喻嬋 王卓 李穩(wěn)磊 張熾明 朱瑤瑤 任建聰 林忠偉

1廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科（廣州510080）；2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科（廣州510080）；3中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管及甲狀腺外科（沈陽(yáng)110000）

據(jù)2018年中國(guó)心血管病報(bào)告顯示，我國(guó)心血管病的發(fā)病人數(shù)仍在持續(xù)增加，并處于快速增長(zhǎng)水平［1］。腹主動(dòng)脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是一種在人群發(fā)病率近5%的退行性心血管疾病［2-3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)AAA 病死率高達(dá)50%～70%，而破裂性AAA 的病死率已經(jīng)高達(dá)80%～95%［4-5］。臨床目前普遍認(rèn)為腹主動(dòng)脈瘤體直徑≥5 cm 時(shí)有外科手術(shù)指征［6］，但近年臨床研究顯示單純根據(jù)瘤體直徑并不能確切預(yù)測(cè)AAA 破裂風(fēng)險(xiǎn)。因此，AAA 的預(yù)防與治療、疾病產(chǎn)生及演變的機(jī)制成為研究重點(diǎn)，而如何控制其發(fā)展變化，減少不必要的手術(shù)尤為必要。

Fibulin-3 是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白［7］，廣泛表達(dá)于包括脈管系統(tǒng)［7-8］在內(nèi)的各種組織中。Fibulin-3參與基底膜的組織和彈性纖維的形成［9］，同時(shí)與其他基質(zhì)蛋白相互作用，形成錨定結(jié)構(gòu)以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移［10］。此外，F(xiàn)ibulin-3 促進(jìn)血管生成［11］并參與各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑［12-13］。Fibulin-3以前被認(rèn)為是動(dòng)脈生長(zhǎng)因子［11］，注射Fibulin-3 蛋白會(huì)增加自發(fā)性高血壓大鼠的主動(dòng)脈壁厚度，其功能與對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）的調(diào)節(jié)有關(guān)［14-15］。動(dòng)脈壁的破壞是AAA 的關(guān)鍵機(jī)制之一，F(xiàn)ibulin-3 在AAA 患者中的表達(dá)情況未有研究深入探討。因此本研究的目的是探索及驗(yàn)證AAA 患者中是否存在Fibulin-3 基因的表達(dá)異常，初步分析其在AAA 中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料收取2017年9月至2019年11月廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院和門(mén)診診斷為AAA 患者20例，其中男16例，女4例，平均年齡（64.850 ± 9.343）歲；體檢健康人20例，其中男15例，女5例，平均年齡（60.30 ± 9.24）歲［1］；同時(shí)收集在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管/甲狀腺外科接受開(kāi)放手術(shù)AAA 組患者腹主動(dòng)脈組織標(biāo)本10例；收集器官移植外科器官捐獻(xiàn)者正常腹主動(dòng)脈組織標(biāo)本10例。AAA 組：CT/3D-CTA 顯示腹主動(dòng)脈瘤徑＞5.5 cm，其中E-D 綜合征、馬凡綜合征、其他已知的血管及結(jié)締組織疾病患者除外。健康對(duì)照組：超聲或CT 結(jié)果顯示無(wú)腹主動(dòng)脈及其他血管、結(jié)締組織疾病人群。本研究的開(kāi)展經(jīng)廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入對(duì)象均簽署了項(xiàng)目知情同意書(shū)。

1.2 材料Human Fibulin 3（FBLN3）ELISA Kit 購(gòu)自Bioswamp 公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）檢測(cè)試劑盒、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自中國(guó)cloud-clone 公司；TRIzol Reagent 試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；Bestar?qPCR RT Kit（gDNA Remover）、Bestar?one step RT qPCR kit（Sybr Green）試劑購(gòu)于中國(guó)DBI Bioscience 公司；Fibulin-3 Antibody、GADPH Antibody 購(gòu)自中國(guó)ABGENT 公司；ECL 發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millpore 公司；PCR 引物由中國(guó)華大基因公司構(gòu)建。

