李曉峰 張文瑛 梁鐵生

腦卒中是一種急性腦血管疾病，多因腦部血管破裂或血管阻塞腦組織缺血造成，是老年人群體中的多發(fā)癥狀，具有高死亡率、高致殘率特點(diǎn)，隨著人口老齡化發(fā)展，腦卒中發(fā)病率逐年上升[1]。腦卒中后抑郁是腦卒中后最常見并發(fā)癥之一，病情較重者會(huì)有輕生念頭，對腦卒中患者的術(shù)后康復(fù)具有負(fù)面影響[2]。臨床主要通過家人、社會(huì)關(guān)愛、接受心理治療以及藥物治療，腦卒中后抑郁的發(fā)病機(jī)制尚不明確。腦源性神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是體內(nèi)含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在增加突觸可塑性、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，研究顯示，其與腦卒中后抑郁發(fā)病密切相關(guān)[3]。研究表明，miRNA在腦卒中后抑郁中發(fā)揮重要作用[4]，miR-26b是新近發(fā)現(xiàn)對神經(jīng)元、血管再生具有作用的miRNA[5]，但其在腦卒中后抑郁研究較少，通過miRanda網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示miR-26b與BDNF具有結(jié)合位點(diǎn)，因此本研究主要通過研究miR-26b與BDNF在老年腦卒中后抑郁患者血清內(nèi)表達(dá)關(guān)系以及臨床意義，為腦卒中后抑郁的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年8月至2018年8月本院神經(jīng)內(nèi)科首次確診的腦卒中入院治療患者95例作為研究對象，在確診14 d后根據(jù)漢密爾頓抑郁量表評分標(biāo)準(zhǔn)[6]將患者分為合并抑郁癥組41例(≥20分)與未合并抑郁癥組54例(<8分)并檢測患者NIHSS評分[7]。其中合并抑郁癥組男29例，女12例；年齡50～81歲，平均年齡(61.37±5.12)歲；出血性腦卒中者3例，缺血性腦卒中38例；短暫性腦缺血發(fā)作7例，可逆性神經(jīng)功能障礙9例，進(jìn)展性卒中14例，完全性卒中11例。未合并抑郁癥組男37例，女17例；年齡50～81歲，平均年齡(61.49±5.96)歲；短暫性腦缺血發(fā)作11例，可逆性神經(jīng)功能障礙12例，進(jìn)展性卒中9例，完全性卒中22例。納入標(biāo)準(zhǔn)：無遺傳傾向性疾??；經(jīng)頭部MRI或CT確診腦卒中。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院24 h內(nèi)死亡或家屬放棄治療的；多臟器受損者；合并其他惡性腫瘤者。另選取同一時(shí)期體檢健康者56例作為對照組，其中男42例，女14例；年齡50～81歲，平均年齡(62.04±6.02)歲。3組性別比、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對象知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清標(biāo)本收集：腦卒中患者于入院14 d分組后次日清晨、對照組于體檢當(dāng)日抽取空腹肘部靜脈血5 ml，平均分成2份，均在-4℃、3 000 r/min條件下離心20 min，取上清在-80℃冰箱中保存待測。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(real-time fluorescence quantitative PCR)檢測血清miR-26b表達(dá):取其中一份血清標(biāo)本，按照Trizol試劑盒操作說明書提取血清總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒Superscript Ⅲ將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用熒光定量試劑盒并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血清miR-26b表達(dá)水平，程序?yàn)?5℃預(yù)熱30 s，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，以上3個(gè)步驟重復(fù)40次。miR-26b以U6為內(nèi)參基因，引物序列見下表，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，并對所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-26b相對表達(dá)量。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清BDNF水平:取另一份血清標(biāo)本，使用人腦源性神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子(BDNF)試劑盒(ELISA)(上?？道噬锟萍加邢薰?檢測血清BDNF水平，嚴(yán)格按照操作說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 3組性別比、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與未合并抑郁癥組相比，合并抑郁癥組NIHSS評分顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 3組一般資料比較

2.2 3組受試者血清miR-26b和BDNF水平比較 3組血清miR-26b、BDNF水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，未合并抑郁癥組血清miR-26b、BDNF水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，合并抑郁癥組血清miR-26b水平顯著升高(P<0.05)，血清BDNF水平顯著降低(P<0.05)；與未合并抑郁癥組比較，合并抑郁癥組miR-26b顯著升高(P<0.05)，BDNF水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 3組受試者血清miR-26b和BDNF表達(dá)情況

2.3 老年腦卒中合并抑郁患者血清miR-26b與BDNF水平相關(guān)性分析 Pearson分析顯示，老年腦卒中合并抑郁患者血清miR-26b與血清BDNF水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.604，P<0.05)。見圖1。

