郭玲玲，張芬，成浩，韋康，阮麗，吳立赟，王麗鴛

茶樹亞家族基因的克隆與表達(dá)分析

郭玲玲，張芬，成浩，韋康，阮麗，吳立赟，王麗鴛*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008

采用RT-PCR技術(shù)，從龍井43中成功克隆了5個(gè)茶樹（Amino acid permeases，氨基酸通透酶）基因。氨基酸序列比對結(jié)果表明，5個(gè)CsAAPs亞家族蛋白的序列同源性較高，為70.27%。根據(jù)氨基酸序列同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示5個(gè)CsAAPs分屬3組。生物信息學(xué)分析表明，CsAAPs均含有9~10個(gè)跨膜區(qū)域和16~18個(gè)AAP保守基序。為了研究該亞家族對氮素的響應(yīng)情況，選用3個(gè)茶樹品種的扦插苗為試驗(yàn)材料，氮饑餓兩周后，分別供應(yīng)不同濃度的NH4NO3，然后利用qRT-PCR對在不同組織、氮素水平及茶樹品種中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)組織中均有表達(dá)，但是存在一定的組織表達(dá)差異，其中在莖中表達(dá)量最高，的主要表達(dá)部位為根和莖。在給氮素饑餓處理的茶苗從新供氮之后，的基因表達(dá)在3個(gè)氮素利用效率不同的品種間差異較大；在氮高效品種中茶302莖中表達(dá)的和，可以快速地對低氮條件做出響應(yīng)，在低氮處理3?h后，基因表達(dá)水平明顯增加。此研究預(yù)示著亞家族在茶樹體內(nèi)可能通過復(fù)雜的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)參與氮代謝調(diào)控。

茶樹；氨基酸通透酶；基因克隆與表達(dá)；氮素

氮素是植物生長發(fā)育過程中必需的營養(yǎng)元素之一，是限制植物產(chǎn)量的關(guān)鍵因子[1]。茶樹作為重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，對氮素的需求量大，因此研究茶樹中氮素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)對提高和改善茶樹的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義[2]。植物中對氮素利用效率的研究主要集中在氮吸收[3-4]、分配及代謝調(diào)節(jié)[5-6]。氨基酸是茶葉的重要品質(zhì)成分及氮素貯存形式，茶葉中的鮮爽滋味主要依賴于游離氨基酸的含量，同時(shí)它也是茶樹體內(nèi)核酸、葉綠素、線粒體以及次生代謝產(chǎn)物的前體等物質(zhì)的氮素來源[2]。茶樹根系對氮素的吸收以無機(jī)態(tài)氮為主，即銨態(tài)氮（NH4+-N）和硝態(tài)氮（NO3--N），無機(jī)態(tài)氮在根部被同化為谷氨酰胺和茶氨酸等氨基酸，并以此形式被運(yùn)送到地上部[2]。氨基酸在源庫器官之間，以及細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)，均離不開氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[7]。

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是位于生物膜上用以吸收轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的蛋白家族，它廣泛存在于動物和植物中，且在細(xì)菌、真菌以及酵母中也有發(fā)現(xiàn)。根據(jù)功能和序列同源性將氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為2個(gè)大家族，包括：ATF超家族（Amino acid transporter family）和APC超家族（Amino acid polyamine and choline transporters superfamily）[8]。其中ATF家族包括6個(gè)亞家族，分別為：AAPs（Amino acid permeases）亞家族，LHTs（Lysine histidine transporters）亞家族，ProTs（Proline transporters），-GATs（-aminobutyric transporters）亞家族，ANTs（Aromatic and neutral amino acid transporters）亞家族，AUX（Auxin-resistant family）亞家族[9]。

