黃河 魏童

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院1胃腸外科，2 血管腫瘤介入科（烏魯木齊830054）

癌癥是全球死亡的主要原因之一。化療是治療癌癥的主要方法之一。癌細胞對化療的耐藥性仍然是臨床上治療癌癥的主要障礙［1］。近年來，越來越多的研究表明，microRNA 在腫瘤細胞的藥物敏感或耐受中發(fā)揮了重要作用，為深入了解腫瘤耐藥機制并尋找腫瘤治療的新靶點提供了新的思路［2-3］。據(jù)報道，miRNA 在多種腫瘤中的表達水平發(fā)生異常［4］，在腫瘤中發(fā)揮原癌基因或腫瘤抑制因子的功能，使miRNA 在腫瘤診斷、預(yù)后和治療中展現(xiàn)出了一定的潛力［5］。miR-548c-5p 在多種腫瘤細胞中表達下調(diào)，在肝癌、結(jié)直腸癌中發(fā)揮了抑癌基因的作用。目前，miR-548c-5p 在胃癌中的調(diào)控機制尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)miR-548c-5p 在胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR 中顯著下調(diào)，生物信息學(xué)分析表明Notch 通路是潛在靶點，需要進一步通過分子、細胞實驗證實miR-548c-5p 通過Notch通路參與胃癌細胞增殖、侵襲和耐藥的調(diào)控。本研究首次證實了miR-548c-5p參與Notch通路調(diào)控，與胃癌細胞的耐藥密切相關(guān)，這將為解決胃癌化療耐藥問題提供新的理論依據(jù)和手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料SGC7901 細胞和SGC7901/VCR 細胞系均購自ATCC 公司；細胞培養(yǎng)試劑（DMEM 培養(yǎng)基、OPTI-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和雙抗）購自Gibco 公司；miR-548c-5p mimics 和miR-NC 由廣州博銳合成；pcDNA3.1-Notch1 質(zhì)粒載體、pLUC-3′-UTR-Notch1 和pLUC-突變3′-UTR 質(zhì)粒載體由上海生工構(gòu)建；Lipofectamin2000、TRIzol 試劑和逆轉(zhuǎn)錄酶（RevertAid Reverse Transcriptase）購自Thermo；2×SGExcel FastSYBR Mixture 和miRNA qPCR master mix 購自上海生工；紫杉醇購自sigma；Notch1 抗體、Hes1 抗體和β-actin 抗體均購自Abcam 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染SGC7901 細胞和SGC7901/VCR 細胞在含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱。細胞接種于6 孔板中，當長至培養(yǎng)板底部的80%以上時，參考lipofectamine 的說明書，進行microRNA mimics 或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

1.3 TRIzol 法提取細胞總RNA采用PBS 緩沖液沖洗貼壁細胞2 次，向細胞加入500 μL TRIzol試劑，裂解細胞。將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，每管加入100 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置2 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min。取上層水相，加入新的EP管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min，4 ℃，12 000 r/min 離心15 min，去上清液。用70%的無水乙醇洗滌2次，4 ℃，7 000 r/min 離心5 min，去上清液，自然條件下，充分干燥。加入30～50 μL DEPC 水溶解，采用分光光度計（NanoDrop ND-1000，Thermo）檢測RNA 的吸光度，分析RNA 的純度及濃度，要求A260/A280＞2.0，A230/A260＞1.8。保存于-80 ℃冰箱。

1.4 qRT-PCR將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。microRNA 定量：按照miRNA qPCR master mix 說明書，配制qPCR 反應(yīng)體系（10 μL 2 × miRNA qPCR master mix +0.5 μL 上游引物+0.5 μL 下游引物+1 μL cDNA，加入超純水補齊至20 μL），以U6 為內(nèi)參；Notch1 和Hes1 定量：按照2 × SGExcel FastSYBR Mixture 說明書，配制qPCR 反應(yīng)體系（25 μL 2 ×SGExcel FastSYBR Mixture+1 μL 上游引物+1 μL 下游引物+1 μL cDNA，加入超純水補齊至50 μL），以β-actin 作為內(nèi)參。上機檢測（StepOnePlusTM實時熒光定量PCR 儀，美國ABI）。目的基因相對表達量變化根據(jù)2-ΔΔCT計算。

1.5 Western Blot采用RIPA緩沖液裂解細胞，提取總蛋白。樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以1∶100～1∶1 000稀釋后加入一抗。以兔IgGHRP 抗體為二抗。以β-actin 為內(nèi)參。在Fluor Chem Systems 下（ProteinSimple）觀察結(jié)果，采用Alpha View Software 分析目標蛋白（Notch1 和Hes1）的相對表達量。

