韓國雄 年蔚 劉彥民 李文倩 解友邦

青海省人民醫(yī)院1血液科，2老年病科，3心血管內科（西寧810007）

基因療法臨床試驗已成功應用于血紅蛋白病，例如鐮狀細胞?。╯ickle cell disease，SCD）和β地中海貧血。β-珠蛋白基因座控制區(qū)的一些相關的轉錄因子決定了血紅蛋白的轉換以及基因的高水平，紅系特異性表達在β-globin 位點。慢病毒載體是將大的DNA 元件插入非分裂的造血干細胞中的有效工具，基因組編輯可以恢復胎兒血紅蛋白的表達或靶標特異性突變以恢復野生型β-珠蛋白基因的表達［1］。轉錄因子GATA-1 及其下游靶標核紅系轉錄因子2（nuclear factor erythroid 2，NFE2）和弗里德白血病病毒插入位點1（friend leukemia virus integration 1，F(xiàn)LI1）在造血干細胞分化過程中負責確定紅細胞和巨核細胞譜系。研究表明無論治療方案或突變狀態(tài)如何，原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）患者與骨髓纖維化（myelofibrosis，MF）患者相比，骨髓中GATA-1 mRNA 和蛋白均上調，而FLI1 表達明顯下調，NFE2表達不受GATA-1 mRNA 水平變化的影響，可作為ET 和MF 鑒別診斷中的標記［2］。能在體外由人多能干細胞（human pluripotent stem cells，hPSC）產(chǎn)生血細胞及其前體可能會對人類健康產(chǎn)生重大影響。有報道發(fā)現(xiàn)過度表達GATA1、FLI1 和轉錄激活樣因子1（transcription activator-like 1，TAL1）對hPSC 進行正向編程會導致產(chǎn)生大量祖細胞，這些祖細胞可以分化為巨核細胞或成熟紅細胞，紅細胞或巨核細胞的命運是由FLI1 表達水平?jīng)Q定的，與培養(yǎng)條件無關，早期的FLI1 表達對于程序化細胞增殖潛力至關重要，而其隨后的沉默或維持則分別決定了紅細胞或巨核細胞的命運，這為探究hPSC 正向編程的分子機制和應用于輸血醫(yī)學提供了思路［3］。故本實驗選擇高海拔缺氧環(huán)境引起的慢性高原病（chronic mountain sickness，CMS）患者作為研究對象，探索缺氧環(huán)境對與造血調控密切相關的低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）和紅系轉錄因子的影響，并在K562 細胞中進行體外觀察，為進一步探討CMS 的發(fā)病機制及治療提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選擇青海省人民醫(yī)院2017年8月至2018年7月的30例CMS 患者（根據(jù)CMS 青海標準診斷［4］）作為觀察組，其中男23例，女7例，平均年齡（45.2±11.4）歲。選擇白細胞輕度減少，白細胞計數(shù)（3.5～4.0）× 109/L，并排除血液系統(tǒng)及其他疾病的患者30例作為對照組，其中男20例，女10例，平均年齡（42.7±13.2）歲。

體外實驗選擇K562 細胞作為研究對象，由慢病毒作為載體轉染K562 細胞對HIF-1α基因表達進行過表達和干擾操作，并在培養(yǎng)箱常氧狀態(tài)下（5% CO2，21% O2）培養(yǎng)72 h。上述實驗重復3 次。

1.2 所用試劑和儀器TRIzol RNA 試劑購自美國Invitrogen 公司。淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物科技有限公司，CD235 磁珠抗體購自Miltenyi Biotec 中國公司，RPMI 1640 培養(yǎng)基購自上海Ybiotech 公司。引物的設計采用加拿大Premier 公司的Primer 5 軟件，PCR 試劑購自Beijing Solarbio Science ＆ Technology Co.，Ltd，PCR 所用引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。細胞轉染慢病毒載體構建購自Thermo Fisher Scientific 中國公司。PCR 儀器為美國Applied Biosystems 公司，倒置熒光顯微鏡為日本Olympus 公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 骨髓CD235a 細胞的分選按照納入標準通過骨髓穿刺術采集5 mL 骨髓液，并置于肝素抗凝管中，應用淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞，每計數(shù)1×106個細胞加入PBS 8 μL，結合既往文獻選擇［5］CD235a 磁珠抗體2 μL 避光孵育30 min，獲得骨髓中紅系CD235a 陽性細胞，提取RNA，進行后續(xù)試驗。

