彭代笠 何毅明 蘇晟田 李遠(yuǎn)發(fā)

胃癌(gastric carcinoma)是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是我國成人最為常見的惡性腫瘤，我國每年新增約50萬胃癌患者，占全球的1/3，略高于發(fā)達(dá)國家(4%～5%)[1,2]。胃癌發(fā)病男女比約為3∶1，女性年發(fā)病率為2.8%，男性年發(fā)病率為8.5%，發(fā)病年齡高峰為40～60歲，由于幽門螺桿菌的感染、工作壓力增大、飲食結(jié)構(gòu)的改變，胃癌呈現(xiàn)年輕化傾向[2]。胃癌早期無明顯癥狀，但極易轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，探討胃癌的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義[3,4]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lnc RNA)是長度>200個核苷酸的非編碼 RNA。研究表明,lnc RNA在劑量補(bǔ)償效應(yīng)(dosage compensation effect)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用。lnc RNA H19與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)，能激活miR-101和miR-217，上調(diào)?；撬嵴{(diào)節(jié)基因1(TUG1)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖分化[5,6]。SIRT6是NAD+依賴型第Ⅲ類HDAC家族成員，通過乙?；揎椂喾N基因的表達(dá)，對癌癥、心血管疾病、糖尿病具有重要調(diào)控作用，研究表明，SIRT6為抑癌基因，其機(jī)制與SIRT6調(diào)控細(xì)胞周期、修復(fù)紊亂DNA、影響腫瘤細(xì)胞能量代謝途徑、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[7-9]。因此，本研究探討lnc RNA H19和SIRT6在胃癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系，為胃癌的治療提供理論及臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年6月至2015年12月在我院行手術(shù)治療并經(jīng)病理證實(shí)的胃癌患者132例為胃癌組，其中男86例，女46例;年齡47～68歲，平均年齡(56.24±1.28)歲;病程4個月～13年，平均病程(5.13±0.36)年；患者腸化生輕度72例，中度31例，重度29例；異型增生輕度45例，中度49例，重度38例；病變位置：胃體63例，胃竇69例；腺癌98例，鱗癌34例；胃鏡下評分，初次評分為29.31～34.28分，平均(32.11±1.89)分。符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)(NCCN)公布的2013 版《Gastric Cancer,Version 2.2013》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。同時取距胃癌組織>5 cm的正常胃黏膜為癌旁組。患者自愿提供正常胃黏膜及胃癌組織標(biāo)本，分析lnc RNA H19和SIRT6的表達(dá)。患者預(yù)計(jì)生存期均>3 個月，未患有其他腫瘤，術(shù)前均未接受放化療治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過；患者均知情同意，且簽署知情同意書。

1.2 lnc RNA H19和SIRT6 mRNA水平測定 獲取正常胃黏膜及胃癌組織總lnc RNA H19和SIRT6 mRNA，測定濃度和純度，參照GenBank 數(shù)據(jù)庫，設(shè)計(jì)待測基因位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，按20 μl模板和50 μl反應(yīng)液構(gòu)成 PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增程序：95℃ 5 min;93℃10 s，61℃ 30 s，重復(fù)40個循環(huán)，61℃時采集熒光。實(shí)時熒光定量 PCR儀檢測其表達(dá)量。見表1、2。

表1 lnc RNA H19、SIRT6引物序列

1.3 免疫組化法測定lnc RNA H19和SIRT6在正常胃黏膜及胃癌組的表達(dá)水平 常規(guī)制作免疫組化切片。閱片采用雙盲法，lnc RNA H19和SIRT6蛋白主要定于細(xì)胞核，呈黃色或棕黃色，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，同時計(jì)數(shù)；>50%為(+++)，26%～50%為(++)，6%～25%為(+)，陽性細(xì)胞≤5% 為 (-)，(-)及(+)為不表達(dá)組或低表達(dá)組即陰性，(++)及(+++)為高表達(dá)組即陽性。

2 結(jié)果

2.1 2組lnc RNA H19、SIRT6 mRNA表達(dá)水平比較 胃癌組lnc RNA H19 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組、SIRT6 mRNA表達(dá)水平低于癌旁組(P<0.05)。見表3。

表3 2組lnc RNA H19、SIRT6 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 lnc RNA H19、SIRT6在2組中的免疫組化陽性率比較 lnc RNA H19、SIRT6呈黃色或深棕黃色顆粒，定于細(xì)胞核；胃癌組lnc RNA H19陽性102例、SIRT6陽性98例，胃癌組lnc RNA H19陽性率高于癌旁組，SIRT6陽性率低于癌旁組(P<0.05)。見表4，圖1。

表4 lnc RNA H19、SIRT6在2組中的免疫組化陽性率比較 n=132,例(%)

圖1 lnc RNA H19、SIRT6在癌旁組、胃癌組的表達(dá)(免疫組化×200)；A:lnc RNA H19在癌旁組中表達(dá); B:lnc RNA H19在胃癌組中表達(dá);C:SIRT6在癌旁組中表達(dá); D:SIRT6在胃癌組中表達(dá)

2.3 lnc RNA H19、SIRT6蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 lnc RNA H19、SIRT6蛋白表達(dá)與年齡無相關(guān)性(P>0.05)；與淋巴血管間隙浸潤、病理學(xué)分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、復(fù)發(fā)、腫瘤最大徑相關(guān)性明顯(P<0.05)。見表5。

表5 lnc RNA H19、SIRT6蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 n=132,例(%)