AAPs亞家族能夠廣泛的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)各種氨基酸[10-11]，可能參與根部以及韌皮部和木質(zhì)部氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[12-13]。該亞家族基因在擬南芥（）中有8個(gè)基因成員，~，在根、莖、葉、花、種子中均有表達(dá)。除外，其他各基因成員能以1∶1的比例將質(zhì)子和氨基酸共轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中[14-15]?？梢酝ㄟ^介導(dǎo)脯氨酸的吸收，增加擬南芥對外源脯氨酸的積累，以提高植物耐鹽性[16]。菜豆中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PvAAP1可在木質(zhì)部和韌皮部進(jìn)行氨基酸的裝載，然后轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸到子葉中供種子發(fā)育和化合物的積累[17]。參與氨基酸在韌皮部的裝載和向胚中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的生理過程。擬南芥中的主要在根部表達(dá)，推測其在土壤中有吸收氨基酸的功能[18]。而蓖麻中的主要表達(dá)部位在源庫組織中，被認(rèn)為可能在蛋白質(zhì)合成的氨基酸積累中發(fā)揮更大的作用[19]。在田間相關(guān)濃度下，其對氨基酸根部吸收有重要作用[20]，吸收氨基酸類型多為陽離子氨基酸[21]；擬南芥的突變體能夠影響韌皮部氨基酸的組成情況[12]。同時(shí)Marella等[22]發(fā)現(xiàn)和可以通過調(diào)控?cái)M南芥氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響其根部根結(jié)線蟲的寄生和繁殖。另有研究報(bào)道，衰老、水、鹽和高溫等脅迫條件能夠?qū)Π被徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白起到誘導(dǎo)作用[23-26]；植物在缺氮的環(huán)境中，也會增強(qiáng)對氨基酸的吸收，這表明土壤氮素養(yǎng)分缺乏可能會誘導(dǎo)植物根系合成氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體[27]。Dong等[28]從茶樹全基因組中篩選得到茶樹氨基酸通透酶9個(gè)，CsAAP1~9；同時(shí)發(fā)現(xiàn)除CsAAP3、CsAAP7、CsAAP9外，其余6個(gè)CsAAPs對茶氨酸有較高的親和性，其中CsAAP1與茶氨酸從根到新生部位的運(yùn)輸高度相關(guān)。

本研究基于課題組前期經(jīng)不同氮素濃度處理后得到的茶樹轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選獲得14條亞家族成員基因序列，以龍井43的葉片、莖及根為試驗(yàn)材料，最終克隆得到5個(gè)茶樹亞家族基因的全長序列，分析它們編碼氨基酸的基本特征，并初步探討了該亞家族基因在不同組織和不同氮素濃度條件下的表達(dá)特點(diǎn)和響應(yīng)規(guī)律，以期揭示茶樹氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、分布及氮代謝的分子調(diào)控機(jī)制，從而為氮素高效型茶樹品種的篩選及選育提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

分別取龍井43（LJ43）的嫩葉（一芽一葉）、成熟葉、莖和根，轉(zhuǎn)入液氮中速凍處理，并于–80℃冰箱保存，以用于后續(xù)的克隆試驗(yàn)。選用龍井43、中茶108（ZC108）和中茶302（ZC302）一年生無性系茶樹幼苗水培于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所溫室中，溫度控制在26℃左右，濕度為60%~70%，光照時(shí)間為白天14?h，夜晚10?h。水培所用營養(yǎng)液配方參照Ruan等[29]的方法，采用小型通氣泵全天24?h通氣，以保證根系的通氧量。在茶苗生長穩(wěn)定且長勢良好時(shí)，對3個(gè)品種的嫩葉、成熟葉、莖和根分別進(jìn)行取樣，于蒸餾水中清洗，擦干后迅速轉(zhuǎn)入液氮中，–80℃保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)的組織特性分析。與此同時(shí)，茶苗進(jìn)行氮饑餓處理兩周，隨后均轉(zhuǎn)入氮素濃度為0.2?mmol·L-1（低氮水平），2?mmol·L-1（正常氮素水平）和10?mmol·L-1（高氮水平）的營養(yǎng)液中培養(yǎng)，氮源為NH4NO3，2?d換1次營養(yǎng)液。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，分別于處理0、3、72?h取樣，第1次取樣時(shí)間為上午9時(shí)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3株，分組織清洗后轉(zhuǎn)入液氮，于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 CsAAPs亞家族基因克隆及測序

總RNA的提取和cDNA的合成方法參見文獻(xiàn)[30]。

在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，以基因名稱“amino acid permease”進(jìn)行搜索、FPKM（Fragments perKilobase million）值（＞5）以及序列長度等為參考條件，篩選得到茶樹AAPs亞家族基因序列14條，將具有包含最長CDS區(qū)域的基因序列利用軟件Primer premier 5進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)，如表1所示，克隆得到基因序列，隨后連接PMD-18T載體（TAKARA）并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序正確的序列與Wei等[31]發(fā)布的CSS（var.）基因組序列進(jìn)行比對驗(yàn)證，該基因組是對雜合度較低的茶樹品種舒茶早進(jìn)行測序得到的。