1.3.2 K562 細胞的培養(yǎng)和轉染

1.3.2.1 細胞培養(yǎng)通過查閱文獻選擇K562 細胞為對象［6］。從液氮中取出K562 細胞后迅速凍融離心并棄上清液后，用含預熱的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細胞，離心后再次置于RPMI 1640 培養(yǎng)基（內含100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的雙抗，10%胎牛血清）中，在常氧細胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中孵育細胞，根據(jù)細胞生長情況進行換液。取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2.2 轉染及分組每孔取105個K562 細胞接種于12 孔板，一孔為空白孔，另外三孔作為不同感染復數(shù)孔，加入RPMI 1640 培養(yǎng)基體積2 mL，在37 ℃孵育箱中培養(yǎng)12 h，當K562 細胞鋪滿培養(yǎng)板底部60%時，在轉染孔中加入Lentivirus 病毒液（HIF-1α干擾或過表達慢病毒載體），3 個孔MOI 分別為100、10 和1，同時加入Polybrene 稀釋液10 μL（終濃度5 μg/mL）減少毒性，充分混勻后培養(yǎng)48 h后加1 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋Polybrene，間隔4 h 根據(jù)細胞生長和形態(tài)更換新鮮培養(yǎng)液。

HIF-1α干擾或過表達慢病毒載體轉染4 d 后在熒光顯微鏡下觀察GFP 熒光表達情況，每2 天更換培養(yǎng)基，保持細胞活性。通過不同的感染復數(shù)最后確定MOI 10 為最佳，然后在含嘌呤霉素1 μL/mL的RPMI 1640 篩選培養(yǎng)基篩選轉染的陽性細胞，如篩選陽性率不高可以重復1 次。收集轉染陽性的細胞繼續(xù)做后續(xù)實驗。

1.3.3 RNA提取、RT-PCR檢測mRNA表達細胞總RNA 提取采用Trizol 法，采用RT-qPCR 法進行基因擴增，RT 按照TakaRa Prime ScriptTMreagent Kit進行。PCR在ABI 7500上進行，每孔增加2個復孔。20 μL反應體系，條件如下：預變性95 ℃10 min，變性：95 ℃15 s，退火60 ℃31 s，40 個循環(huán)。PCR 數(shù)據(jù)導出后數(shù)據(jù)采用△△Ct處理［7］。引物設計：目的基因、GAPDH 序列從Genbank 中查詢，設計引物應用Primer5.0 軟件，引物合成由上海生工生物有限公司完成。見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，如正態(tài)分布計量資料采用以（）表示，獨立樣本之間比較采用t檢驗，以α=0.05 為檢驗水準。

2 結果

2.1 觀察組和對照組骨髓CD235a 中紅系轉錄因子mRNA的比較骨髓單個核細胞經(jīng)過CD235a磁珠抗體分選后CD235a 陽性率細胞占90%以上。觀察組HIF-1α和GATA1 mRNA 表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而NFE2、c-MYB、FOG-1、LMO2、β-globin 和α-globin 的mRNA 水平差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 觀察組和對照組骨髓CD235a 中紅系轉錄因子mRNA 的比較Tab.2 Comparison of erythroid transcription factor mRNA in bone marrow CD235a in the experimental group and the control group ±s

表2 觀察組和對照組骨髓CD235a 中紅系轉錄因子mRNA 的比較Tab.2 Comparison of erythroid transcription factor mRNA in bone marrow CD235a in the experimental group and the control group ±s

轉錄因子HIF-1α GATA1 NFE2 c-MYB FOG-1 LMO2 β-globin α-globin CMS 組（n=30）15.44±5.77 8.29±3.22 2.29±0.87 7.83±3.24 10.08±2.75 3.24±1.37 1.94±0.99 2.33±1.14對照組（n=30）10.87±4.90 5.63±2.86 2.63±0.80 8.08±2.33 10.75±2.34 3.49±1.19 2.04±0.90 2.51±1.26 t 值3.307 3.383 1.137 0.251 0.898 0.564 0.286 0.580 P 值0.002 0.001 0.264 0.803 0.376 0.557 0.777 0.564