2.4 lnc RNA H19、SIRT6蛋白表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后分析 lnc RNA H19陰性組3年生存率及生存期均明顯高于lnc RNA H19陽性組,SIRT6陽性組3年生存率及生存期均明顯高于SIRT6陰性組(P<0.05)。見表6,圖2。

表6 lnc RNA H19、SIRT6蛋白表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后分析

圖2 lnc RNA H19、SIRT6陽性、陰性Kaplan-Meier生存曲線分析

3 討論

lnc RNA 是基因轉(zhuǎn)錄過程中附加產(chǎn)生的無編碼蛋白質(zhì)功能的基因產(chǎn)物，其長度約為200個核苷酸序列。研究發(fā)現(xiàn)lnc RNA在各種腫瘤中異常表達(dá)，可作為原癌基因或抑癌基因，是腫瘤潛在的靶治療點(diǎn)以及預(yù)后標(biāo)志物[11]。lnc RNA H19為表觀遺傳學(xué)分子，其通過高度甲基化印跡控制區(qū)第 6個CTCF的結(jié)合位點(diǎn)(the sixth CTCF binding site,CBS6)，導(dǎo)致IGF2 基因的印跡缺失，誘導(dǎo)IGF2 高表達(dá),從而使得癌細(xì)胞惡性增殖、分化轉(zhuǎn)移[12,13]。原癌基因c-fos、cyclin E、c-Jun、c-Myc、Aurora-A均為Notch lnc RNA H19作用底物，其可促進(jìn)c-fos、cyclin E、c-Myc、c-Jun、Aurora-A的表達(dá)，而上述原癌基因的過表達(dá)，往往意味著細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、以及癌細(xì)胞的增殖分化[14,15]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組lnc RNA H19 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組(P<0.05)，胃癌組lnc RNA H19陽性率高于癌旁組(P<0.05)；說明lnc RNA H19在胃癌中高表達(dá)，為原癌基因，與上述討論符合。此外，lnc RNA能通過TGFβ/Smads 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制TGF-β1的表達(dá)，使得癌細(xì)胞逃逸TGF-β1的生長抑制；此外lnc RNA與酪氨酸受體形成異源二聚化，促進(jìn)自身磷酸化，激活大量下游促癌因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白介素-2、6(IL-2、6)、腫瘤壞死因子(TNF)等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。本研究中，lnc RNA H19蛋白表達(dá)與年齡相關(guān)性不明顯;與淋巴血管間隙浸潤、病理學(xué)分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、復(fù)發(fā)、腫瘤最大徑相關(guān)性明顯，且有淋巴血管間隙浸潤、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度越深、有復(fù)發(fā)、腫瘤最大徑≥5 cm,lnc RNA H19蛋白陽性表達(dá)率越高,說明lnc RNA H19具有促進(jìn)胃癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、遷移的生物學(xué)功能。

SIRT6基因是抑癌基因，其目標(biāo)底物E2F1在DNA損傷或致癌信號影響下具有増加S期細(xì)胞數(shù)量和抑制調(diào)亡的作用，SIRT6能去乙?；疎2F1，降低E2F1表達(dá)水平，提示SIRT6可作為抑癌因子抑制腫瘤的發(fā)生[17]。此外SIRT6其編碼蛋白的NADPH結(jié)合域能靶定位醇、酚、醌等羥基化合物并與其結(jié)合域形成同源二聚體，形成羥基化合物-NADPH- SIRT6蛋白，而此SIRT6二聚體的C-末端的域會招募結(jié)合酶(Cdc34、Ubc4、E2)催化向底物分子蛋白轉(zhuǎn)移，進(jìn)行P-450還原化[18]。若SIRT6表達(dá)過低，還原酶P-450活性降低，還原化過程受阻，而Akt/RAS/MEK/ERK信號通路激活，細(xì)胞增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移及損傷修復(fù)功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[19]。本研究中，胃癌組SIRT6 mRNA表達(dá)水平低于癌旁組(P<0.05)，胃癌組SIRT6陽性率低于癌旁組(P<0.05)，說明在胃癌中，SIRT6基因是抑癌。有研究表明，乳腺癌及卵巢癌患血清SIRT6降低，而BRCA1水平升高，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)患者血清調(diào)亡抑制survivin水平下調(diào)，提示低水平的SIRT6能乙?；痵urvivin啟動子H3K9,導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化；此外，SIRT6低表達(dá)可激活WNT信號通路，將細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin主動轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中，與TCF/LEF的同源異構(gòu)區(qū)域結(jié)合，導(dǎo)致靶基因過度表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡機(jī)制失衡，細(xì)胞大量增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。本研究中,SIRT6蛋白表達(dá)與年齡相關(guān)性不明顯;與淋巴血管間隙浸潤、病理學(xué)分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、復(fù)發(fā)、腫瘤最大徑相關(guān)性明顯，且有淋巴血管間隙浸潤、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度越深、有復(fù)發(fā)、腫瘤最大徑≥5 cm,SIRT6蛋白陽性表達(dá)率越低，說明SIRT6具有抑制胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，lnc RNA H19陰性組3年生存率及生存期均明顯高于lnc RNA H19陽性組,SIRT6陽性組3年生存率及生存期均明顯高于SIRT6陰性組(P<0.05)；說明lnc RNA H19低表達(dá)、SIRT6高表達(dá)的胃癌患者能獲得較好的預(yù)后。

綜上所述，胃癌患者中l(wèi)nc RNA H19表達(dá)升高、SIRT6表達(dá)降低，其與腫瘤增殖、浸潤、遷移密切相關(guān)；lnc RNA H19低表達(dá)、SIRT6高表達(dá)的胃癌患者能獲得較好的預(yù)后。