馬佐鵬 李全成

中耳膽脂瘤(middle ear cholesteatoma)是中耳角化鱗狀上皮的腫瘤性生長(zhǎng)，據(jù)報(bào)道在歐洲每10萬(wàn)人每年7～9人患病[1]，是一種位于中耳的囊形結(jié)構(gòu)，不屬于真性腫瘤，但由于其具備腫瘤組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，且具有侵襲性、擴(kuò)張性、非正常調(diào)控的增殖和變異性，復(fù)發(fā)率高，同時(shí)大多數(shù)患者存在嚴(yán)重的并發(fā)癥，可導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)破壞從而影響正常聽(tīng)力，導(dǎo)致前庭功能障礙、面神經(jīng)麻痹及顱內(nèi)外一系列的并發(fā)癥，甚至引起致命的顱內(nèi)感染。膽脂瘤發(fā)展的基礎(chǔ)是中耳腔中的異位角化上皮細(xì)胞，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。各種分子機(jī)制，如上皮細(xì)胞的分化、增殖[2,3]、上皮細(xì)胞凋亡[4]、炎癥[5]、感染[6,7]骨質(zhì)侵蝕、脂質(zhì)代謝[8,9]和血管生成[10]，都可能在膽脂瘤的發(fā)展和行為中發(fā)揮作用。中耳膽脂瘤由于鼓室負(fù)壓，上皮組織增生及袋狀內(nèi)陷，會(huì)形成缺氧微環(huán)境，缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是細(xì)胞及組織在缺氧條件下產(chǎn)生的一種氧依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子。HIF-1由兩個(gè)亞基組成，分別為HIF-1α和HIF-1β。其中HIF-1α是決定HIF-1轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵蛋白[11]。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與細(xì)胞的增殖凋亡密切相關(guān)[12]。而缺氧狀態(tài)下激活的PI3K/AKT信號(hào)通路是否通過(guò)影響HIF-1α調(diào)節(jié)膽脂瘤細(xì)胞的增殖凋亡從而影響中耳膽脂瘤的發(fā)病成為本研究的重點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)中耳膽脂瘤組織及原代細(xì)胞中HIF-1α及PI3K/AKT信號(hào)通路的表達(dá)，從分子水平研究缺氧環(huán)境對(duì)于膽脂瘤形成的關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 膽脂瘤組織采集:30例中耳膽脂瘤標(biāo)本采集于我院耳鼻喉科住院患者，同時(shí)隨機(jī)選取外耳道骨部正常組織10例為對(duì)照組，術(shù)中新鮮標(biāo)本放入4%的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，作4 μm厚的連續(xù)切片，為后續(xù)HE及免疫組化使用?；颊吆炇鹬橥鈺?shū)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.1.2 原代膽脂瘤細(xì)胞(MEC)培養(yǎng):取5例中耳膽脂瘤組織，置于含有雙抗(P/S)的PBS中，反復(fù)漂洗后，剪成5 cm×5 mm大小，4℃置于中性蛋白酶12 h，后移入膠原酶Ⅰ常溫?fù)u床30 min，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾后加入教師細(xì)胞培養(yǎng)基漂洗，加10%的含血清完全培養(yǎng)基，與37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞融合至80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.1.3 試劑與儀器:胎牛血清(Gibco，美國(guó))，角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))、膠原酶Ⅰ(Gibco，美國(guó))、HIF-1α單克隆抗體(Santacruze，美國(guó))、p-Akt-308單克隆抗體(CST，美國(guó))、p-Akt-492單克隆抗體(CST，美國(guó))、p-PI3K單克隆抗體(CST，美國(guó))、PI3K/Akt抑制劑LY294002(Target mol，美國(guó))、免疫組化試劑盒(碧云天，上海)。CO2培養(yǎng)箱(Therom，美國(guó))、酶標(biāo)儀(BIO-RAD)公司、三氣培養(yǎng)箱(Thermo,美國(guó))、自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(BIO-RAD，美國(guó))垂直電泳儀(BIO-RAD，美國(guó))、Western bolt濕轉(zhuǎn)儀(BIO-RAD，美國(guó))，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 HE染色及免疫組化檢測(cè)膽脂瘤及正常組織中HIF-1α的表達(dá):每個(gè)樣本取HE染色，觀察其病理結(jié)構(gòu)，及病理層次。石蠟切片加熱后二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗后于PBS中浸泡，3%的過(guò)氧化氫去離子水孵育，高壓抗原修復(fù)，山羊血清工作液孵育，滴加HIF-1α一抗，4℃搖床過(guò)夜，PBS沖洗，滴加二抗，室溫孵育后PBS沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，常溫孵育后，PBS清洗，DAB顯色，蒸餾水沖洗后蘇木素復(fù)染，二甲苯透明后封片。HIF-1α在膽脂瘤與正常組織中的表達(dá) 在400倍鏡下選取5個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。判定標(biāo)準(zhǔn)：(-)<10%；(+)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在10%～25%；(++)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在26%～50%；(+++)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%。

