兵等[25]研究發(fā)現(xiàn)，杜仲內(nèi)生細(xì)菌DZSY21處理玉米后，能夠增強(qiáng)其防御酶活性以及誘導(dǎo)植株形成水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)信號(hào)傳導(dǎo)通路，以此增強(qiáng)玉米抗病能力。劉拴成等[26]研究表明，采用解淀粉芽孢桿菌B9601–Y2拌種、浸種和澆灌土壤均能提高玉米生長(zhǎng)速度和生物量。后續(xù)擬從SJ06菌株的誘導(dǎo)抗病性和促進(jìn)玉米產(chǎn)量提高等方面開展系統(tǒng)研究，為該生防菌株的開發(fā)利用和玉米的抗病增產(chǎn)提供技術(shù)支持。

[1] HUANG C J，YANG K H，LIU Y H，et al．Suppression of southern corn leaf blight by a plant growth-promoting rhizobacteriumC1L[J]．Annals of Applied Biology，2010，157(1)：45–53．

[2] 吳建宇，席章營(yíng)，蓋鈞鎰．玉米抗病遺傳育種的研究進(jìn)展[J]．玉米科學(xué)，1999，7(2)：6–11． WU J Y，XI Z Y，GAI J Y．Advance in genetics and breeding of resistance of maize to disease[J]．Journal of Maize Sciences，1999，7(2)：6–11．

[3] 國家農(nóng)作物品種審定委員會(huì)．國家農(nóng)作物品種審定委員會(huì)關(guān)于印發(fā)《主要農(nóng)作物品種審定標(biāo)準(zhǔn)(國家級(jí))》的通知[J]．種子科技，2017，35(10)：8–13．National Crop Variety Approval Committee．Circular of the state crop variety examination and approval commission on printing and distributing the examination and approval standards for major crop varieties(at the national level)[J]. Seed Science and Technology，2017，35(10)：8–13．

[4] 張禮生，劉文德，李方方，等．農(nóng)作物有害生物防控：成就與展望[J]．中國科學(xué)(生命科學(xué))，2019，49(12)：1664–1678． ZHANG L S，LIU W D，LI F F，et al．Crop pest control in China：advances and perspectives[J]．Sci Sin Vitae，2019，49(12)：1664–1678．

[5] 甘林，代玉立，滕振勇，等．福建省玉米小斑病菌對(duì)丙環(huán)唑、烯唑醇和咪鮮胺的敏感性[J]．農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2016，18(2)：194–200． GAN L，DAI Y L，TENG Z Y，et al．Sensitivity ofto propiconazole，diniconazole and prochloraz in Fujian province[J]．Chinese Journal of Pesticide Science，2016，18(2)：194–200．

[6] 代玉立，甘林，阮宏椿，等．福建省玉米小斑病菌對(duì)異菌脲和吡唑醚菌酯的敏感性及其田間防效[J]．農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2017，19(4)：434–440． DAI Y L，GAN L，RUAN H C，et al．Sensitivity ofto iprodione and pyraclostrobin and their control efficacy against southern corn leaf blight in Fujian province[J]．Chinese Journal of Pesticide Science，2017，19(4)：434–440．

[7] 杜宜新，阮宏椿，石妞妞，等．福建玉米小斑病菌對(duì)戊唑醇、吡唑醚菌酯和硝苯菌酯的敏感性[J]．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2017，45(8)：69–75． DU Y X，RUAN H C，SHI N N，et al．Sensitivity ofin Fujian to tebuconazole，pyraclostrobin and meptyldinocap[J]．Journal of Northwest A and F University (Natural Science Edition)，2017，45(8)：69–75．

[8] 嚴(yán)婉榮，陳圓，肖敏，等．海南玉米小斑病菌室內(nèi)藥劑篩選及對(duì)戊唑醇、嘧菌酯的敏感性[J]．植物保護(hù)，2018，44(4)：183–187． YAN W R，CHEN Y，XIAO M，et al．Screening of fungicides and sensitivity ofto tebuconazole and azoxytrobin in Hainan province[J]. Plant Protection，2018，44(4)：183–187．