1.3 CsAAPs亞家族基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)測序所得的正確核苷酸序列，利用Editseq軟件查詢其開放閱讀框（Open reading frame，ORF）并對編碼的氨基酸序列進(jìn)行推導(dǎo)；使用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blastp工具對推導(dǎo)獲得的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性比對。通過在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）在線軟件計(jì)算推導(dǎo)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量等基本理化性質(zhì)；利用Protscale（http://web.expasy.org/protscale）進(jìn)行蛋白的親水性/疏水性分析；SignalP 4.1（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行蛋白信號肽預(yù)測；ProtCompVersion 9.0（http://linuxl.Softberry.com/berry.phtml）進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位分析；TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析。利用MEGA 7對茶樹CsAAPs蛋白序列和擬南芥（）、葡萄（）、可可（）、煙草（）、咖啡（）等的AAPs蛋白序列進(jìn)行序列同源性分析。采用NCBI的CDD（Conserved domain database）在線數(shù)據(jù)庫對氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。使用在線軟件MEME[32]預(yù)測5個(gè)物種中AAPs亞家族基因蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，參數(shù)條件如下：基序?yàn)?0個(gè)，長度為6~50個(gè)氨基酸。使用DNAMAN軟件對CsAAPs亞家族蛋白序列進(jìn)行同源比對分析。

表1 基因克隆引物

1.4 CsAAPs亞家族基因的表達(dá)分析

總RNA的提取方法參見文獻(xiàn)[30]，cDNA的合成根據(jù)天根生化科技（北京）有限公司的FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsAAPs亞家族基因克隆

茶樹轉(zhuǎn)錄組中篩選得到的14條序列經(jīng)引物設(shè)計(jì)后，以LJ43嫩葉、成熟葉、莖和根的混合cDNA為模板，通過RT-PCR方法，成功克隆得到5條亞家族基因。經(jīng)DNA測序，發(fā)現(xiàn)克隆得到的序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的CDS序列長度一致，僅存在個(gè)別的堿基差異，部分序列有個(gè)別氨基酸差異。根據(jù)序列功能預(yù)測的基本信息（表3）及Blast結(jié)果，將基因分別命名為、、、、，并將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，登錄號分別為MK532959、MK532960、MK532961、MK532962、MK532963。

在茶樹基因組KEGG注釋信息中以“amino acid permease”為條件進(jìn)行搜索，得到68條注釋信息為氨基酸通透酶的序列，其中63注釋信息為“amino acid permease 7”，1條注釋信息為“amino acid permease 2”，1條注釋信息為“amino acid permease 8”，2條注釋信息為“amino acid permease”。把克隆得到的該亞家族基因序列與CSS基因組[26]進(jìn)行比對驗(yàn)證，各基因所對應(yīng)的基因組Scaffold編號分別為Scaffold3879:394084:396743、Scaffold4449:360031:379573、Scaffold13481:217697:219993、Scaffold694:1372452:1390756和Scaffold2943:1011332:1018534。、、和比對到的序列片段長度分別為1?452、1?467、1?311?bp和1?453?bp，且相似度均在99%及以上。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CSS基因組中的僅有805?bp的片段，遠(yuǎn)短于克隆得到的序列，原因可能是CSS基因組中未拼接到完整的序列。

表2 熒光定量PCR引物

表3 茶樹CsAAPs亞家族信息

2.2 茶樹CsAAPs亞家族基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化分析及結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用MEGA 7軟件將CsAAPs蛋白序列與擬南芥、葡萄、可可、煙草和咖啡中的AAPs亞家族共23條蛋白序列構(gòu)建親緣關(guān)系樹。由圖1可見，AAPs亞家族主要被分為3組，其中組1中包括AAP3和AAP4，組2包括AAP6和AAP8，組3僅包括AAP7。不同茶樹CsAAPs與其他物種的AAPs分別聚類到同一小組中，這表明了茶樹的CsAAPs亞家族基因在進(jìn)化上是相對保守的。使用MEME在線軟件分析，結(jié)果如表4和圖2所示，5個(gè)基因包含20個(gè)保守基序，其中保守基序的motif?1—motif?14以及motif?20在亞家族中廣泛存在。而motif?15只存在于組3的中；motif?16只存在于中；motif?17存在于組1的和中；motif 19只存在于中。采用NCBI的CDD（Conserved domain database）在線數(shù)據(jù)庫對氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，5個(gè)基因均包含Aa_trans（Transmembrane amino acid transporter protein，登錄號：pfam01490）結(jié)構(gòu)域，歸屬SLC5-6-like_sbd亞家族，該亞家族具有轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能，可將Na+與糖、氨基酸等共同轉(zhuǎn)運(yùn)。DNAMAN序列比對結(jié)果如圖3所示，CsAAPs亞家族蛋白的同源性較高，為70.27%。其中CsAAP3和CsAAP4的序列相似度達(dá)77.62%，而與其他序列的相似度不足60%。

