江葉舟，彭瑤，李點

湖南省胸科醫(yī)院，長沙410006

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染誘發(fā)形成，主要臨床病理特征為患者肺部出現(xiàn)典型結(jié)核結(jié)節(jié)及肺部干酪樣細(xì)胞壞死，最終形成空洞[1]。肺泡巨噬細(xì)胞(AM)在肺部損傷及病原菌防御中具有重要作用，可通過吞噬、免疫應(yīng)答清除微生物和感染異物[2]。在多種因素影響下，AM能釋放炎癥因子，也可釋放抗炎癥介質(zhì)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在肺結(jié)核發(fā)病過程中具有重要作用[3]。miR-223作為高度保守的miRNA之一，可通過抑制其靶基因表達對炎癥反應(yīng)的狀態(tài)進行調(diào)控。研究表明，miR-223表達下降可促進肺結(jié)核患者的炎癥反應(yīng)[4]。2019年12月～2020年1月，本研究觀察了miR-223對肺結(jié)核大鼠AM吞噬能力的影響，并探討其可能的機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：雄性SD大鼠40只，16～17周齡，體質(zhì)量(225±11)g，購自長沙天勤生物科技有限公司。主要試劑：TRIzol試劑購自浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司，RT-PCR檢測試劑盒購自上海優(yōu)予生物科技有限公司；臺式低溫離心機購自美國Stoelting公司，恒溫?fù)u床購自成都蘇凈科學(xué)器材有限公司。miR-223 mimics及其陰性對照質(zhì)粒均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成。

1.2 動物分組與建模干預(yù) 將40只雄性SD大鼠隨機分為miR-223組、模型組、陰性對照組和正常對照組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，miR-223組、模型組、陰性對照組胸部備皮、消毒，以5號針頭從右側(cè)肋弓角頂點緊貼劍突側(cè)緣進行胸腔穿刺，進針1 cm左右，注入結(jié)核分枝桿菌懸液0.2 mL，拔針后穿刺部位壓迫止血2 min；正常對照組注射等量生理鹽水[5]。血液檢查及結(jié)核菌素試驗證實肺結(jié)核建模成功后，miR-223組、陰性對照組分別經(jīng)尾靜脈注射miR-223 mimics及其陰性對照質(zhì)粒2 mg/kg，模型組、正常對照組注射等量生理鹽水。

1.3 AM分離 各組繼續(xù)喂養(yǎng)6周后，無菌環(huán)境下進行全身麻醉，打開胸腔，將肺部取出，斷髓處死。用PBS多次清洗肺葉，流式細(xì)胞術(shù)分離小鼠AM，經(jīng)膠原酶Ⅳ消化后獲得單細(xì)胞懸液。導(dǎo)入到EP管中，1 500 r/min離心5 min；PBS沖洗，在加入RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中重懸細(xì)胞。培養(yǎng)2～3 h，吸除上清，PBS沖洗3次；將10 μg/mL脂多糖(LPS)加入培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h；收集細(xì)胞懸液前2 h,加入非經(jīng)典型自噬抑制劑Brefeldin A(BFA)，棄上清，胰蛋白消化后收集AM。

1.4 AM吞噬能力觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。將濃度為0.04 mg/mL的FITC-E.coli懸液注入到各組AM培養(yǎng)基中，無光條件下孵育4 h。無機鹽溶液和平衡鹽溶液洗滌后，采用流式細(xì)胞儀檢測AM的平均熒光強度(MFI)和吞噬FITC-E.coli的陽性細(xì)胞(形成吞噬熒光微球)百分比(簡稱吞噬陽性細(xì)胞百分比)，MFI、吞噬陽性細(xì)胞百分比越高表明吞噬能力越強。

1.5 AM形態(tài)學(xué)觀察 采用HE染色。取各組AM，制備細(xì)胞爬片，甲醛固定20 min；PBS沖洗3次，蘇木精和伊紅染色液進行復(fù)染，時間分別為6～8 min、10 s。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。200倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6 AM中miR-223、STAT3 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。取各組AM，胰蛋白酶消化，TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR引物序列：miR-223上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′、下游引物5′-TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA-3′，STAT3上游引物5′-GCGGCAGTTTCTGGCCCCTT-3′、下游引物5′-CGGGCCACAATCCGGGCAAT-3′，內(nèi)參β-action上游引物5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′、下游引物5′-GACGTAGCACAGCTTCTCCTTAATG-3′。PCR反應(yīng)條件：60 ℃預(yù)變性，10 min；95 ℃變性，72 ℃退火，各30 s；95 ℃延伸，共循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計算miR-223、STAT3 mRNA相對表達量。

1.7 AM中STAT3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取各組AM，以1×105/孔接種于6孔板。加入細(xì)胞裂解液，按照4∶1的比例將提取的蛋白溶液和緩沖溶液混勻，煮沸變性。電泳板孔內(nèi)注入蛋白樣品50 μg，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加脫脂奶粉封閉1 h，TTBS漂洗10 min×3次。加入STAT3及內(nèi)參GAPDH一抗(稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。加入二抗(稀釋比例1∶5 000)，常溫條件下封閉1 h，37 ℃條件下孵育45 min。TTBS漂洗10 min×3次，DAB顯色。采用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值，計算STAT3蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組AM吞噬能力比較 與正常對照組比較，miR-223組、模型組、陰性對照組MFI及吞噬陽性細(xì)胞百分比均降低，且模型組、陰性對照組降低更明顯(P均<0.05)。模型組與陰性對照組MFI及吞噬陽性細(xì)胞百分比比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組AM吞噬能力比較