1.3 酶聯(lián)反應(yīng)吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)收集血液，3 500 r/min 離心5 min，取上清操作。根據(jù)說(shuō)明書(shū)比例稀釋標(biāo)準(zhǔn)品后加樣，37℃溫育1 h；棄去液體，再每孔加檢測(cè)溶液A 工作液，37℃溫育1 h；洗滌后每孔加檢測(cè)溶液B 工作液，37℃溫育30 min；洗板5次，加TMB 底物溶液，37℃避光顯色30 min；每孔加終止溶液終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.4 熒光定量PCR 檢測(cè)Trizol 提取血管組織中的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣本的OD值和濃度，取1 μg 總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，2 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行SYBR 熒光定量RT-PCR，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃5 s、60 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)，然后95 ℃15 s、60 ℃30 s、95 ℃15 s 退火，內(nèi)參選用GAPDH，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值，設(shè)至少3 個(gè)復(fù)孔。Fibulin-3 引物序列（5′-3′）：-上游：GTCACAGGACACCGAAGAAAC，-下游：TTGCATTGCTGTCTCACAGGA；GADPH 引物序列：-上游：GATCGTGGAAGGGCTAATGA，-下游：GACTTTGCCTACAGCCTTGG。mRNA 定量由Takara 公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀系統(tǒng)軟件分析。

1.5 Western blot收集血管壁后嚴(yán)格按照核蛋白提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，取得的上清運(yùn)用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，配置10%的SDS-PAGE 凝膠，每個(gè)樣本上樣量為20 μg，電泳后進(jìn)行200 mA 2 h 轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4°C 孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，用ECL 發(fā)光試劑孵育后使用化學(xué)發(fā)光成像儀獲取蛋白條帶。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件及Graphpad prism7.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料的比較入選病例中AAA 組總膽固醇（TC）高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；兩組間性別、年齡、是否吸煙、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、是否有高血壓或糖尿病等臨床基本情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 血清中Fibulin-3、MMP-2 及MMP-9 表 達(dá)對(duì)兩組人群血清進(jìn)行ELISA 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與健康對(duì)照組相比較，AAA 患者血清中Fibulin-3 表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。AAA 組血清中MMP-2 及MMP-9 的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 腹主動(dòng)脈組織中Fibulin-3 的mRNA 表達(dá)RT-PCR 結(jié)果顯示，在AAA 患者組織中，F(xiàn)ibulin-3的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組［（0.07 ± 0.02）vs.（1.00±0.02），t=31.42，P＜0.01］。以上結(jié)果提示，在mRNA 水平，F(xiàn)ibulin-3 在AAA 患者中表達(dá)降低。見(jiàn)圖1。

表1 入選病例臨床基礎(chǔ)資料比較Tab.1 Comparison of the clinical data of patients

表2 兩組血清中Fibulin-3、MMP-2 及MMP-9 表達(dá)量的比較Tab.2 Comparison of relative expression of Fibulin-3、MMP-2 and MMP-9 in two groups ±s，ng/mL

表2 兩組血清中Fibulin-3、MMP-2 及MMP-9 表達(dá)量的比較Tab.2 Comparison of relative expression of Fibulin-3、MMP-2 and MMP-9 in two groups ±s，ng/mL

注：**P ＜0.05

組別Fibuiln-3 MMP-2 MMP-9健康對(duì)照組（n=20）82.95±11.07 17.08±3.35 27.12±4.17 AAA 組（n=20）55.45±6.28**39.00±5.59**65.95±4.50**t 值9.48 14.94 27.97 P 值＜0.01＜0.01＜0.01

圖1 各組標(biāo)本中Fibulin-3 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Comparison of relative expression of Fibulin-3 mRNA in two groups

2.4 腹主動(dòng)脈組織中Fibulin-3的蛋白表達(dá)Western blot 結(jié)果顯示，在AAA 患者組織中，F(xiàn)ibulin-3 的蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于健康對(duì)照組［（0.05±0.01）vs.（0.20 ± 0.02），t= 10.4，P＜0.01］。以上結(jié)果提示，在蛋白表達(dá)水平，F(xiàn)ibulin-3 在AAA 患者中表達(dá)降低。見(jiàn)圖2。

圖2 各組標(biāo)本中Fibulin-3 的蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Comparison of relative expression of Fibulin-3 protein in two groups

2.5 Fibulin-3預(yù)測(cè)腹主動(dòng)脈瘤診斷的受試者ROC曲線分析血清ELISA 的Fibulin-3 ROC 曲線下面積為0.945，特異度和靈敏度分別為0.899 和0.995，具有較高的診斷價(jià)值。通過(guò)最大約登值確定Fibulin-3 對(duì)應(yīng)的最佳臨界點(diǎn)為70.106 ng/mL。見(jiàn)表3。圖3。