2.2.2 編碼氨基酸的理化性質(zhì)分析

如表5所示，利用Protparam對CsAAPs的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測，結(jié)果顯示CsAAP3、CsAAP4、CsAAP6、CsAAP7和CsAAP8分別編碼483、485、483、464、480個(gè)氨基酸；相對分子量最大為53.48?kDa，最小為51.35?kDa。CsAAP3、CsAAP4、CsAAP6、CsAAP8理論等電點(diǎn)分別為8.94、8.86、9.14、8.78，均為堿性蛋白質(zhì)；CsAAP7的理論等電點(diǎn)4.93，為酸性蛋白質(zhì)。CsAAPs基因編碼蛋白的穩(wěn)定指數(shù)均在30以上，說明該亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為穩(wěn)定蛋白。5個(gè)CsAAP蛋白的平均疏水性值大于0.300，說明CsAAPs亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為疏水蛋白，與Protscale的預(yù)測結(jié)果一致。利用SignalP 4.1進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果顯示沒有明顯的信號肽序列，說明該亞家族蛋白為非分泌型蛋白。通過Softberry網(wǎng)站在線預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位，顯示CsAAPs蛋白定位在質(zhì)膜上，為膜蛋白。同時(shí)，利用TMHMM對CsAAPs亞家族蛋白序列進(jìn)行跨膜區(qū)的預(yù)測，結(jié)果顯示CsAAP4和CsAAP6有9個(gè)跨膜區(qū)，CsAAP3、CsAAP7和CsAAP8有10個(gè)跨膜區(qū)。

注：蛋白登錄號：AtAAP3：Q39134，AtAAP4：Q9FN04，AtAAP6：P92934，AtAAP7：Q9FF99，AtAAP8：O80592，VvAAP3：A5B880，VvAAP6：E0CNV4，VvAAP7：D7UAP6，VvAAP8：F6H362，NtAAP3：A0A1S4B456，NtAAP4：A0A1S4BEE9，NtAAP6：A0A1S3ZXD5，NtAAP7：A0A1S3Z1U3，TcAAP3：A0A061FHJ7，TcAAP4：A0A061DJ76，TcAAP6：A0A061FE42，TcAAP7：A0A061F4P0，Cc unnamed protein product：A0A068UID0

圖2 CsAAPs亞家族基因保守基序（1—20）

圖3 CsAAPs亞家族基因氨基酸序列比對

表4 茶樹CsAAP亞家族蛋白保守序列

表5 茶樹CsAAPs亞家族蛋白理化性質(zhì)分析

2.3 茶樹CsAAPs亞家族基因的組織表達(dá)特性及其對氮素響應(yīng)的分析

2.3.1 組織表達(dá)特性分析

熒光定量PCR分析5個(gè)基因在3個(gè)茶樹品種嫩葉、成熟葉、莖和根中的表達(dá)模式，利用熱圖軟件MeV繪制熱圖后對結(jié)果進(jìn)行展示（圖4）。亞家族基因在茶樹3個(gè)品種以及4個(gè)組織中都有表達(dá)，但表達(dá)情況不同。在品種間的表達(dá)趨勢一致，但表達(dá)量上存在差異。在組織中表達(dá)差異較大，在莖中表達(dá)量最高，其次為成熟葉；主要表達(dá)部位為成熟葉；在各組織中基因表達(dá)水平差異不大，但在葉片中的表達(dá)量高于根和莖；主要在嫩葉和莖中表達(dá)；主要在根和莖中表達(dá)。

2.3.2對氮素響應(yīng)的基因表達(dá)分析

依據(jù)各在的組織表達(dá)特性，利用熒光定量PCR，分析嫩葉、成熟葉、根及莖4個(gè)組織中對氮素響應(yīng)的表達(dá)變化情況，并重點(diǎn)關(guān)注了茶樹在不同氮素水平下和不同品種中的表達(dá)規(guī)律。

