王海英，蔣學(xué)華，鄒 琴，蘇 旭，陳 卓#

(1.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)，四川 成都610041； 2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

特比萘芬是瑞士Sandoz藥廠生產(chǎn)的一種具有親脂性、可外用又可口服的新型丙烯胺類抗真菌藥，其能特異性干擾真菌固醇生物合成，引起麥角固醇的缺乏，并且抑制真菌細(xì)胞膜上的角鯊烯環(huán)氧化酶，使角鯊烯在細(xì)胞內(nèi)積聚，從而導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡[1-3]。角鯊烯環(huán)氧化酶與細(xì)胞色素P450系統(tǒng)無關(guān)系，不影響激素或其他藥物的代謝。本品與萘替芬同為丙烯胺衍生物，但其抗真菌活性比后者高30倍。特比萘芬是治療真菌性皮膚病非常安全有效的藥物，用于治療足癬臨床療效較為理想，同時臨床復(fù)發(fā)率較低[4-6]；其對于頭癬的療效與灰黃霉素相當(dāng)，但安全性更高，不良反應(yīng)較少[7]。本試驗在已有的文獻報道基礎(chǔ)上[8-11]，用已建立的高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定24例健康受試者自身交叉對照口服兩種特比萘芬片(分散片和普通片)后的經(jīng)時血藥濃度，采用液液萃取法對血樣進行處理，專屬性強，靈敏度高, 可用于特比萘芬片劑在健康人體的藥動學(xué)和生物等效性研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 儀器

Alliance型高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；CP225D型電子天平(德國賽多利斯公司)；艾本德單通道移液器(0.5～10 μl，20～200 μl，德國Eppendorf公司)；IKA Votex Genius 3型渦漩混合儀(德國IKA公司)；TGL-16C型臺式高速離心機(上海市安亭科技儀器廠)；THERMO型低溫冰箱(美國THERMO公司)。

1.2 藥品與試劑

受試制劑特比萘芬分散片(T，按C16H17N3O4S計算0.25 g/粒，批號為100501H，四川某藥業(yè)有限責(zé)任公司)，遮光、密封，在涼暗處(≤20 ℃)保存，有效期暫定為2年；參比制劑特比萘芬片(R，按C16H17N3O4S計算0.25 g/粒，批號為X0124，北京諾華制藥有限公司)，遮光、密封，在涼暗處(避光且≤20 ℃)保存，有效期3年；鹽酸特比萘芬標(biāo)準(zhǔn)品(批號為100563-200301，中國食品藥品檢定研究院 )。內(nèi)標(biāo)海柯堿皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品(批號為HDV01，純度99%，東京化成工業(yè)株式會社)；甲醇(色譜純，批號為085884，美國Fisher公司)；水為MILLIPORE去離子水。

1.3 試驗對象

入組24例健康男性受試者，平均年齡(25.1±1.0)歲，平均體重(64.8±5.9) kg，平均身高(1.72±5.4) m。所有入組的受試者身體健康，無心血管、肝臟、腎臟、消化道、精神及神經(jīng)等疾病史，試驗前經(jīng)病史詢問、體格檢查和實驗室檢查未發(fā)現(xiàn)有臨床意義的異常。受試者在試驗期間全程入住四川大學(xué)華西第二醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)Ⅰ期病房，統(tǒng)一進食標(biāo)準(zhǔn)餐。本研究通過四川大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，試驗前受試者均簽署知情同意書。

2 方法與結(jié)果

2.1 給藥方法及樣品采集

本試驗采用開放、隨機、兩周期、雙交叉試驗設(shè)計，受試者于試驗前2周至整個試驗過程禁止服任何其他藥物,禁煙酒，于每周期給藥前1 d入住Ⅰ期病房，給藥前禁食至少10 h以上，在空腹?fàn)顟B(tài)下用240 ml水送服受試制劑或參比制劑1粒。受試期間統(tǒng)一進食清淡、低脂肪且不辛辣飲食。周期間的清洗期為7 d。受試者給藥前自上肢肘靜脈取空白血約3 ml，給藥后0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、5、8、12、24及54 h由上肢肘靜脈取含藥血約3 ml，試驗過程共設(shè)計13個取樣點，每例受試者總?cè)⊙s78 ml。血樣置肝素化的離心管中離心分離血漿，置于 -70 ℃冰箱保存待測。

