邢煥霞 付敏 鄭勝俠 楊琦 韓玉成

隨著人類基因組學、蛋白質組學和代謝組學研究的深入，現已證實葉酸代謝相關的孕期、圍產期合并癥如胎盤早剝、妊娠高血壓綜合征、早產、流產等的發(fā)生和出生缺陷如神經管缺陷、非綜合征性唇腭裂、先天性心臟病、唐氏綜合癥等并不是和葉酸缺乏直接相關，而是和血漿中同型半胱氨酸(HCY)不能正常代謝，在血漿中過量蓄積有密切聯系[1-5]。有研究顯示高HCY 水平刺激血管平滑肌細胞增生，使血管內皮損傷和功能異常，破壞機體凝血和纖溶系統(tǒng)，進而引起妊娠期合并癥一系列癥狀產生[6]。文獻報道有關流行病學顯示有過唐氏綜合癥、神經管畸形和先天性心臟病等病史的母親，以及復發(fā)性流產和妊娠高血壓綜合征的孕婦體內HCY 水平較高[7,8]。國內外研究中證實在動物模型試驗中高HCY 血癥能激發(fā)胚胎細胞過度凋亡，抑制胚胎細胞合成遺傳物質DNA 和RNA，細胞內長期HCY高水平可造成染色體不分離等，導致胎兒生長發(fā)育畸形，嚴重者引起早期胚胎死亡[9,10]。20世紀 90年代初，研究發(fā)現生育過神經管缺陷(NTDs)的孕婦HCY 水平明顯高于對照組,隨后越來越多的研究證明 HCY代謝異常在 NTDs、妊娠高血壓等疾病的發(fā)生上扮演著重要角色。西方學者將HCY稱為“邪惡氨基酸”，它是一種含硫氨基酸，屬于蛋氨酸和半胱氨酸代謝循環(huán)中的中間代謝產物,HCY 代謝主要有兩條途徑，若與這兩條途徑相關的酶或因子的基因突變，可引起 HCY水平升高，HCY水平升高后將產生大量自由基和過氧化氫，從而損傷了血管內皮細胞結構和功能，因此成為NTDs、妊娠高血壓等疾病發(fā)生的高危風險因素。HCY水平還受遺傳因素、膳食營養(yǎng)因素、疾病、年齡等因素影響[11]，喬福元等[11]研究指出孕早期HCY水平可作為妊娠高血壓預測指標之一，孕中期HCY水平可作為診斷早期妊娠高血壓的重要指標。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是Hcy代謝關鍵酶，突變的677堿基C/T使基因頻率多態(tài)化，從而使酶活性下降，可引起Hcy的蓄積。本文擬通過檢測孕期不同階段HCY水平和MTHFR基因頻率，分析孕期不同階段及產后42 d HCY變化與遺傳因素的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院產前診斷中心2016年5月至2019年6月進行孕期檢查的漢族女性，入組人群系廊坊地區(qū)居民，排除標準：(1)籍貫非本省本地區(qū)者；(2)患有甲狀腺疾病、冠心病、惡性腫瘤、糖尿病、免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病者；(3)肝腎功能不全者、曾行腸胃切除手術或患嚴重消化系統(tǒng)疾病者。入組對象922例漢族女性，平均年齡(25.46±3.52)歲。

1.2 方法 利用中國疾病預防控制中心婦幼保健中心指定的采樣拭采集的受檢者口腔黏膜細胞，提取受檢者DNA樣本使用柱式質粒DNA小量抽提試劑盒。采用 Taqman-MGB 技 術 對MTHFR 基因 C677T、A1298C位點的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型進行檢測。探針序列如下：MTHFR A1298C：5’-AAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT[G/T] CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCA-3’；MTHFR C677T:3’-GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG[G/A]CTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA-3’。在每個10 μl反應體系中包含：2 x Taqman Universal MasterMix 5 μl， 20 ng/μl DNA模板 1 μl，去離子水 3.5 μl，20 x Taqman-MGB探針0.5 μl。反應條件設置：95℃下反應10 min，92℃下反應15 s，60℃ 下反應1 min擴增20個循環(huán)，89℃下反應15 s，60℃下反應90 s 擴增30個循環(huán)。反應結束后，利用ABI 7500型的熒光定量PCR檢測儀讀取終點熒光，利用相關分析軟件分析并確定搜集樣本的基因型結果。研究中的相關儀器、試劑購于美國ABI公司。在孕期第10～14周、第24～28周、第32～36周和產后42 d采集孕早期、孕中期和孕晚期入組對象的血樣，使用儀器為貝克曼公司全自動生化免疫分析儀AU680，采用酶法檢測血清HCY濃度，試劑購自艾威德(北京)醫(yī)療科技有限公司。

2 結果

2.1 基因型及等位基因與其他地區(qū)漢族女性比較 選取已報道的地區(qū)級地區(qū)人群數據，與本地區(qū)人群MTHFR基因遺傳多態(tài)性頻率分布情況進行比較。廊坊地區(qū)的漢族女性MTHFR 677TT基因型頻率為33.5%，顯著低于淄博等地人群(P<0.05)，與尚志、長春等地數據差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。MTHFR 1298CC基因型頻率為2.0%，與尚志、烏魯木齊、長春等地數據差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與眉山、長沙等地數據比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 不同地區(qū)漢族女性 MTHFR 基因型頻數和頻率比較[12-21] 例(%)

表2 不同地區(qū)漢族女性MTHFR等位基因頻數和頻率分布比較 例(%)

