董明杰 周艷 段沫 高慶敏 趙建輝

晚期結直腸癌多合并惡性腹水，可導致患者出現(xiàn)腹痛、腹脹等癥狀，對其生存質量造成了極大威脅[1]。由于結直腸癌起病隱匿，且臨床癥狀通常不明顯，往往患者在確診時病程已進入中晚期[2]，此類患者通常已經(jīng)錯過手術治療時機，無法再行手術治療，多推薦行腹腔熱灌注化療[3]。作為一種輔助療法，腹腔熱灌注治療經(jīng)過數(shù)十年發(fā)展，在臨床上得到越來越多的應用，其療效明顯優(yōu)于姑息性全身化療[4,5]。本研究比較了薏苡仁油聯(lián)合順鉑腹腔熱灌注與順鉑單藥腹腔灌注治療結直腸癌惡性腹水的療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年4月至2018年9月在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院外科收治的結直腸癌合并惡性腹水患者60例，均經(jīng)病理組織學或細胞學確診?；颊吣?5例，女25例;年齡40～65歲，平均年齡(50.6±14.9)歲，中位年齡52歲。所有患者 KPS 評分≥60 分，治療前腹腔內未注射過任何藥物,治療距最近一次化療時間>1個月。腹部彩超證實腹腔中存在大量腹腔積液,穿刺置管后送檢腹腔積液中找到癌細胞。所有患者排除腸梗阻、腹腔粘連、腹腔內感染等情況，心電圖、血常規(guī)、肝腎功能等檢查為正常，無化療禁忌。隨機將患者分為試驗組30例和對照組30例，2組一般資料具有均衡性。治療前均經(jīng)患者本人或法定委托人簽署知情同意書。

1.2 試劑 TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。反轉錄試劑盒和熒光定量RT-PCR試劑購自美國Promega公司產品。MDA、SOD酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司。TNF-α、IFN-γ ELISA試劑盒購自武漢生物工程有限公司。TBX4引物購自北京鼎國技術有限公司。

1.3 治療方法 試驗組給予患者薏苡仁油(浙江康萊特公司，100 ml/支)聯(lián)合順鉑(齊魯制藥公司,10 mg/支)治療(薏苡仁油100 ml+順鉑60 mg/m2)，對照組給予順鉑單藥(順鉑60 mg/m2)，2組藥物均溶解于0.9%氯化鈉注射液3 000 ml中。2組患者均在全麻下行腹腔鏡腹腔熱灌注管置入術，術中吸凈腹腔積液，并放置腹腔熱灌注管。術后病情平穩(wěn)后給予腹腔熱灌注治療。灌注前對留置灌注管進行清理，應用0.9%氯化鈉溶液沖洗管道，并與儀器相連。開啟熱灌注化療機，加熱3 000 ml化療液，溫度到38℃后開始灌注，流速控制為100 ml/min，結合患者耐受情況以及指標體征再穩(wěn)定加熱，直至溫度到達43℃，逐漸將灌注流速提高，灌注時間維持60～90 min，設置儀器使腹腔內化療液穩(wěn)定在>2 000 ml，治療過程中予以患者鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、止吐處理，治療后灌注管連接引流袋，確保化療液緩慢排出。治療每24～48小時1 次，共3次。在治療過程中隨時記錄患者的癥狀及出現(xiàn)不良反應。

1.4 觀察指標

1.4.1 臨床治療效果、KPS 評分、不良反應發(fā)生情況：臨床治療效果根據(jù) WHO 癌性胸腹水療效評價：完全緩解(CR)：腹腔積液消失，持續(xù)>1個月；部分緩解(PR)：腹腔積液減少≥50%且持續(xù)>1個月；穩(wěn)定(SD)：腹腔積液減少<50%，并持續(xù)>1個月；進展(PD)：腹腔積液無變化或有增加。治療有效率=(CR+PR)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4.2 生活質量評價：采用 KPS 評分標準。 KPS評分：是Karnofsky(卡氏，KPS，百分法)功能狀態(tài)評分標準。得分越高，健康狀況越好，越能忍受治療給身體帶來的不良作用。提高>10分為改善，下降<10分為惡化，兩者之間為穩(wěn)定。

1.4.3 不良反應：分別在治療前后進行血常規(guī)、肝腎功能等檢查；在治療過程中及治療后進行臨床觀察并記錄發(fā)生的不良反應，如腹痛、腹脹，惡心、嘔吐以及骨髓抑制等情況。按照WHO抗癌藥物不良反應分級，分為0～Ⅳ度，其中>Ⅲ度為重度不良反應。

1.5 檢測指標 檢測治療前及治療1個月后外周血TBX4的mRNA、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IFN-γ、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平。

1.6 檢測方法 分別于治療前后抽取患者清晨空腹靜脈血5 ml，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，-20℃保存用于后續(xù)檢測。

1.6.1 定量RT-PCR檢測治療前后患者外周血中TBX4基因轉錄水平：Trizol 提取患者外周血總RNA，紫外分光光度計檢測其純度和濃度，采用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。與Go Taq? qPCR Master Mix及相應的引物混合后進行PCR擴增。設GAPDH為內參照基因。TBX4基因的引物序列為：上游5’-CCTTCCCCACACACTTCACC-3’，下游5’-AGGGTGGCTTCCTCTCACAC-3’。

1.6.2 ELISA法檢測TNF-α、IFN-γ、SOD、MDA的水平：將凍存的血清置于37℃水浴箱中迅速溶解，從密封袋中取出實驗所需要的板條。每組均設3個復孔(n=3)，預留空白孔。加入備好的血清和標準品，37℃反應 90 min-洗板5次-加入TNF-α生物素化抗體工作液，37℃反應 60 min-洗板5次-加酶結合物工作液(除空白孔外)，37℃反應 30 min-洗板5次-加入顯色底物-終止顯色-測量OD值(450 nm)。繪制標準曲線，讀取相應結果以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線，通過標本的 OD 值在標準曲線上查找對應濃度。IFN-γ、SOD、MDA檢測方法同上。實驗重復3次。