2.2 色譜條件

色譜柱為Sunfire C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司)；流動相組成為甲醇-10 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(V∶V=90∶10)，柱溫為25 ℃；檢測波長為224 nm；流速為1.0 ml/min。

2.3 血漿樣品處理

精密量取血漿樣品500 μl，置于7 ml塑料離心管中，分別加入系列濃度的待測物工作溶液100 μl，混勻1 min后，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μl，混勻1 min后加入0.1 mol/L鹽酸溶液0.2 ml，渦旋振蕩混合1 min，用正己烷3.5 ml渦旋提取7 min，12 000 r/min離心7 min，吸取上清液入進樣瓶插管中，50 ℃氮氣揮干。殘渣用0.1 ml流動相溶解，依次放置于自動進樣器樣品盤，進樣30 μl分析。記錄待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

根據(jù)血藥濃度數(shù)據(jù)，采用DAS 3.0軟件，按統(tǒng)計矩原理，計算藥動學(xué)參數(shù)，并評價特比萘芬分散片和普通片劑的生物等效性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精密稱取鹽酸特比萘芬對照品，用甲醇定量溶解并稀釋至含特比萘芬 200 μg/ml，得特比萘芬儲備液。取特比萘芬儲備液適量，用甲醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為78.125、156.25、312.5、625、1 250、2 500、5 000、10 000和20 000 ng/ml的特比萘芬標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；同時，另外配制156.25、2 500和10 000 ng/ml的質(zhì)量控制(qualitycontrol，QC)溶液，于4 ℃冷藏備用。此外，精密稱取?？聣A皂苷元，用甲醇稀釋定容，得到質(zhì)量濃度約為100 μg/ml的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

2.5.2 專屬性考察：分別取6例受試者的空白血漿500 μl，除不加入內(nèi)標(biāo)溶液并另補加甲醇200 μl外，其余按“2.3”項下方法操作，獲得空白血漿樣品的色譜圖，見圖1(A)；將一定濃度的特比萘芬標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，依同法操作，得圖1(B)；取健康受試者給藥后血漿樣品，依同法操作，得圖1(C)。結(jié)果顯示，在此色譜質(zhì)譜條件下內(nèi)標(biāo)、特比萘芬保留時間分別為4.6、7.2 min，峰形良好，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾特比萘芬和?？聣A皂苷元的測定。

A.空白血漿；B.空白血漿中加入特比萘芬(500 ng/ml)、內(nèi)標(biāo)?？聣A皂苷元(500 ng/ml)(run 01)；C.健康受試者口服參比制劑2 h后的血漿樣品A.blank plasma; B.blank plasma with terbinafine (500 ng/ml) and internal standard haikoline saponin (500 ng/ml)(run 01); C.plasma sample of healthy volunteers after oral administration of reference preparation for 2 h圖1 血漿中特比萘芬和內(nèi)標(biāo)?？聣A皂苷元的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of terbinafine and internal standard haikoline saponin in plasma

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與定量下限：精密量取空白血漿500 μl，分別加入特比萘芬標(biāo)準(zhǔn)系列溶液100 μl，配制成相當(dāng)于血漿濃度為15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000和4 000 ng/ml的血漿樣品，除不加甲醇100 μl外，其余按“2.3”項下操作，進行分析，記錄色譜圖。以特比萘芬濃度為橫坐標(biāo)(C)，特比萘芬與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)(R)，用加權(quán)(W=1/c2)最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程為R=0.183C-0.006，r2=0.999?？梢?，血漿中特比萘芬的質(zhì)量濃度在15.625～4 000 ng/ml范圍時，線性關(guān)系良好，并且定量下限為15.625 ng/ml。