2.2 基因位點連鎖情況分析 最常見的組合是CT/AA (33.2%),TT/AA (33.3%)，少見的組合是TT/AC(0.2%)，未發(fā)現TT/CC和CT/CC組合。從組合中可以看出，MTHFR其中一個位點突變時，另一個位點突變的概率會降低。見表3。

表3 MTHFR C677T和A1298C連鎖型分布 例(%)

2.3 不同基因型對應的孕期不同階段HCY水平分析 MTHFR C677T位點三種基因型HCY水平均值依次為 CC組3.84 μmol/L，CT組3.85 μmol/L，TT組3.85 μmol/L，經單因素方差分析組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。孕期不同階段HCY水平組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同基因型對應的孕期血清HCY濃度比較

2.4 不同基因型對應的產后42 d HCY水平 從入組人群中選取192位前來我院做產后42 d檢查女性，比較該組人群孕期和產后42 d HCY水平，結果表明產后42 d組HCY水平顯著高于孕期(P<0.05)，MTHFR C677T三種基因型對產后42 d HCY水平比較，TT型較CC型和CT型差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 不同基因型對應的產后42 d血清HCY濃度比較

3 討論

本研究對廊坊地區(qū)孕期女性MTHFR C677T基因頻率研究，得到CC型、CT型、TT型的頻率分別為16.8%、49.7%、33.5%，與2014年報道本地區(qū)TT基因頻率無顯著性差異[22]。本研究進一步發(fā)現 MTHFR C677T 基因頻率與孕期不同階段HCY水平無顯著性差異，與產后42 d高HCY水平存在關聯，MTHFR C677T TT型較CC型和CT型HCY水平有顯著升高，這一研究結論與勞海紅等[23]研究結論不一致。多項研究中證實MTHFR C677T基因頻率多態(tài)性具有地域、種族差異性[24]。復旦大學方綺雯等[25]研究測定了上海地區(qū)1 000例孕婦的MTHFR C677T基因多態(tài)性與HCY水平，結果中顯示攜帶T等位基因孕婦是高同型半胱氨酸血癥的危險因素。本研究對孕期不同階段同型半胱氨酸值做了測定，缺乏孕前期數據， HCY變化還需要檢測孕前數據，以便更準確分析整個孕期HCY數值變化情況。

5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)，它在第一號染色體1p36.3上，全長20.374 kb。MTHFR是Hcy循環(huán)中葉酸代謝關鍵酶，外源性葉酸經人體吸收轉化為四氫葉酸，經MTHFR催化下形成有活性的N5-四氫葉酸，繼續(xù)在甲硫氨酸合成酶(MS)催化葉酸、維生素B12輔酶作用下使HCY甲基化代謝為甲硫氨酸。甲硫氨酸在ATP作用下轉化為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。而SAM可在體內生化反應中提供甲基用于蛋白質及DNA的甲基化。

葉酸是同型半光氨酸代謝途徑中的必須因子，缺乏或代謝異?？蓪е翫NA合成或半胱氨酸代謝途徑受阻，蓄積導致高半胱氨酸血癥。

MTHFR 677堿基C/T基因頻率多態(tài)化，使酶活性下降，導致同型半光氨酸代謝途徑中斷，血液循環(huán)中同型半胱氨酸蓄積濃度升高，引起連鎖生物反應。研究表明同型半胱氨酸蓄積，人體內生化反應甲基化不足，造成染色體分離不全，引起多種胎兒畸形及后續(xù)重要生物活性物質合成障礙；高同型半胱氨酸水平給胚胎神經系統(tǒng)造成不可逆損害，導致神經管缺陷(NTDs)如無腦、脊柱裂等損害；高同型半胱氨酸水平導致血管內皮細胞功能障礙、血管壁彈性下降及附壁粥樣斑塊鈣化明顯，導致心腦血管疾患風險增加。

HCY是一種含硫氨基酸，它的生物學效應具有多樣性，與多種疾病發(fā)生相關。同型半胱氨酸是多種妊娠并發(fā)癥的早期診斷、治療依據之一，如GDM(妊娠糖尿病)、妊娠高血壓綜合征、胎兒生長受限、低體重兒、出生缺陷如神經管缺陷、唐氏綜合征等。高同型半胱氨酸與多囊卵巢綜合征(PCOS)患者高雄激素及胰島素抵抗有密切關聯，亦會影響卵子質量及發(fā)育潛能，導致種植率降低、流產率升高[26]。國內外研究對孕期同型半胱氨酸水平變化與低出生體重、早產、妊娠期高血壓文獻較多，郭燕華等[27]觀察18周內孕婦血清HCY水平等因素對產后胎兒體重、早產結局的影響，結果顯示血清HCY水平越高，新生兒體重偏輕的風險越高，早產和子癇前期發(fā)生率也越高。黃華等[28]研究表明孕中期及孕晚期孕婦血清HCY水平升高，其妊娠期高血壓疾病發(fā)生風險明顯增加，可將血清HCY水平作為評價和預測妊娠期高血壓疾病的可信指標。

綜上，本研究發(fā)現廊坊地區(qū)MTHFR C677T基因頻率多態(tài)性變化對孕期血清同型半胱氨酸水平無顯著性影響，TT型對產后42 d血清同型半胱氨酸水平有顯著性影響。同時多項研究支持高同型半胱氨酸血癥是多種疾病的獨立危險因素[29]，所以針對不同地區(qū)、不同民族、不同孕期階段展開大規(guī)模MTHFR C677T基因頻率多態(tài)性、血清同型半胱氨酸水平及多種疾患相關性研究非常必要，可進一步降低同型半胱氨酸相關妊娠疾病的發(fā)生風險提供科學指導，同時為孕婦提供個體化的干預措施。