楊大興 單延具 張欣亮 王雷

急性痛風(fēng)發(fā)作是一種顯著的炎性反應(yīng)，通常出現(xiàn)在關(guān)節(jié)中。炎癥過程是由周圍組織中尿酸鈉晶體的沉積引發(fā)的。臨床上，痛風(fēng)與關(guān)節(jié)的水腫、紅斑以及嚴(yán)重的疼痛有關(guān)[1-3]。研究表明，尿酸鈉的關(guān)節(jié)內(nèi)注射引起的癥狀與臨床痛風(fēng)癥狀相似。尿酸鈉的關(guān)節(jié)內(nèi)注誘發(fā)關(guān)節(jié)腫脹，跛行和傷害感受行為，包括機(jī)械異常性疼痛和熱痛覺過敏，并且還觀察到中性粒細(xì)胞強(qiáng)烈浸潤(rùn)到關(guān)節(jié)間隙[4]。中性粒細(xì)胞在關(guān)節(jié)液和滑膜中積聚，產(chǎn)生促炎性介質(zhì)，引發(fā)膜溶解。已經(jīng)證明尿酸鈉可以上調(diào)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中促炎蛋白，誘導(dǎo)炎性因子(IL-2、IL-6、TNF-α)的過表達(dá)。Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)在識(shí)別激動(dòng)劑中起重要作用，如炎性產(chǎn)物等[5-7]。TLR2是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要跨膜蛋白。核因子最終激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)轉(zhuǎn)錄因子是TLR2調(diào)控下的重要細(xì)胞因子，TLR2、NF-кB可調(diào)控炎性因子的激活。黃芪甲苷是從黃芪上提取出來的高純度藥物，黃芪多糖中的主要有效成份是多糖和黃芪苷[8,9]。黃芪甲苷可增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高機(jī)體的抗炎能力。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷顯著抑制脂多糖(LPS)刺激的巨噬細(xì)胞中的炎性因子iNOS和COX-2的表達(dá)，對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的炎癥和慢性收縮性損傷誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)病變具有顯著的抗傷害作用[10,11]。因此本研究擬重點(diǎn)探討黃芪甲苷對(duì)尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的防治機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及染毒 SPF級(jí)Wistar大鼠(250～300 g)120只，12周齡，體重250～300 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK(渝)2018-0001]，將大鼠單籠圈養(yǎng)于有機(jī)玻璃籠中，并在溫度(22±1)℃，自動(dòng)控制晝夜循環(huán)(12/12 h)的條件下自由獲得的食物和水。大鼠的使用經(jīng)北京積水潭醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。盡量減少動(dòng)物的痛苦并減少使用的動(dòng)物數(shù)量。在該研究期間，每只大鼠僅使用1次。根據(jù)體重隨機(jī)分成6組：對(duì)照組、模型組、秋水仙堿組(30.0 mg/kg)、黃芪甲苷低劑量組(10.0 mg/kg)、黃芪甲苷中劑量組(20.0 mg/kg)、黃芪甲苷高劑量組(40.0 mg/kg)，每組20只，雌雄各半。

1.2 藥物、儀器及試劑 尿酸鈉(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：170927)；秋水仙堿(廣州亮化化工有限公司，CAS64-86-8，99.95%，批號(hào)：171218)，大鼠用藥量為成人的20 倍；TLR2、NF-кB、IL-2、IL-6、TNF-α Elisa試劑盒(上海樊克生物科技有限公司，批號(hào)：171123、180107、171220、171029、171025)；rizol RNA提取試劑和逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(美國(guó)的Invitrogen公司，批號(hào)：AH4127)；TLR2、NF-кB RNA定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒(賽蘭博、中國(guó)，批號(hào)：171208、171213)；LightCycler TePCR熱循環(huán)儀(瑞士Roche公司)。