2.2 各組AM細(xì)胞形態(tài)比較 正常對照組AM細(xì)胞質(zhì)狀態(tài)及細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核居中較多，未見吞噬顆粒聚集；miR-223組AM細(xì)胞質(zhì)狀態(tài)及細(xì)胞形態(tài)較好，細(xì)胞核居中或偏移，少量吞食顆粒聚集；陰性對照組、模型組AM細(xì)胞吞噬顆粒聚集，細(xì)胞核偏移較為嚴(yán)重。見圖1。

注：A為miR-223組，B為模型組，C為陰性對照組，D為正常對照組。

2.3 各組AM中miR-223、STAT3 mRNA及蛋白表達比較 與正常對照組比較，miR-223組、模型組、陰性對照組miR-223相對表達量均降低，STAT3 mRNA及蛋白相對表達量均升高，且模型組、陰性對照組變化更明顯(P均<0.05)。模型組與陰性對照組miR-223、STAT3 mRNA及蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組AM中miR-223、STAT3 mRNA及蛋白相對表達量比較

3 討論

肺結(jié)核是由于肺結(jié)核桿菌感染所引起的慢性傳染性呼吸系統(tǒng)疾病，病情嚴(yán)重者甚至可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥[6]。研究證實，肺結(jié)核發(fā)病后會激活巨噬細(xì)胞中的多個炎癥因子，加上結(jié)核分枝桿菌感染，巨噬細(xì)胞吞噬病菌后不能將其完全消除，逐漸出現(xiàn)外源性凋亡[7]。miR-223廣泛存在于哺乳動物中，具有組織特異性，參與細(xì)胞增殖及組織生長，在一定程度上可抑制正常細(xì)胞再生[8]。相關(guān)文獻報道，miR-223在肺結(jié)核患者體內(nèi)可發(fā)揮雙重作用，在抑制中性粒細(xì)胞趨化引起的肺組織損傷的同時，還可降低巨噬細(xì)胞中STAT3、NF-κB等表達，通過抑制巨噬細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗結(jié)核免疫的作用[9～11]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組AM的MFI及吞噬陽性細(xì)胞百分比明顯下降、細(xì)胞形態(tài)明顯變差、miR-223表達明顯降低，說明肺結(jié)核會導(dǎo)致大鼠AM吞噬能力下降及miR-223表達降低；而升高大鼠miR-223表達后，大鼠AM的MFI及吞噬陽性細(xì)胞百分比明顯升高，細(xì)胞形態(tài)變好。這表明過表達miRNA-223可增強AM的吞噬能力，并有助于恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)。

miR-223可調(diào)控機體多種靶基因，在炎癥反應(yīng)和感染免疫應(yīng)答中調(diào)控作用顯著。STAT通路是調(diào)控細(xì)胞因子的重要通路，STAT3主要被IL-6家族細(xì)胞因子(如IL-11、LIF)通過gpl30受體活化，并受到促炎和抑炎細(xì)胞因子的調(diào)控[5]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3與巨噬細(xì)胞的吞噬能力密切相關(guān)[12]。STAT3在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核的相關(guān)信號傳遞中發(fā)揮重要作用，STAT3缺乏是巨噬細(xì)胞不正常的表現(xiàn)之一，無STAT3表達的巨噬細(xì)胞對炎癥因子及結(jié)核分枝桿菌十分敏感[13]。STAT可參與炎癥因子的活化，通過激酶反應(yīng)使其磷酸化，磷酸化的STAT對特定靶基因予以調(diào)控，進行細(xì)胞核內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白進行抗炎級聯(lián)反應(yīng)，最終影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[13,14]。miR-223、STAT3均與炎癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但其相關(guān)性及對肺結(jié)核大鼠吞噬細(xì)胞的影響尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，miR-223在TLR配體刺激后的表達下調(diào)伴隨著STAT3表達升高，miR-223靶點預(yù)測發(fā)現(xiàn)STAT3的3′UTR區(qū)有miR-223的非保守結(jié)合位點，說明miR-223可通過直接靶向STAT3而調(diào)控炎癥反應(yīng)[15]。本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核大鼠AM中的STAT3蛋白表達明顯高于正常大鼠，而當(dāng)升高細(xì)胞miR-223表達后肺結(jié)核大鼠AM中的STAT3蛋白表達明顯降低；結(jié)合既往研究結(jié)果，說明miR-223對肺結(jié)核大鼠AM吞噬能力的影響可能是通過降低STAT3表達而實現(xiàn)的。

綜上所述，肺結(jié)核大鼠AM中miR-223表達降低，過表達miR-223可增強AM的吞噬能力，其機制可能與抑制STAT3信號通路有關(guān)。