1.2.2 膽脂瘤骨質(zhì)破壞程度與HIF-1α的相關(guān)性分析:通過(guò)根據(jù)患者術(shù)前中耳CT結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[13]將膽脂瘤破壞分為3級(jí)：Ⅰ度：盾板和聽(tīng)小骨無(wú)可視的破壞，或僅單個(gè)聽(tīng)小骨破壞；Ⅱ度：鼓室天蓋、2個(gè)或2個(gè)以上的聽(tīng)小骨破壞；Ⅲ度：聽(tīng)小骨完全破壞，且累及骨迷路、外耳道后壁、面神經(jīng)管及內(nèi)耳。對(duì)不同破壞程度與HIF-1α的不同程度陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)進(jìn)行Speraman檢驗(yàn)分析對(duì)膽脂瘤骨質(zhì)破壞程度與HIF-α陽(yáng)性表達(dá)表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.3 常氧及缺氧狀態(tài)下抑制PI3K/Akt通路對(duì)MEC增殖的影響:原代膽脂瘤細(xì)胞培養(yǎng)后 將MEC以1×105種于6孔板，分別與常氧培養(yǎng)箱(95%O2)及缺氧培養(yǎng)箱(1%O2、5%CO2、94%N2)培養(yǎng)，同時(shí)在缺氧及常氧狀態(tài)下給予PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002 50 μm/ml干預(yù)MEC，分別與1 d、3 d、5 d、7 d、9 d進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每次計(jì)數(shù)3個(gè)復(fù)孔，取平均值后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 缺氧條件下，HIF-1α及PI3K/Akt信號(hào)通路的改變:在缺氧條件下，給予LY294002缺氧培養(yǎng)48 h，快速冰上提取蛋白以防止HIF-1α降解，蛋白定量后，95℃煮蛋白定性，培養(yǎng)上樣后，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，BSA封閉，HIF-1α、p-Akt-308、p-Akt-492、p-PI3K一抗封閉，4℃搖床過(guò)夜，洗膜后二抗孵育，配置顯影液，上機(jī)顯影。

2 結(jié)果

2.1 HE染色及免疫組化檢測(cè)膽脂瘤及正常組織中HIF-1α的表達(dá) HE染色后發(fā)現(xiàn)膽脂瘤組織中包含上皮組織、上皮下結(jié)締組織及焦化上皮破碎細(xì)胞成分及膽固醇結(jié)晶鱗狀上皮可見(jiàn)局部乳頭狀生長(zhǎng)，基質(zhì)層中結(jié)締組織疏松，而正常外耳道組織可清楚區(qū)分基底層、棘層、顆粒層、透明層及角質(zhì)層，基質(zhì)層結(jié)構(gòu)整齊。免疫組化發(fā)現(xiàn)在膽脂瘤組織中HIF-1α的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，其中膽脂瘤中HIF-1α的表達(dá)為(++)及(+++)細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 不同組織中HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞所占比例比較

圖1 HE染色后正常耳組織與膽脂瘤組織及HIF-1α的表達(dá)(HE×200)

2.2 膽脂瘤骨質(zhì)破壞程度與HIF-1α的相關(guān)性分析 通過(guò)線性趨勢(shì)檢驗(yàn)(P=0.012)，認(rèn)為膽脂瘤骨質(zhì)破壞程度與HIF-1α的表達(dá)之前存在等級(jí)相關(guān)性，Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)(16.286)，認(rèn)為骨質(zhì)瘤骨質(zhì)破壞程度與HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)，且相關(guān)性較強(qiáng)，即HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)程度越高，脂質(zhì)瘤骨質(zhì)破壞程度越高。見(jiàn)表2。