2.2 細胞形態(tài)觀察及轉染效率在100×油鏡下觀察K562 細胞，細胞核呈圓形或橢圓形，占細胞直徑的4/5，染色質呈顆粒狀，有聚集趨勢，為淡藍色，核膜較清楚。細胞胞體圓形或橢圓形，邊緣可見瘤狀突起。細胞胞質量較少，呈不透明的深藍色，核周有淡染區(qū)。通過感染復數(shù)選擇最適MOI值為10，感染效率約在50%，1～2 次嘌呤霉素篩選后陽性細胞＞90%（圖1、2）。

圖1 吉姆薩染色染色的K562 細胞形態(tài)（100×）Fig.1 K562 cell morphology by Wright-Giemsa stained（100×）

2.3 過表達和干擾組中紅系轉錄因子mRNA 水平的比較過表達組中HIF-1α、GATA1、NFE2、FOG-1和β-globin mRNA 表達高于干擾組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而c-MYB、LMO2、和α-globin 的mRNA 水平差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

3 討論

圖2 過表達組和干擾組的轉染效率（100×）Fig.2 Transfection efficiency of over-expression and interference groups（100×）

表3 過表達和干擾組中紅系轉錄因子mRNA 水平的比較Tab.3 Comparison of erythroid transcription factor mRNA levels in overexpression and interference groups ±s

表3 過表達和干擾組中紅系轉錄因子mRNA 水平的比較Tab.3 Comparison of erythroid transcription factor mRNA levels in overexpression and interference groups ±s

轉錄因子HIF-1α GATA1 NFE2 c-MYB FOG-1 LMO2 β-globin α-globin過表達組48.22±2.51 5.21±1.24 35.87±9.52 11.15±3.55 6.97±2.81 8.33±3.63 7.58±2.04 4.83±2.14干擾組2.87±2.34 3.27±0.86 15.12±8.34 6.80±4.33 2.83±2.38 6.07±4.76 3.32±2.19 6.13±1.12 t 值65.999 7.026 8.980 1.738 2.511 0.843 3.183 1.205 P 值＜0.001＜0.001＜0.001 0.120 0.036 0.424 0.013 0.263

全球有數(shù)百萬人生活在高海拔地區(qū)，已有很多人患有CMS，并且有很大數(shù)量的人有患CMS 的風險，這是一種因長期暴露于低氧環(huán)境而導致的失適應的綜合征，主要特征是嚴重的過度紅細胞增多癥（女Hb ≥19 g/dL，男Hb ≥21 g/dL）和低氧血癥，在晚期病例中，病情可能發(fā)展為肺心病或充血性心力衰竭［8］。目前研究表明CMS 患者骨髓早期紅細胞中固有凋亡途徑下調從而導致紅細胞過度增多［9］。另有報道CMS 患者紅系祖細胞中HIF-2α表達異常升高，導致下游缺氧敏感基因異常表達，參與了CMS的發(fā)生發(fā)展［10］。目前已有研究通過基因編輯改變紅系特異性轉錄因子β-globin 的表達成功應用于β地中海貧血的治療［11］，還發(fā)現(xiàn)轉錄因子GATA-1 及其下游靶標NFE2 和FLI1 在造血干細胞分化過程中負責確定紅細胞和巨核細胞譜系［12］。本研究通過觀察CMS 患者中HIF-1α和紅系轉錄因子的關系，結果發(fā)現(xiàn)低氧-HIF-1-紅系特異基因（GATA-1、FOG-1 和β-globin）表達軸可能在低氧誘導紅系造血過程中發(fā)揮著重要的調控作用。體外實驗中，本研究選擇K562 細胞系作為研究對象，K562 白血病細胞系有正常的前體紅細胞的細胞表面標志、形態(tài)學特征及生物學行為，但在分化調控上不完全一致的。故不能完全代表紅系分化的調控機制。