1.3 方法

1.3.1 尿酸鈉溶液的制備：將1 g尿酸鈉溶解在200 ml 含有6 ml 1 N NaOH的沸水中，再通過加入HCl的方法將最終溶液的pH值調(diào)節(jié)至7.2。將溶液冷卻并在室溫下攪拌，然后在5℃下儲(chǔ)存過夜。從溶液中過濾出沉淀物，在低溫下干燥并通過250-pm金屬絲網(wǎng)篩分。 然后將尿酸鹽晶體在10%吐溫80的0.9%NaCl溶液中混合。在空氣/O2混合物中用2.5%異氟烷麻醉。

1.3.2 6模型組的制備:對(duì)照組、模型組，每天給予腹腔注射0.9%氯化鈉(3 ml/kg)，持續(xù)7 d；秋水仙堿組(30.0 mg/kg)、黃芪甲苷低劑量組(10.0 mg/kg)、黃芪甲苷中劑量組(20.0 mg/kg)、黃芪甲苷高劑量組(40.0 mg/kg)每天給予腹腔注射相應(yīng)藥物，持續(xù)7 d。模型組、秋水仙堿組、黃芪甲苷各劑量組將制備的尿酸鈉注射到右踝關(guān)節(jié)中誘導(dǎo)急性痛風(fēng)，對(duì)照組注射0.9%氯化鈉溶液。試驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行大鼠關(guān)節(jié)炎癥的積分(注射后6 h分別對(duì)6組大鼠進(jìn)行評(píng)定關(guān)節(jié)炎癥積分)

1.4 機(jī)械痛閾(paw withdrawl mechanical threshold，PWT)及熱刺激潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)的測(cè)定 6組大鼠處死前，根據(jù)文獻(xiàn)方法測(cè)定PWT、PWTL[12]。

1.5 TLR2、NF-кB在膝關(guān)節(jié)滑膜組織中表達(dá)的測(cè)定 使用Trizol Reagent從膝關(guān)節(jié)滑膜組織中提取總RNA。將750 μl TrizolLS試劑(Invitrogen)與250粉碎的膝關(guān)節(jié)滑膜組織混合。渦旋混合30 s后靜置5 min，加入200 μl氯仿。將Trizol-氯仿混合物渦旋混合15 s，然后在4℃以12 000×g離心15 min。將上層水相轉(zhuǎn)移到新管中。最后，按照制造商的說明提取RNA。使用Smart Spec Plus分光光度計(jì)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)定量總RNA。A260/A280比率用于評(píng)估RNA純度。 RT和qPCR試劑盒(Takara，大連)，TLR2的引物序列為：5’-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3’(正向)和5’-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3’(反向)；NF-кB的引物序列為：5’-CTTAGTCTTTGTCTGGTACG-3’(正向)，5’-CCTTTGAAAGTCGTTCGACCCTGAGT-3’(反向)。實(shí)時(shí)PCR一式三份進(jìn)行，并計(jì)算TLR2、NF-кB的相對(duì)表達(dá)使用比較循環(huán)閾值(CT)(2-ΔΔCT)方法，以甘油醛3磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)源對(duì)照來標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，引物序列為：5’-GTACTCT

GTTTGACGTCGACT-3’(正向)和5’-CCTCGATTATAGACTATCTGA-3’(反向)。并使用公式2-ΔΔCT計(jì)算TLR2、NF-кB的相對(duì)表達(dá)量。其中ΔCT=(CT TLR2/NF-кB-CT GAPDH)。

