席志楊，覃遠(yuǎn)漢，潘競(jìng)，涂立，蹇淑娟

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021

腎間質(zhì)纖維化(RIF)是各類腎臟病進(jìn)展至終末期腎病的共同特征，其發(fā)生發(fā)展與腎小管上皮細(xì)胞(RTEC)損傷密切相關(guān)[1]。缺氧是最常見的RTEC損傷原因之一，可能導(dǎo)致RTEC的壞死性凋亡。壞死性凋亡作為一種具有壞死特征的細(xì)胞程序性死亡，是細(xì)胞死亡的重要形式[2,3]。抑制細(xì)胞壞死性凋亡可限制腎臟細(xì)胞的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制腎臟細(xì)胞死亡，對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用[4]。研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)表達(dá)改變與細(xì)胞壞死性凋亡的發(fā)生密切相關(guān)[5]。2019年3月～2020年1月，本研究觀察了PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮預(yù)處理對(duì)缺氧誘導(dǎo)RTEC壞死性凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：大鼠RTEC細(xì)胞株NRK-52E購于中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞庫。主要試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基、超濾胎牛血清均購于美國HyClone公司，羅格列酮試劑購于美國Sigma公司；兔單克隆一抗PPARγ購于美國SAB公司，兔單克隆一抗受體交互作用蛋白1(RIP1)、RIP3購于美國CST公司。

1.2 細(xì)胞分組處理 將NRK-52E細(xì)胞置于含10%胎牛血清及1%雙抗的高糖DEME培養(yǎng)基中，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞融合80%時(shí)傳代，接種到新的培養(yǎng)瓶中；待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合60%～70%時(shí)，更換新的培養(yǎng)基。將細(xì)胞隨機(jī)分為羅格列酮組、缺氧模型組及正常對(duì)照組。羅格列酮組給予15 μmol/L羅格列酮進(jìn)行預(yù)處理，缺氧模型組及羅格列酮組置于含95% N2和5% CO2混合氣體的缺氧小室中，正常對(duì)照組置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中，各組均培養(yǎng)48 h。

1.3 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 將各組細(xì)胞消化離心后，棄去培養(yǎng)基，沿離心管管壁緩慢加入預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液固定4 h。4 ℃條件下0.1 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液清洗細(xì)胞3次，每次2 h；1%鋨酸溶液浸泡2 h，4 ℃條件下0.1 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液清洗細(xì)胞2次，每次15 min。4 ℃條件下依次用50%、70%、80%乙醇脫水10 min，90%乙醇脫水15 min，純叔丁醇溶液脫水15 min。室溫條件下進(jìn)行滲透、包埋過夜及固化。光鏡下用半薄切片機(jī)定位固化好的樣本，再用超薄切片機(jī)將樣本切成50 nm厚度的超薄切片，進(jìn)行枸櫞酸鉛溶液染色。透射電鏡下觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4 細(xì)胞PPARγ、RIP1、RIP3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。4 ℃條件下，1 2000 r/min離心15 min，吸取上清；按照4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸變性，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。5%脫脂牛奶室溫下封閉1.5 h，加入PPARγ、RIP1、RIP3、β-actin特異性一抗(稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃條件下孵育過夜，TBST溶液洗膜3次×10 min。加入二抗(稀釋比例均為1∶10 000)，室溫條件下孵育1.5 h，TBST溶液洗膜3次×10 min。以發(fā)光液覆蓋PVDF膜，孵育1 min后，采用Carestrecm Image Station化學(xué)發(fā)光儀掃描PVDF顯影。采用Alpha View軟件檢測(cè)條帶灰度值，計(jì)算PPARγ、RIP1、RIP3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果 正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)完整，線粒體無腫脹，細(xì)胞核無破裂，核仁無固縮。缺氧模型組及羅格列酮組均出現(xiàn)細(xì)胞腫脹，線粒體明顯腫脹，細(xì)胞核及染色質(zhì)固縮；羅格列酮組線粒體腫脹、細(xì)胞核及染色質(zhì)固縮現(xiàn)象均較缺氧模型組減輕。