表2 膽脂瘤不同程度骨質(zhì)破壞與HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性 例

2.3 常氧及缺氧狀態(tài)下抑制PI3K/Akt通路對(duì)MEC增殖的影響 將MEC分別在常氧及缺氧條件下培養(yǎng)，同時(shí)給予PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002干預(yù)48 h，在缺氧培養(yǎng)3 d后，MEC的增殖速度明顯高于常氧培養(yǎng)，在缺氧5 d、7 d后，MEC的增殖較常氧增殖更為迅速。在常氧條件下給予LY294002后，MEC的增殖速度雖有所降低，但前期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在干預(yù)后7 d增殖速度才較常氧降低。在缺氧條件下給予LY294002干預(yù)后，在干預(yù)的3 d MEC的增殖速度明顯降低，而隨著缺氧培養(yǎng)時(shí)間的增加，對(duì)于MEC的增殖抑制作用更為明顯。提示在缺氧條件下，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可以起到抑制MEC增殖的作用。見(jiàn)表3。

表3 不同條件下MEC細(xì)胞增殖的改變

2.4 缺氧條件下，HIF-1α及PI3K/Akt信號(hào)通路的改變 在缺氧條件下培養(yǎng)48 h后，發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達(dá)明顯升高，而PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白PI3K蛋白及Akt蛋白的2個(gè)位點(diǎn)308、492位點(diǎn)都出現(xiàn)了不同程度的升高，說(shuō)明在缺氧條件培養(yǎng)后，PI3K/Akt信號(hào)通路被激活。而給予PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑干預(yù)后，磷酸化PI3K及磷酸化Akt-308、492位點(diǎn)被明顯抑制，與此同時(shí)HIF-1α的表達(dá)也明顯降低。見(jiàn)圖2。

圖2 缺氧條件下，HIF-1α及PI3K/Akt信號(hào)通路的改變

3 討論

中耳膽脂瘤是耳鼻喉科常見(jiàn)的疾病，是一種位于中耳的囊形結(jié)構(gòu)，內(nèi)壁為復(fù)層鱗狀上皮，囊外通過(guò)纖維組織于骨壁或組織相連，在囊內(nèi)充滿脫落上皮組織、角化物及膽固醇結(jié)晶，因此稱為膽脂瘤。膽脂瘤雖非真性腫瘤，但由于其具有侵襲性、快速增殖、破壞骨質(zhì)結(jié)構(gòu)同時(shí)易復(fù)發(fā)的特性，可導(dǎo)致患者嚴(yán)重的聽(tīng)力下降或喪失、前廳功能紊亂，甚至引起顱內(nèi)外并發(fā)癥，影響患者的生命健康。目前對(duì)于膽脂瘤形成機(jī)制主要有“上皮移行學(xué)說(shuō)” “袋狀內(nèi)陷學(xué)說(shuō)”、“鱗狀上皮化生學(xué)說(shuō)”及“基質(zhì)細(xì)胞增殖學(xué)說(shuō)”等[14,15]，但具體機(jī)制并不明確，由于其具有腫瘤的特性，上皮細(xì)胞過(guò)度增殖、骨質(zhì)破壞吸收成為研究的重點(diǎn)。Yu等[16]通過(guò)對(duì)膽脂瘤的基質(zhì)和前基質(zhì)存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)隨著Toll樣受體(TLR)4和促炎細(xì)胞TNF-α和IL-β表達(dá)的增加，但治理路的侵襲能力、骨質(zhì)破壞能力及聽(tīng)力喪失程度都顯著增高，Hmood等[17]通過(guò)對(duì)19例新鮮膽脂瘤組織進(jìn)行前瞻性定量免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67與CK17的表達(dá)較正常組織明顯升高，同時(shí)Ki-67與CK17的表達(dá)與骨侵蝕評(píng)分呈中度正相關(guān)。