1.6 ELISA測(cè)定大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、NF-кB、IL-2、IL-6、TNF-α蛋白水平 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、NF-кB、IL-2、IL-6、TNF-α蛋白水平，具體操作見試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)大鼠PWT、PWTL、關(guān)節(jié)炎癥積分的影響 模型組PWT、PWTL評(píng)分低于對(duì)照組，關(guān)節(jié)炎癥積分高于對(duì)照組(P<0.05)；黃芪甲苷各劑量組PWT、PWTL評(píng)分高于模型組，關(guān)節(jié)炎癥積分低于模型組(P<0.05)，且隨著黃芪甲苷給藥劑量的增加，PWT、PWTL評(píng)分逐漸升高，關(guān)節(jié)炎癥積分逐漸降低(P<0.05)；黃芪甲苷低、中劑量組PWT、PWTL評(píng)分低于秋水仙堿組，關(guān)節(jié)炎癥積分高于秋水仙堿組(P<0.05)；高劑量組PWT、PWTL評(píng)分、關(guān)節(jié)炎癥積分與秋水仙堿組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 黃芪甲苷對(duì)大鼠PWT、PWTL、關(guān)節(jié)炎癥積分的影響

2.2 黃芪甲苷對(duì)6組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜結(jié)構(gòu)的影響 對(duì)照組踝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)正常(約1～3層)，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組滑膜增厚，滑膜細(xì)胞排列紊亂，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；秋水仙堿組及黃芪甲苷組高劑量組關(guān)節(jié)滑膜結(jié)構(gòu)較為完整，炎性反應(yīng)較模型組輕，伴少量壞死滑膜細(xì)胞壞死，中性粒細(xì)胞為少量、分散浸潤(rùn)；黃芪甲苷組中、低劑量組較模型組而言，踝關(guān)節(jié)壞死滑膜細(xì)胞減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見圖1。

圖1 黃芪甲苷對(duì)6組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜結(jié)構(gòu)的影響(HE染色×400)；A 對(duì)照組；B 模型組；C 秋水仙堿組；D 黃芪甲苷低劑量組；E 黃芪甲苷中劑量組；F 黃芪甲苷高劑量組

2.3 6組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜TLR2、NF-кB mRNA表達(dá)水平比較 模型組關(guān)節(jié)TLR2、NF-кB mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)；黃芪甲苷各劑量組TLR2、NF-кB mRNA表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)，且隨著黃芪甲苷給藥劑量的增加，TLR2、NF-кB mRNA表達(dá)水平逐漸降(P<0.05)；黃芪甲苷低、中劑量組TLR2、NF-кB mRNA表達(dá)水平高于秋水仙堿組(P<0.05)；高劑量組TLR2、NF-кB mRNA表達(dá)水平與秋水仙堿組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 6組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜TLR2、NF-кB mRNA表達(dá)水平比較

2.4 6組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜TLR2、NF-кB 蛋白表達(dá)水平比較 模型組關(guān)節(jié)TLR2、NF-кB 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)；黃芪甲苷各劑量組TLR2、NF-кB 蛋白表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)，且隨著黃芪甲苷給藥劑量的增加，TLR2、NF-кB 蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)；黃芪甲苷低、中劑量組TLR2、NF-кB 蛋白表達(dá)水平高于秋水仙堿組(P<0.05)；高劑量組TLR2、NF-кB 蛋白表達(dá)水平與秋水仙堿組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 6組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜TLR2、NF-кB 蛋白表達(dá)水平比較

2.5 6組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較 模型組關(guān)節(jié)IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)；黃芪甲苷各劑量組IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)，且隨著黃芪甲苷給藥劑量的增加，IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)；黃芪甲苷低、中劑量組IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平高于秋水仙堿組(P<0.05)；高劑量組IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平與秋水仙堿組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 6組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