2.2 各組細(xì)胞PPARγ、RIP1、RIP3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 缺氧模型組、羅格列酮組和正常對(duì)照組細(xì)胞PPARγ蛋白相對(duì)表達(dá)量依次升高、RIP1及RIP3蛋白相對(duì)表達(dá)量均依次降低，組間兩兩比較P均<0.05。見表1。

表1 各組細(xì)胞PPARγ、RIP1、RIP3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 PPARγ與RIP1、RIP3蛋白相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析結(jié)果 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PPARγ與RIP1、RIP3蛋白相對(duì)表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為-0.608、-0.317，P均<0.05)。

3 討論

RIF是各類腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的共同特征，目前認(rèn)為RIF的發(fā)生發(fā)展與RTEC損傷密切相關(guān)。凋亡和壞死是細(xì)胞死亡的兩種經(jīng)典模式，而壞死性凋亡是一種不同于凋亡和壞死的新型細(xì)胞死亡途徑，是具有壞死特征的細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子是Caspase[6]，但有研究顯示,負(fù)責(zé)細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)傳導(dǎo)通路是腫瘤壞死因子α(TNF-α) /腫瘤壞死因子受體(TNFR)受體信號(hào)通路；該通路被激活時(shí)，即便抑制Caspase也不能阻止細(xì)胞凋亡，而是使細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一種具有壞死形態(tài)學(xué)特征的死亡模式[3,7]。Krysko等[8]將這種特殊的細(xì)胞死亡形式首次命名為壞死性凋亡。壞死性凋亡同時(shí)具有壞死的細(xì)胞質(zhì)和凋亡的細(xì)胞核，主要變現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，各細(xì)胞器如線粒體腫脹甚至空泡化，核染色質(zhì)固縮邊聚，多呈月牙狀[9]。壞死性凋亡作為一種重要的細(xì)胞死亡形式，其調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)及阻斷機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及一系列分子的表達(dá)及調(diào)控[3,10]。研究證實(shí)，壞死性凋亡主要由RIP1、RIP3活化介導(dǎo)，二者是壞死性凋亡發(fā)生的關(guān)鍵，也是其特異性標(biāo)志[10,11]。抑制腎臟細(xì)胞的壞死性凋亡可以減輕炎癥因子表達(dá)、限制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大，從而減輕腎臟細(xì)胞損傷，對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用[4]。本研究結(jié)果顯示，缺氧模型組、羅格列酮組透射電鏡下可見線粒體明顯腫脹、細(xì)胞核及染色質(zhì)固縮，兩組壞死性凋亡特異性蛋白R(shí)IP1、RIP3蛋白表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，且缺氧模型組上述變化更顯著；提示缺氧可導(dǎo)致RTEC壞死性凋亡，羅格列酮預(yù)處理可減輕缺氧造成的RTEC壞死性凋亡。

PPARγ表達(dá)改變與壞死性凋亡的發(fā)生關(guān)系密切。在膿毒癥導(dǎo)致心功能不全大鼠模型中，激活PPARγ可減少心肌細(xì)胞的壞死性凋亡，從而提高膿毒癥大鼠的存活率；提示上調(diào)PPARγ可抑制心肌細(xì)胞的壞死性凋亡，減輕感染導(dǎo)致的心功能不全[5]。PPARγ表達(dá)異常與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)缺血再灌注損傷大鼠應(yīng)用羅格列酮可上調(diào)其PPARγ表達(dá)，并增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，從而減輕腎臟組織損傷[12,13]。研究發(fā)現(xiàn)，活化氨基末端激酶通路可上調(diào)糖尿病小鼠胰島細(xì)胞及腎小球系膜細(xì)胞PPARγ表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，在改善胰島素抵抗的同時(shí)減輕了腎臟損傷，提示PPARγ可能具有減輕腎臟損傷的作用[14,15]。本研究結(jié)果顯示，缺氧模型組和羅格列酮組PPARγ蛋白表達(dá)均顯著低于正常對(duì)照組，且缺氧模型組降低更明顯；提示羅格列酮減輕RTEC壞死性凋亡的機(jī)制可能與其上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá)有關(guān)。