利用熱圖軟件MeV對各基因在不同處理下的相對表達(dá)量繪制熱圖，從圖5中可以發(fā)現(xiàn)：氮素處理后，各基因在不同氮素濃度水平和不同品種間的表達(dá)情況存在較明顯的差異。經(jīng)分層聚類（HCL，Hierarchical clustering）后，各基因在氮素處理下被分成兩大組。其中一組包含了在LJ43嫩葉和莖中表達(dá)的基因（、、、）和在ZC108嫩葉中表達(dá)較高的基因（和）；其余處理聚在另一組。在72?h氮素處理?xiàng)l件下，在3個(gè)品種的莖中上調(diào)表達(dá)，其中LJ43在氮素濃度為10?mmol·L-1處理下，表達(dá)上調(diào)；ZC108中，在3個(gè)氮素濃度處理后明顯上調(diào)；ZC302中在氮素濃度為0.2?mmol·L-1和2?mmol·L-1處理下表達(dá)上調(diào)。3?h氮素處理后，在LJ43中的響應(yīng)程度弱于ZC108和ZC302。成熟葉中的經(jīng)氮素處理3?h，在3個(gè)氮素水平下表達(dá)量均升高，僅在ZC302中表達(dá)存在明顯差異，正常氮素水平顯著高于低氮和高氮水平。在嫩葉中的表達(dá)量低于成熟葉，但在不同茶樹品種及氮素處理水平條件下，其表達(dá)的變化趨勢與成熟葉中一致。2?mmol·L-1氮素處理72?h，在LJ43中的表達(dá)較ZC108和ZC302突出。在不同氮素濃度下，在3個(gè)品種中的表達(dá)情況差異較大，被聚類在不同的組中。LJ43中，長時(shí)間且高濃度的氮素處理對基因的表達(dá)量影響較大。在ZC302中的表達(dá)明顯高于ZC108，但在兩個(gè)品種中的表達(dá)變化趨勢類似。在莖中表現(xiàn)較為突出的和，在3?h氮素處理后，隨氮素濃度的升高，其在ZC302莖中的表達(dá)量呈降低趨勢。

3 討論

氨基酸通透酶（AAPs）對氨基酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)具有廣泛的選擇性，氨基酸種類不同，其親和力也有所不同[7]。研究報(bào)道，植物氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物抗缺氮、水、鹽和高溫等脅迫條件中發(fā)揮著作用。茶氨酸是茶樹中特有的氨基酸，在根部合成之后，被轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部。研究發(fā)現(xiàn)6個(gè)CsAAPs對茶氨酸有較高的親和性，其中CsAAP1與茶氨酸從根到新生部位的運(yùn)輸高度相關(guān)[23]，表明亞家族基因在茶樹氮素分配及轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要作用。茶樹的氮代謝具有顯著區(qū)別與其他植物的特點(diǎn)。在茶樹中，茶氨酸被作為氮素長途轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存的重要形式，因此氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)尤其是與茶氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的氨基酸通透酶（AAPs）基因的研究就顯得尤為重要。

本研究基于茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆了茶樹中5個(gè)基因，即、、、、的序列全長，并將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為MK532959、MK532960、MK532961、MK532962、MK532963。與CSS基因組序列進(jìn)行了比對驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)除外，該亞家族的其他序列與CSS基因組中的序列基本一致。經(jīng)氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，該家族編碼的氨基酸序列與其他物種AAP亞家族具有較高的同源性，說明該亞家族基因在進(jìn)化上是保守的，可能與其他物種中的AAPs基因具有類似轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能。

組織表達(dá)特性分析顯示亞家族基因在3個(gè)茶樹品種的嫩葉、成熟葉、莖和根中均有表達(dá)，且該亞家族基因的組織表達(dá)特性在3個(gè)品種間的表達(dá)趨勢是一致的。但亞家族基因在不同組織中的表達(dá)水平存在差異，說明該亞家族基因在茶樹的各組織中是普遍存在的，且在特定的組織部位行使其功能。擬南芥主要在根中表達(dá)[34]，而大豆（）中的在葉和莖中表達(dá)較水平較高，在根中表達(dá)水平低，具有轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸的功能[35]。茶樹中的在成熟葉和莖中表達(dá)量較高，與大豆中的表達(dá)模式類似，因此推測可能參與茶樹中谷氨酸的運(yùn)輸。與擬南芥中類似[15]，也主要在成熟葉中進(jìn)行表達(dá)。擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)在木質(zhì)部薄壁組織中表達(dá)，可能是由于木質(zhì)部氨基酸濃度較低，需要高親和力的細(xì)胞，因此推測AtAAP6可能參與木質(zhì)部的氨基酸吸收；表達(dá)部位主要在幼嫩的果莢和種子[36]。而在茶樹各組織器官中均有檢測到，且組織間的差異不大。本研究結(jié)果顯示，茶樹在嫩葉和莖中表達(dá)量較高；在莖和根中的表達(dá)量較高。