表3 Fibulin-3 受試者ROC 曲線分析Tab.3 Analysis of ROC curves of Fibulin-3 in serum

3 討論

圖3 血清Fibulin-3 ROC 曲線圖Fig.3 ROC curve of Fibulin-3 in serum

AAA是最常見(jiàn)的高致死率血管外科疾病之一，當(dāng)腹主動(dòng)脈直徑擴(kuò)張超過(guò)正常動(dòng)脈直徑的50%時(shí)，即可診斷為AAA。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）被破壞是AAA 關(guān)鍵的病理生理機(jī)制之一，其中彈力蛋白與膠原蛋白為ECM的主要成分，兩者在內(nèi)環(huán)境中所保持的相對(duì)平衡是維持血管壁功能的原因之一，而與此機(jī)制聯(lián)系最緊密的是MMPs，MMPs 水平的下調(diào)可以抑制AAA 進(jìn)展［16-18］。AAA 中的確存在著MMPs 的過(guò)表達(dá)情況，特別是MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)水平升高［19］。MMPs 的過(guò)表達(dá)可以降解Ⅳ型膠原蛋白、蛋白聚糖核心蛋白和彈性蛋白，導(dǎo)致動(dòng)脈瘤的發(fā)生。MMPs 活性及表達(dá)上升是AAA 典型的病理變化之一［20］，膠原蛋白被炎癥細(xì)胞分泌的大量MMPs 所降解，而膠原蛋白分解的產(chǎn)物又進(jìn)一步的促使一系列不同的炎性細(xì)胞高表達(dá)，釋放炎癥因子介導(dǎo)ECM 及平滑肌細(xì)胞的減少，從而加重AAA；而動(dòng)脈擴(kuò)張的直接因素就是動(dòng)脈脈壁中層彈性纖維的損傷和降解。有研究證實(shí)，AAA 中MMP-9 酶原的水平升高，蛋白水解酶的活性增加，且隨著MMP-9 酶原水平的升高，AAA 的破裂風(fēng)險(xiǎn)增加［21-22］。

現(xiàn)階段對(duì)于Fibulin-3 的研究主要集中在腫瘤、盆腔和眼睛黃斑變性等疾病的研究，對(duì)Fibulin-3 的功能的了解還處于早期，在心血管方面的研究尚且不多。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)Fibulin-3 能修復(fù)高血壓損傷的內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，通過(guò)給大鼠注射外源性Fibulin-3 蛋白后，可出現(xiàn)明顯的血壓降低，胸主動(dòng)脈管壁厚度增加，彈性纖維橫徑増大，同時(shí)具有抑制血管壁中MMP-2、MMP-9 水平以及血管壁氧化應(yīng)激作用［14，23］。本研究采用ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AAA 患者血清中Fibulin-3 的表達(dá)情況，再次證實(shí)在AAA 組中表達(dá)顯著降低；血清中MMP-2 與MMP-9 水平升高，與之前的研究結(jié)果相同。Fibulin-3 基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和新生血管形成，F(xiàn)ibulin-3 可能是高血壓血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)因子［24］；AngII 抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，并通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞Fibulin-3 基因的表達(dá)，F(xiàn)ibulin-3 基因?qū)τ诰S持血管內(nèi)皮的生理功能具有重要作用［8，14，23，25］。近年研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮也直接或者間接參與了AAA 的病變，通過(guò)分泌多種物質(zhì)調(diào)節(jié)血管壁中其他細(xì)胞的功能［26-28］。

本研究發(fā)現(xiàn)AAA 組患者TC 水平升高，提示TC水平的變化與AAA 的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系，與馮國(guó)飛等［29］研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究對(duì)兩組臨床標(biāo)本進(jìn)行熒光定量PCR 及Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Fibulin-3 情況，結(jié)果表明Fibulin-3 在AAA 患者中也明顯低于健康人群水平，該結(jié)果與ELISA 結(jié)果相同。這表明在血管壁中，也存在Fibulin-3 水平增高會(huì)導(dǎo)致MMP-2 和MMP-9 水平的降低，反之，F(xiàn)ibulin-3 表達(dá)量的減少，則可能導(dǎo)致MMP-2、MMP-9 等MMPs 水平升高，使得腹主動(dòng)脈壁中膠原蛋白及彈力蛋白減少，從而使得動(dòng)脈壁逐漸進(jìn)一步擴(kuò)張惡化形成動(dòng)脈瘤。

曲線下面積（AUC）大小反映ROC 的價(jià)值，當(dāng)AUC 值處于0.7～0.9 之間提示評(píng)估試驗(yàn)的準(zhǔn)確性高，數(shù)值越接近1 越理想［30］。本研究中對(duì)于血清Fibulin-3 ROC 曲線分析結(jié)果提示，其具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，準(zhǔn)確度較高。但因其臨床數(shù)據(jù)納入較少，導(dǎo)致其數(shù)據(jù)穩(wěn)定性和變異性有一定差異，下一步應(yīng)該擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究，可進(jìn)一步增強(qiáng)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，完善臨床研究的方案。

綜上所述，F(xiàn)ibulin-3 可能在AAA 的發(fā)病中具有十分重要的作用，且對(duì)AAA 的形成具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。