膽脂瘤內(nèi)大量的上皮細(xì)胞增殖氧耗量增大，而其內(nèi)部血管生成的速度不能滿足增殖細(xì)胞的需求，同時(shí)鼓室負(fù)壓袋狀內(nèi)陷，使膽脂瘤內(nèi)呈缺氧的狀態(tài)。在多種腫瘤如肺癌[18]、乳腺癌[19]、卵巢癌[20]，缺氧已被證明與腫瘤細(xì)胞的增殖、耐藥、侵襲密切相關(guān)，然而膽脂瘤作為假性腫瘤此方面的研究較少。HIF-1是細(xì)胞核組織在缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生的一種氧依賴的轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α與HIF-1β組成，其中HIF-1α是決定其轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵蛋白。在缺氧條件下，HIF-1已被證明可直接影響腫瘤細(xì)胞的增殖。Kim等[21]通過(guò)惡性間質(zhì)瘤(HMM)進(jìn)行缺氧誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，HMM細(xì)胞的體外克隆形成顯著增加，同時(shí)HMM的侵襲和轉(zhuǎn)移能力都顯著增效，在低密度細(xì)胞的增殖速度遠(yuǎn)高于常氧條件。Bai等[22]在胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)中發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下HIF-1α通過(guò)上調(diào)FoxM1的表達(dá)，促進(jìn)GIST細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、侵襲、轉(zhuǎn)移，在異種移植瘤中進(jìn)一步證實(shí)了HIF-1α及HIF-1β的作用。本研究中，通過(guò)免疫組化檢測(cè)膽脂瘤組織中HIF-1α的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，膽脂瘤較正常耳組織HIF-1α的表達(dá)明顯升高，說(shuō)明膽脂瘤中的缺氧環(huán)境能夠激活缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達(dá)，同時(shí)將膽脂瘤在缺氧條件下培養(yǎng)后，增殖速度明顯高于常氧培養(yǎng)，在缺氧條件下培養(yǎng)5 d、7 d后，膽脂瘤的增殖較常氧增殖更為迅速，這與真性腫瘤的研究相一致。通過(guò)Sperman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，膽脂瘤骨質(zhì)破壞程度與HIF-1α的表達(dá)之前存在等級(jí)相關(guān)性，且呈正相關(guān)，相關(guān)性較強(qiáng)，即HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)程度越高，脂質(zhì)瘤骨質(zhì)破壞程度越高。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、凋亡及分化作用。PI3K及其下游蛋白激酶B(Akt)通路與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，調(diào)節(jié)腫瘤的增殖，并且其異常激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞的惡變。在膽脂瘤中，PI3K/AktT通路可以促使外耳道皮膚角質(zhì)化細(xì)胞從G1期進(jìn)入2期，從而促使細(xì)胞增殖，同時(shí)介導(dǎo)了角質(zhì)化鱗狀上皮的增殖與轉(zhuǎn)移。缺氧條件可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路，同時(shí)PI3K/Akt通路可影響HIF-1α的表達(dá)。劉偉等[23]在腎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)激活PI3K/Akt信號(hào)通路可通過(guò)提高HSP90蛋白的表達(dá)抑制HIF-1α的降解，從而使HIF-1α的表達(dá)相對(duì)增加。Huang等[24]通過(guò)THP-1細(xì)胞建立缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)缺氧可以誘導(dǎo)Aktlin的磷酸化，從而激活PI3K/Akt信號(hào)通路。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧培養(yǎng)后，磷酸化PI3K蛋白及Akt蛋白的2個(gè)位點(diǎn)308、492位點(diǎn)均出現(xiàn)了明顯的升高。由于磷酸化的PI3K能夠促使細(xì)胞質(zhì)膜上產(chǎn)生PIP3，促使PDK1磷酸化Akt蛋白的s308位點(diǎn)從而活化Akt蛋白，同時(shí)磷酸化的Thr473蛋白也可以激活A(yù)kt蛋白[25]，因此可以認(rèn)為缺氧條件培養(yǎng)后，PI3K/Akt信號(hào)通路被激活。而在常氧條件下培養(yǎng)的膽脂瘤給予LY294002后，膽脂瘤細(xì)胞的增殖速度雖有所降低，但降低速度較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在缺氧條件下給予LY294002后，膽脂瘤的增殖速度較同等條件下培養(yǎng)明顯降低，說(shuō)明在缺氧條件下抑制被激活的PI3K/Akt信號(hào)通路可以明顯抑制膽脂瘤的表達(dá)，而在常氧條件下，可能由于PI3K/Akt通路本身處于未激活狀態(tài)或未完全激活狀態(tài)，故效果不明顯。在給予PI3K/Akt通路抑制劑后，可以發(fā)現(xiàn)磷酸化PI3K及磷酸化Akt-308、492位點(diǎn)被明顯抑制，與此同時(shí)HIF-1α的表達(dá)也明顯降低，說(shuō)明當(dāng)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)HIF-1α具有正向調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，缺氧條件可以促進(jìn)膽脂瘤細(xì)胞的增殖，HIF-1α在膽脂瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，同時(shí)與膽脂瘤造成的骨質(zhì)破壞程度呈正相關(guān)。而在缺氧條件下被激活的PI3K/Akt信號(hào)通路在缺氧條件下可以調(diào)節(jié)膽脂瘤細(xì)胞的增殖，并且對(duì)HIF-1α具有正向調(diào)節(jié)作用。通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可以減緩膽脂瘤的增殖速度，其可能機(jī)制是PI3K/Akt通路通過(guò)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。本研究為膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制提高了理論依據(jù)，并為膽脂瘤的防治提供了新的靶點(diǎn)與思路。