2 結果

2.1 腹腔積液療效比較 試驗組與對照組的有效率分別為83.33%、60.00%(χ2=4.022，P=0.045)。見表1。

表1 腹腔積液療效比較 n=30,例

2.2 生活質量綜合評分比較 灌注后試驗組患者生活質量綜合評分的改善率明顯高于對照組(χ2=4.593，P=0.032)。見表2。

表2 生活質量綜合評分比較 n=30,例

2.3 不良反應發(fā)生率比較 2組患者均完成3次腹腔熱灌注化療，未出現(xiàn)>Ⅲ度不良反應，所有不良反應經(jīng)對癥處理后好轉。試驗組惡心、嘔吐，骨髓抑制，肝功能損害發(fā)生率低于對照組(P<0.05)，腹痛、腹脹發(fā)生率2組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不良反應發(fā)生 n=30,例(%)

2.4 外周血TBX4、TNF-α、IFN-γ、SOD、MDA水平變化 2組患者在治療后外周血TBX4的mRNA、IFN-γ、SOD都比治療前升高，試驗組升高更為明顯(P<0.05)；2組患者治療后血漿TNF-α、MDA水平均比治療前下降，試驗組下降更為明顯(P<0.05)。見表4。

表4 外周血TBX4、TNF-α、IFN-γ、SOD、MDA水平變化

3 討論

晚期結直腸癌合并惡性腹水的患者身體狀態(tài)較差，無法耐受全身化療，另外由于腹膜-血漿屏障，靜脈化療藥物也難以進入腹腔殺滅癌細胞[6]。腹腔熱灌注治療是將含有高濃度化療藥物的液體加熱至42～44℃進行腹腔內循環(huán)灌注，高溫可對腫瘤細造成不可逆性損傷，而腹腔灌注使腹腔的藥物濃度明顯提高，同時藥物作用時間更長，以清除腹腔內的游離癌細胞，殺滅腹腔內的亞臨床病灶，提高治療效果，減輕不良反應[7]。順鉑是第一代鉑類藥物，具有抗癌譜廣、活性強的特點，是目前臨床應用最廣的熱灌注藥物[6,8]。順鉑的作用機制臨床上普遍認為順鉑進入細胞中形成具有高生物活性的水合順鉑，與多種作用靶點相互結合，抑制多種類型腫瘤細胞DNA 以及RNA 的合成，對游離的癌細胞與微小病灶進行滅殺[9]。然而單純的腹腔熱灌注化療治療晚期癌癥惡性腹水的效果并不理想，而薏苡仁油是從中藥薏苡仁中提取的抗腫瘤制劑，實驗證明其能夠抑制腫瘤細胞，具有抗腫瘤效果，并且在中醫(yī)上屬于利水滲濕藥，其藥理作用有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調節(jié)、抗?jié)兗敖笛堑茸饔肹10]。

本研究結果說明薏苡仁油聯(lián)合順鉑腹腔熱灌注治療結直腸癌惡性腹腔積液的臨床效果顯著，相較于單獨使用順鉑腹腔熱灌注治療方法，可顯著改善相關臨床癥狀，且安全性有保障。

另外，我們對治療前后患者外周血中TBX4的mRNA、TNF-α、IFN-γ、SOD和MDA的水平進行了檢測，以探討薏苡仁油聯(lián)合順鉑腹腔熱灌注的治療機制。TBX4基因為T-box轉錄因子家族中的一員，其在胚胎后肢及骨盆的的發(fā)育調中起關鍵作用，并且TBX4基因突變可以導致小髕骨綜合征[11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，TBX4表達與胰腺導管腺癌的分化程度成正相關，并且在Ⅱ期胰腺導管腺癌中，TBX4低表達患者，總體存活率較差，并且是Ⅱ期患者的獨立預后因素[12]。結合TBX4和TBX5在其基因組結構和基因功能是高度相關的，我們推測TBX4可能是一個抑癌基因。炎性因子TNF-α在是一種由巨噬細胞分泌的生物活性多肽，當患有感染、創(chuàng)傷、及自身免疫系統(tǒng)性疾病時，TNF-α水平都會有不同程度的升高[13,14]。最新研究表明其在結直腸癌等多種惡性腫瘤中高表達，并且高水平TNF-α的腫瘤患者往往具有較高的轉移和復發(fā)率[15]。IFN-γ可以在抗腫瘤免疫中發(fā)揮正向免疫調控作用，促進抗原呈遞、激活NK細胞[16]，從而殺傷腫瘤細胞。正常的生理狀態(tài)下，氧自由基的產生與清除處于平衡狀態(tài)，平衡一旦被打破，大量的氧自由基在體內蓄積，產生大量異常代謝產物，引起多種組織細胞的病理性損傷，從而導致了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14,17]。SOD是機體清除氧自由基的特異酶；MDA是脂質在氧自由基作用下過氧化的產物。既往研究表明，腫瘤患者存在SOD活力下降或含量降低[18]，從而導致MDA水平升高。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，上調SOD能降低腫瘤細胞活力，抑制腫瘤細胞的發(fā)生與轉移[19]。

本實驗結果顯示：試驗組患者治療有效率高于對照組，生活質量綜合評分改善率明顯高于對照組，同時試驗組不良反應的發(fā)生率明顯低于對照組。表明薏苡仁油聯(lián)合順鉑腹腔熱灌注治療結直腸癌惡性腹水有較好的效果。