痛風(fēng)是一種醫(yī)學(xué)病癥，通常以急性炎癥性關(guān)節(jié)炎的反復(fù)發(fā)作為特征，臨床上表現(xiàn)關(guān)節(jié)，特別是大腳趾關(guān)節(jié)觸痛、灼熱、腫脹。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的明確診斷是基于滑液或痛風(fēng)中尿酸晶體的鑒定。尿酸晶體是最有效的促炎刺激物，對(duì)高尿酸尿晶體的先天性免疫反應(yīng)與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理學(xué)密切相關(guān)[12,13]。尿酸微晶體對(duì)炎癥細(xì)胞活化是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的核心特征，促炎性微晶可以與所有主要的滑膜細(xì)胞類型相互作用，包括中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣(B型)滑膜細(xì)胞。在單核細(xì)胞中，尿酸晶體刺激許多促炎細(xì)胞因子的合成，如IL-1，IL-6，IL8和TNF-α。研究已發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎患者的血清中TNF-α、IL-1β等細(xì)胞炎性因子過表達(dá)，并與急性和慢性關(guān)節(jié)炎疾病有關(guān)。在與宿主細(xì)胞接觸后，尿酸晶體誘導(dǎo)一系列膜事件，其觸發(fā)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，吞噬作用和細(xì)胞因子產(chǎn)生。進(jìn)入細(xì)胞后，尿酸晶體進(jìn)一步引發(fā)炎癥小體激活并誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，誘發(fā)全譜炎癥。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞對(duì)尿酸晶體晶體吞噬作用后的TNF-α、IL-1β等在炎性反應(yīng)的起始和傳播中起重要作用。黃芪甲苷能抑制脂質(zhì)過氧化，發(fā)揮抗炎癥活性，并表現(xiàn)出抗?jié)冏饔谩?/p>

本次研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷各劑量PWT、PWTL評(píng)分高于模型組，關(guān)節(jié)炎癥積分低于模型組，這說明黃芪甲苷能明顯降低尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疼痛。結(jié)合病理學(xué)研究結(jié)果，對(duì)照組踝關(guān)節(jié)滑膜組織厚度正常，滑膜細(xì)胞分布均勻且排列整齊(約1～3層)，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組滑膜增厚，滑膜細(xì)胞排列紊亂，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；秋水仙堿組及黃芪甲苷組高劑量組關(guān)節(jié)滑膜結(jié)構(gòu)較為完整，炎性反應(yīng)較模型組輕，伴少量壞死滑膜細(xì)胞壞死，中性粒細(xì)胞為少量、分散浸潤(rùn)；黃芪甲苷組中、低劑量組較模型組而言，踝關(guān)節(jié)滑膜局部粗糙不平，壞死滑膜細(xì)胞減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。這說明，黃芪甲苷能抑制尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

TLRs是先天免疫受體，其通過檢測(cè)病原體及外源性化合物的常見分子結(jié)構(gòu)來保護(hù)宿主免受微生物感染或外源性毒物的攻擊。在十個(gè)人TLR亞家族成員中，識(shí)別其與TLR1或TLR6相關(guān)的配體；這些配體主要是外源性化合物分子，如脂肽，脂磷壁酸和肽聚糖[14,15]。TLR2在前哨免疫細(xì)胞中表達(dá)，包括樹突狀細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。TLR2由一個(gè)配體結(jié)合胞外域，跨膜結(jié)構(gòu)域和Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域，啟動(dòng)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)。然后TLR信號(hào)激活NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)，這兩者都進(jìn)一步誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子。 NF-κB是一種關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，通常由p50和p65亞基組成。 已經(jīng)有研究確定NF-κB調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，因此在免疫和炎性反應(yīng)中具有重要作用[16-18]。本次研究結(jié)果顯示，模型組關(guān)節(jié)TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組；黃芪甲苷各劑量組TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達(dá)水平低于模型組，且隨著黃芪甲苷給藥劑量的增加，TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達(dá)水平逐漸降；黃芪甲苷低、中劑量組TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達(dá)水平高于秋水仙堿組；高劑量組TLR2、NF-кB mRNA表達(dá)水平與秋水仙堿組無明顯差異。而黃芪甲苷后可抑制IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白水平。這說明黃芪甲苷能通過抑制炎癥信號(hào)通路TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達(dá)水平的表達(dá)進(jìn)而抑制炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α的表達(dá)。

綜上所述，黃芪甲苷能明顯抑制尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，其機(jī)制與黃芪甲苷能通過抑制炎癥信號(hào)通路TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達(dá)水平的表達(dá)進(jìn)而抑制炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α的表達(dá)有關(guān)。