[9] 馬佳，范莉莉，傅科鶴，等．哈茨木霉SH2303防治玉米小斑病的初步研究[J]．中國生物防治學(xué)報(bào)，2014，30(1)：79–85． MA J，F(xiàn)AN L L，F(xiàn)U K H ，et al．The preliminary study on the control of southern corn leaf blight bySH2303[J]．Chinese Journal of Biological Control，2014，30(1)：79–85．

[10] 王霞，王素英，高朋輝．青霉TS67 菌株對(duì)大豆根腐病和玉米小斑病的防治效果評(píng)價(jià)[J]．微生物學(xué)通報(bào)，2008，35(8)：1246–1250． WANG X，WANG S Y，GAO P H．Evaluation of antagonism ofTS67 against soybean root rot disease and corn southern leaf blight[J]．Microbiology，2008，35(8)：1246–1250．

[11] CUI W Y，HE P J，MUNIR S，et al．Efficacy of plant growth promoting bacteriaB9601-Y2 for biocontrol of southern corn leaf blight[J]．Biological Control，2019，139：104–115．

[12] 葉云峰，黎起秦，袁高慶，等．枯草芽孢桿菌B47菌株抗菌物質(zhì)的分離純化及其對(duì)玉米小斑病的防治作用[J]．中國生物防治學(xué)報(bào)，2011，27(3)：357–361． YE Y F，LI Q Q，YUAN G Q，et al．Purification of antimicrobial substance produced byB47 and its effect on southern corn leaf blight[J]．Chinese Journal of Biological Control，2011，27(3)：357–361．

[13] 鹿秀云，李社增，栗秋生，等．玉米葉斑病拮抗細(xì)菌的篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J]．中國生物防治，2006，22(增刊)：47–53． LU X Y，LI S Z，LI Q S，et，al．Screening of bacteria as biocontrol agent against corn leaf spot and study on its optimal culture medium[J]．Chinese Journal of Biological Control，2006，22(Suppl)：47–53．

[14] 倪璇，王猛，關(guān)山，等．蕓苔素內(nèi)酯與苯甲丙環(huán)唑協(xié)同防控玉米小斑病初步研究[J]．上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2017，35(3)：31–36． NI X，WANG M，GUAN S，et al．Research of prevention and control ofwith brassinolide and chemical pesticides[J]．Journal of Shanghai Jiaotong University(Agricultural Science)，2017，35(3)：31–36．

[15] MAKSIMOV I V，SINGH B P，CHEREPANOVA E A，et al．Prospects and applications of lipopeptide-producing bacteria for plant protection(review)[J]．Applied Biochemisty and Microbiology，2020，56(1)：15–28．

[16] 方中達(dá)．植病研究方法[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：46–50． FANG，Z D．Research Methods of Plant Diseases[M]. Beijing：China Agriculture Press，1998：46–50．

[17] 龍兆雨，何可佳，戴良英，等．柑橘砂皮病菌生防菌的篩選及其發(fā)酵條件優(yōu)化[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2018，44(3)：334–338． LONG Z Y，HE K J，DAI L Y，et al．Screening and optimization of fermentation conditions for antagonistic bacteria to[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2018，44(3)：334–338．

[18] 段海明，程紅，李林玉，等．解淀粉芽孢桿菌gfj–4發(fā)酵上清液及與化學(xué)殺菌劑混配對(duì)玉米大斑病病菌的抑制作用[J]．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，39(5)：74–81． DUAN H M，CHENG H，LI L Y，et al．Inhibitory effects ofgfj-4 fermentation supernatant and its mixtures with chemical fungicides against[J]．Journal of South China Agricultural University，2018，39(5)：74–81．

[19] GEORGOPOULOS S G，DEKKER J．Detection and measurement of fungicide-resistance，general principles[J]. FAO Plant Prot Bull，1982，30(2)：39–42．

[20] 陳福良，鄭斐能，王儀．農(nóng)藥混配室內(nèi)毒力測(cè)定的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)[J]．農(nóng)藥科學(xué)與管理，1997(4)：30–34． CHEN F L，ZHENG F N，WANG Y．A trial desgin about bioassay of insecticide miexd[J]．Pesticide Science and Administration，1997(4)：30–34．