注：1B1L為嫩葉（一芽一葉）；ML為成熟葉；S為莖；R為根。下同

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，茶樹亞家族基因除和外，其余3個(gè)基因的表達(dá)量在不同氮素水平及3個(gè)品種中變化較為明顯。有文獻(xiàn)報(bào)道LJ43為高氮高效的品種，能適應(yīng)氮素濃度較高的環(huán)境，在低氮條件下的氮素利用效率卻較低[37]；ZC302和ZC108在低氮條件下的吸收效率較高[38]。在氮高效品種中茶302莖中和可以快速地對低氮條件做出響應(yīng)，在低氮處理3?h后，基因表達(dá)水平明顯增加。而LJ43中，不能快速地對低氮條件做出響應(yīng)，僅在高氮處理72?h后，其表達(dá)水平才增加。這些研究預(yù)示，CsAAP亞家族基因表達(dá)對低氮條件的快速響應(yīng)及在提高茶樹低氮條件下的氮素利用效率中具有重要作用。

氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)是茶樹體內(nèi)氮代謝的重要一環(huán)，本研究結(jié)合生物信息學(xué)、組織表達(dá)特性以及在不同氮素條件下表達(dá)模式與基因表達(dá)的品種間差異進(jìn)行探究，初步篩選出了氨基酸通透酶亞家族中與茶樹氮代謝聯(lián)系較為緊密的基因，即和。二者在莖中的表達(dá)量較高，莖為植物體內(nèi)長距離運(yùn)輸?shù)闹匾M織部位，推測它們可能參與茶樹中氨基酸由源到庫的運(yùn)輸，但負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的類型仍需進(jìn)一步研究確認(rèn)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，該亞家族基因?qū)Φ偷獥l件有著較快的響應(yīng)，可能在低氮條件下茶樹氮素利用效率的提高等方面發(fā)揮重要作用。

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Molecular Cloning and Expression Analysis ofGene Subfamily in

GUO Lingling, ZHANG Fen, CHENG Hao, WEI Kang, RUAN Li, WU Liyun, WANG Liyuan*

Tea Research Institute, the Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Hangzhou 310008, China

In this study, five sequences of the amino acid permease () genes were successfully cloned from tea cultivar Longjing 43 by RT-PCR. The amino acid sequence alignment analysis revealed the high homology among the five CsAAP proteins (70.27%). Phylogenetic tree based on amino acid sequences showed that five CsAAPs could be classified into three groups. Further bioinformatics analysis demonstrated that these CsAAPs contained 9-10 transmembrane structures and 16-18 conserved AAP motifs. To investigate the response of this subfamily to nitrogen, cutting seedlings of three tea cultivars were fed with NH4NO3of different concentrations after two weeks of nitrogen starvation and then used for qRT-PCR analysis. The results show that these fivewere expressed in all vegetative tissues of tea cutting seedlings, but there were certain differences in tissue expressions. Among them,showed the highest gene expression levels in stems and the main expression sites ofwere roots and stems. The expression levels ofvaried temporallyand spatially with nitrogen treatments. The gene expression ofwas significantly changed among the tea cultivars with different nitrogen use efficiency. The expressions ofandin the stem of the high nitrogen efficient cultivar Zhongcha 302 could quickly respond to low nitrogen levels. Their gene expression levels were increased significantly after 3?h of the low nitrogen treatment. These results implies that CsAAPsubfamily might play important roles in the regulation of nitrogen metabolism through the intricate transports of amino acids in tea plants.

, amino acid permeases (AAPs), gene cloning and expression, nitrogen

S571.1；S154.1

A

1000-369X(2020)04-454-11

2019-09-15

2019-12-12

國家自然科學(xué)基金（31570695）、中央級科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（1610212018004）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CARS-19）、浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大專項(xiàng)（2016C02053）

郭玲玲，女，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種方面的研究。

wangly@tricaas.com

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