圖1 血清miR-26b與BDNF水平相關(guān)性分析

2.4 ROC法評價(jià)血清miR-26b和BDNF水平對腦卒中并發(fā)抑郁的預(yù)測作用 ROC曲線顯示，血清miR-26b水平預(yù)測老年腦卒中患者發(fā)生抑郁的曲線下面積為0.807，截?cái)嘀禐?.35，敏感度為68.3%，特異性為87.0%。血清BDNF水平預(yù)測老年腦卒中患者發(fā)生抑郁的曲線下面積為0.900，截?cái)嘀禐?1.91 ng/ml，敏感度為87.8%，特異性為88.9%。見圖2。

圖2 血清miR-26b、BDNF水平預(yù)測老年腦卒中患者發(fā)生抑郁的ROC分析

2.5 影響腦卒中后抑郁危險(xiǎn)因素logistics回歸分析 將是否發(fā)生抑郁做為因變量，以性別、NIHSS評分、miR-26b、BDNF為自變量并進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示NIHSS評分>27、血清miR-26b水平≥1.35、BDNF≤11.91 ng/ml是影響老年腦卒中患者合并抑郁的危險(xiǎn)因素。見表4。

表4 多元回歸分析

3 討論

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)家族中一員，在海馬體與皮質(zhì)中含量較高，通過與其受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，參與促進(jìn)神經(jīng)元生長、調(diào)節(jié)突觸可塑性等生理活動(dòng)[8]。Eker等[9]通過觀察腦卒中后患者漢密頓抑郁量表與BDNF水平關(guān)系，得出BDNF水平與卒中后抑郁程度相關(guān)。王恒飛[10]研究表明，腦卒中后抑郁患者血清BDNF水平顯著降低。本研究中，腦卒中后抑郁患者血清BDNF水平顯著低于健康者與腦卒中未合并抑郁患者，未合并抑郁患者與健康人血清BDNF水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示患者血清BDNF水平下降可能與卒中后抑郁發(fā)生有關(guān)。經(jīng)ROC曲線分析，血清BDNF水平預(yù)測腦卒中患者發(fā)生卒中后抑郁曲線下面積為0.900，特異性敏感度均>80%，對腦卒中患者抑郁發(fā)生的具有一定預(yù)測價(jià)值，截?cái)嘀禐?1.91 ng/ml，提示老年腦卒中患者血清BDNF水平<11.91 ng/ml時(shí)極可能發(fā)生卒中后抑郁，需提前進(jìn)行干預(yù)治療。

microRNA是一類長約20個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，在生命活動(dòng)發(fā)揮著重要作用[11]。近年研究表明，microRNA在神經(jīng)元的生成及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子生成中扮演重要角色。miR-26b位于人染色體12q14.1[12]，研究顯示，miR-26b在神經(jīng)分化中發(fā)揮著重要作用。本研究中，腦卒中合并抑郁患者血清miR-26b表達(dá)水平顯著低于健康者與腦卒中未合并抑郁患者，而未合并抑郁患者與健康者miR-26b水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-26b可能參與腦卒中后抑郁發(fā)生進(jìn)程。通過miRanda網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示軟件預(yù)測miR-26b與BDNF具有結(jié)合位點(diǎn)，且本研究通過Pearson分析發(fā)現(xiàn)二者在腦卒中合并抑郁患者血清中表達(dá)具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示miR-26b高表達(dá)可能通過下調(diào)BDNF表達(dá)，參與腦卒中患者抑郁發(fā)生進(jìn)程，但具體機(jī)制尚未闡明。進(jìn)一步ROC曲線分析可知，血清miR-26b預(yù)測腦卒中患者發(fā)生抑郁曲線下面積為0.807，截?cái)嘀禐?.35，提示血清miR-26b水平高于1.35時(shí)腦卒中后抑郁的可能性較高，但其特異性為87.0%，敏感度僅為68.3%，低于BDNF的預(yù)測效果，可能由于miR-26b不是影響腦卒中后抑郁的發(fā)生的直接原因，而是通過其他因子影響抑郁發(fā)生，可作為腦卒中后抑郁的輔助預(yù)測指標(biāo)。研究顯示，血清miR-26b高于1.35，血清BDNF低于11.91 ng/ml均是影響腦卒中后發(fā)生抑郁的危險(xiǎn)因素，此外，NIHSS評分也是腦卒中后抑郁的危險(xiǎn)因素[13]。

綜上所述，老年腦卒中后抑郁患者血清miR-26b高表達(dá)，血清BDNF低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)，miR-26b可能通過負(fù)調(diào)控BDNF表達(dá)發(fā)揮作用。檢測腦卒中患者血清miR-26b、BDNF水平對抑郁發(fā)生具有一定預(yù)測作用。但本研究也存在一定不足，選用研究樣本較少，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本。