[21] CHEN M C，WANG J P，ZHU Y J，et al．Antibacterial activity againstof the lipopeptides secreted from thestrain FJAT-2349[J]．Journal of Applied Microbiology，2019，126(5)：1519–1529．

[22] 謝蘭芬，何鵬飛，吳毅歆，等．解淀粉芽孢桿菌B9601–Y2對(duì)玉米葉斑病的防治效果[J]．玉米科學(xué)，2017，25(2)：130–135． XIE L F，HE P F，WU Y X，et al．Control effects of9601-Y2 on corn leaf spots[J]. Journal of Maize Sciences，2017，25(2)：130–135．

[23] 劉泉成，張茜茜，田雪亮，等．玉米根際細(xì)菌群落特征及生防菌篩選[J]．中國生物防治學(xué)報(bào)，2018，34(5)：771–778． LIU Q C，ZHANG X X，TIAN X L，et al．Composition of bacterial community in maize rhizosphere anscreening of biocontrol bacteria strains[J]．Chinese Journal of Biological Control，2018，34(5)：771–778．

[24] RAHMAN A，UDDIN W，WENNER N G．Induced systemic resistance responses in perennial ryegrass againstelicited by semi-purified surfactin lipopeptides and live cells of[J]. Molecular Plant Pathology，2015，16(6)：546–558．

[25] 孫黃兵，鐘年孝，孔令茹，等．杜仲內(nèi)生細(xì)菌DZSY21 誘導(dǎo)玉米抗小斑病的系統(tǒng)抗性研究[J]．生物學(xué)雜志，2018，35(5)：49–53． SUN H B，ZHONG N X，KONG L R，et al．Research on maize system resistance triggered by the endophytic bacterium DZSY21[J]．Journal of Biology，2018，35(5)：49–53．

[26] 劉拴成，楊進(jìn)成，馬麗華，等．解淀粉芽孢桿菌B9601–Y2提高玉米生長(zhǎng)和產(chǎn)量的效應(yīng)[J]．玉米科學(xué)，2010，18(6)：78–82．LIU S C，YANG J C，MA L H，et al．Effect ofB9601-Y2 on growth and yield promotion of maize[J]．Journal of Maize Sciences，2010，18(6)：78–82．

Synergistic inhibitory activity of crude lipopeptide extracts fromstrain SJ06 and pyraclostrobin against

DUAN Haiming，LI Kewen

(College of Agriculture, Anhui Science and Technology University, Fengyang, Anhui 233100, China)

The antagonistic activity ofstrain SJ06 againstwas tested by confrontation culture, and the antifungal activity of fermentation supernatant, crude lipopeptide extracts and pyraclostrobin were determined by mycelial growth rate. The synergic antifungal activity of crude lipopeptide extracts of strain SJ06 and pyraclostrobin was obtained by mixing them in different proportion. The results showed that the inhibition rate of strain SJ06 againstwas 71.43%. The50of fermentation supernatant and crude lipopeptide extracts towas 0.88 μL/mLand 0.23 μL/ mL, respectively. The50value of pyraclostrobin towas 1.10 μg/mL. The toxicity ratio of the combination of crude lipopeptide extracts and pyraclostrobin towas more than 1, which indicated that the inhibition effect of the combination was synergism. Among them, the proportion of 4:6 had the strongest synergistic effect, and the toxicity ratio was 1.21.

; southern corn leaf blight; crude lipopeptide extracts; pyraclostrobin; synergistic inhibitory effect

S476+.1

A

1007-1032(2020)04-0432-05

10.13331/j.cnki.jhau.2020.04.008

段海明，李可文．解淀粉芽孢桿菌SJ06脂肽粗提物與吡唑醚菌酯協(xié)同對(duì)玉米小斑病菌的抑制效果[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(4)：432–436．

DUAN H M，LI K W. Synergistic inhibitory activity of crude lipopeptide extracts fromstrain SJ06 and pyraclostrobin against[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(4): 432–436.

http://xb.hunau.edu.cn

2020–02–18

2020–06–09

安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2020A0067)；教育部大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201810879031)

段海明(1982—)，男，山東蒙陰人，博士，副教授，主要從事農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)研究, duanhm@ahstu.edu.cn

責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維