紅系分化是造血分化的重要組成部分，是人體產(chǎn)生成熟紅細胞的重要途徑，受具有強時空特異性的特定轉錄因子調控。轉錄因子GATA-2 在紅系前體細胞中具有高表達水平，以維持干細胞在紅系分化中的特性。而后GATA-1 的表達逐漸增強，將類紅細胞祖細胞轉化為成熟的紅細胞［13］。既往報道HIF-1α參與促紅細胞生成素相關的急性低氧反應，而HIF-2α與慢性缺氧的反應相關［14］。在缺氧條件下，K562 細胞中的HIF-1α調節(jié)GATA-1的表達［15］。在K562 細胞和CD34+造血干/祖細胞的類紅細胞誘導培養(yǎng)物中檢測到GATA1 mRNA和蛋白水平顯著增加是通過HIF1α介導的，促進轉錄因子GATA1 表達的同時促進紅細胞生成［12］。本研究發(fā)現(xiàn)CMS 患者骨髓紅系細胞中HIF1α和GATA1 的mRNA 表達均上調，而其他轉錄因子無明顯差異，提示CMS 患者的發(fā)病原因可能是低氧促進HIF-1α的表達，并影響GATA1 從而促進紅系細胞的分化成熟。

FOG-1作為和GATA-1相互作用的蛋白，其鋅指中有四個與GATA-1 相互作用的結構域［13］，F(xiàn)OG-1在紅系細胞和巨核細胞中高表達，其基因敲除的表型與GATA-1 基因敲除的表型非常相似，基因敲除后會因嚴重貧血而導致胚中致死［16］。已經(jīng)有研究表明MeCP1/NuRD 復合體是抑制基因表達的GATA-1/FOG-1 相互作用伴侶［17］。同時FOG-1促進GATA-1 介導的遠端增強子元件置于基因啟動子上，如β-珠蛋白基因座的DNA 循環(huán)［18］。但本研究發(fā)現(xiàn)在CMS 患者中FOG-1mRNA 表達水平上升，且體外K562 細胞過表達HIF-1α可導致FOG-1mRNA 的上調。紅細胞生成是一個復雜的多步驟過程，始于骨髓微環(huán)境的多能造血干細胞，終止于紅細胞的產(chǎn)生，對紅系和巨核細胞命運的轉錄調控FOG-1 和GATA-1 是所必需的［17］?？梢娂t系分化是一個復雜緊密的調控系統(tǒng)，CMS 患者紅細胞增多的機制需要進一步去研究和探索。

目前已明確地中海貧血是由于α、β珠蛋白基因突變或缺失導致珠蛋白肽鏈生成不足的遺傳性貧血。紅系分化伴隨著β-珠蛋白簇的轉錄速率急劇增加，球蛋白基因啟動子除含有TATA 框外，還有針對紅細胞特異性轉錄因子（如GATA-1，NFE2和EKLF）的不同識別位點［19］，在紅系祖細胞中，β-珠蛋白基因的表達水平與大多數(shù)管家基因的表達水平相當。而在分化過程中，β-珠蛋白的轉錄效率提高了100 倍，達到了其他基因從未觀察到的表達水平［20］。本研究在CMS 患者骨髓中未發(fā)現(xiàn)β-珠蛋白mRNA表達水平增高，但發(fā)現(xiàn)體外K562細胞過表達HIF1α可導致β-珠蛋白mRNA 水平上調。這也和很早的研究胚胎干細胞向胚狀體分化的小鼠胚胎發(fā)生的體外模型發(fā)現(xiàn)低氧促進HIF-1α mRNA 調節(jié)β-珠蛋白的表達一致［21］。

總之，上述研究主要針對HIF-1α對紅系轉錄因子mRNA 水平的影響，沒有進行蛋白水平的測定，在后續(xù)研究中繼續(xù)相關的研討。造血干細胞在缺氧條件下骨髓微環(huán)境中維持，細胞對缺氧的反應在很大程度上由缺氧誘導因子HIF-1 和HIF-2介導，HIF-1α對于維持HSC 是必不可少的，缺乏HIF-1α的HSC 在連續(xù)移植試驗中喪失了自我更新的能力，雖然骨髓微環(huán)境具有低氧特性，但HIF-1α對于細胞維持HSC的自主性極其重要［22］，同時可能和骨髓紅系細胞相關的增值和凋亡也有關系［23］。這也提示HIF-1α在CMS 患者發(fā)病機制中有重要意義，對進一步研究紅細胞調控因子有很大的參考價值。