2.5.4 精密度與提取回收率：制備特比萘芬低、中及高3個質(zhì)量濃度(156.25、2 500及10 000 ng/ml)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每個質(zhì)量濃度各6個樣本，連續(xù)測定3 d。根據(jù)當(dāng)日的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算QC樣品的測定質(zhì)量濃度，計算準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果見表1。同時，另取空白血漿500 μl，按“2.3”項下操作，向提取后的上清液中加入相對應(yīng)質(zhì)量濃度的QC溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合，經(jīng)氮氣吹干復(fù)溶后進樣。以每個質(zhì)量濃度2種處理方法的峰面積比值計算提取回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，藥物和內(nèi)標(biāo)提取回收率穩(wěn)定，結(jié)果精密可重現(xiàn)。

表1 HPLC法測定血漿中特比萘芬的精密度與回收率試驗結(jié)果Tab 1 Precision and recovery test of terbinafine in plasma by HPLC method

2.5.5 穩(wěn)定性試驗：取特比萘芬低、中及高3個質(zhì)量濃度(156.25、2 500及10 000 ng/ml)的QC樣品，每個質(zhì)量濃度3個樣本，分別考察室溫(15～25 ℃)條件下放置4 h、提取后室溫條件下放置4 h、自動進樣器環(huán)境放置24 h以及-80 ℃反復(fù)凍融循環(huán)3次和-80 ℃冷凍放置30 d的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在上述條件下，特比萘芬和內(nèi)標(biāo)均穩(wěn)定，質(zhì)量濃度的相對誤差均<(±15%)。

2.6 平均血藥濃度-時間曲線

2例患者因臨時有事退出試驗。其余22例健康受試者口服特比萘芬受試制劑與參比制劑后的平均血藥濃度-時間曲線見圖 2。

圖2 22例受試者服用受試制劑和參比制劑后平均血藥濃度-時間曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time profile after oral administration of test and reference preparation in 22 healthy volunteers

2.7 藥動學(xué)參數(shù)

22例受試者空腹給予特比萘芬受試制劑與參比制劑后血漿中特比萘芬的主要藥動學(xué)參數(shù)見表2。

表2 22例受試者服用受試制劑和參比制劑后的主要藥動學(xué)參數(shù)Tab 2 Pharmacokinetic parameters after oral administration of test and reference preparations in 22 healthy

2.8 生物等效性評價結(jié)果

特比萘芬受試制劑與參比制劑的AUC0-t、AUC0-∞及Cmax在藥物和周期的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示，受試制劑AUC0-t、AUC0-∞及Cmax的90%CI分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的93.0%～103.4%、95.4%～102.8%及96.5%～115.1%，落在80%～125%區(qū)間，表明以健康受試者單劑量口服受試制劑和參比制劑后的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax等參數(shù)為指標(biāo)進行兩種制劑生物等效性評價，受試制劑特比萘芬分散片與參比制劑特比萘芬片在健康中國人體內(nèi)生物等效，受試制劑相對于參比片劑的生物利用度為(108.2±27.6)%。

3 討論

根據(jù)Cmax、AUC0→t、Tmax3個用于生物等效性評價的主要藥動學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計分析結(jié)果,可認(rèn)為兩種制劑的吸收速度和吸收程度均無差異，提示特比萘芬受試制劑和參比制劑具有生物等效性。分散片的Tmax與普通片Tmax相比略有加快，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，未能體現(xiàn)分散片加快吸收的臨床使用優(yōu)越性，提示該劑型改變不是有價值的劑型改造。鹽酸特比萘芬為脂溶性藥物，其水溶性較差，為進一步提高其生物利用度，避免或減少口服帶來的不良反應(yīng)，同時最大限度地提高藥物的臨床療效，有必要進一步研究鹽酸特比萘芬新劑型、新載藥制備工藝。隨著現(xiàn)代藥劑學(xué)制劑工藝的發(fā)展，近年來已有納米乳[12]、固體脂質(zhì)納米粒[13]、二元醇質(zhì)體[14]、醇類脂泡囊[15]及固體分散體微丸[16]等研究報道。

本研究采用液液萃取后HPLC法測定血樣中的特比萘芬濃度，流動相用緩沖鹽體系，在長時間進樣過程中色譜峰形無拖尾、峰位漂移等現(xiàn)象；同時，樣品與內(nèi)標(biāo)峰能夠分離良好。本試驗建立的方法簡便、快速且靈敏，專屬性強，并可以滿足最低檢測的要求及藥動學(xué)研究的需要，適用于臨床藥動學(xué)研究。