1.6 熒光素酶報告基因?qū)嶒灲臃NSGC7901/VCR細胞至6 孔板，采用lipofectamine2000 共轉(zhuǎn)染1 μg質(zhì)粒和miR-548c-5p mimics 或miR-NC。24 h 后，使用熒光素酶檢測試劑盒（Promega）進行熒光素酶活性檢測。

1.7 細胞增殖分析用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基將SGC7901/VCR 細胞配成懸液，以每孔104 個細胞接種96孔板。5%CO2，37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底。培養(yǎng)3～5 d 后，每孔加入CCK-8 試劑10 μL繼續(xù)孵育4 h。在酶標儀上測定每孔光吸收值，繪制細胞生長曲線。

1.8 細胞侵襲檢測細胞侵襲使用Transwell 小室（康寧）進行。將無血清培養(yǎng)基中的1×105個細胞放入涂有基質(zhì)膠的上室（BD Biosciences）。接下來，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基添加到下室。孵育24 h 后，除去上層膜殘留的細胞，將侵襲通過膜的細胞進行固定，用甲醇固定，用0.1%結(jié)晶紫染色。在IX71 倒置顯微鏡（Olympus）下計數(shù)并成像。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism5 統(tǒng)計軟件進行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-548c-5p、Notch1 和Hes1 在SGC7901/VCR細胞中的表達首先，采用qRT-PCR分析miR-548c-5p、Notch1 和Hes1 在SGC7901 細胞系和SGC7901/VCR 細胞中的表達變化，結(jié)果表明，miR-548c-5p 在SGC7901/VCR 細胞的表達顯著低于SGC7901細胞（P＜0.05）（圖1A），而Notch1和Hes1在SGC7901/VCR細胞中mRNA水平顯著高于SGC7901細胞（P＜0.05）（圖1B）。進一步Western blot 結(jié)果表明，Notch1 蛋白和Hes1 蛋白在SGC7901/VCR 細胞顯著升高（P＜0.05）（圖1C、D）。以上結(jié)果顯示，在SGC7901/VCR 細胞中，miR-548c-5p 與Notch 通路可能存在一定關(guān)聯(lián)。

圖1 miR-548c-5p、Notch1 和Hes1 在SGC7901 和SGC7901/VCR 細胞中的表達Fig.1 Expression of miR-548c-5p，Notch1 and Hes1 in SGC7901 and SGC7901/VCR cells

2.2 Notch 通路是miR-548c-5p 的靶點將miR-548c-5p mimics 轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR 細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，采用qRT-PCR 分析miR-548c-5p、Notch1 和Hes1 的表達變化，結(jié)果表明，與miR-NC 轉(zhuǎn)染組相比，miR-548c-5p 的表達顯著升高（P＜0.05）（圖2A）。Western blot 結(jié)果表明，與對照組相比，miR-548c-5p 轉(zhuǎn)染后，細胞中Notch1 和Hes1 在蛋白質(zhì)水平上表達也顯著下降（P＜0.05）（圖2B、C）。熒光素酶檢測結(jié)果表明，miR-548c-5p可以顯著降低Notch1野生型3′-UTR 質(zhì)粒的熒光素酶活性（P＜0.05）（圖2D）。以上結(jié)果證明，miR-548c-5p 可以通過直接結(jié)合于Notch1 的3′-UTR 序列，抑制Notch 信號通路。

2.3 miR-548c-5p 通過靶向Notch 通路抑制SGC 7901/VCR 細胞增殖和侵襲為了分析miR-548c-5p 和Notch 通路對SGC7901/VCR 細胞生物學(xué)行為的影響，通過lipofectamine2000 瞬時轉(zhuǎn)染細胞后，采用CCK-8 實驗分析細胞的增殖，采用Twanwell實驗分析細胞的侵襲。CCK-8 結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染后72 h，miR-548c-5p 可以顯著抑制細胞的增殖，而過表達Notch1 可以抵消miR-548c-5p 對SGC7901/VCR 細胞增殖的抑制作用（圖3A）。Twanswell 結(jié)果表明，miR-548c-5p 可以顯著抑制細胞的侵襲，同樣，過表達Notch1 可以逆轉(zhuǎn)miR-548c-5p 對SGC7901/VCR 細胞侵襲的抑制作用（圖3B）。以上結(jié)果表明，miR-548c-5p 可以抑制SGC7901/VCR 細胞的侵襲，Notch1 是miR-548c-5p 的一個重要靶點。

2.4 miR-548c-5p可以提高SGC7901/VCR 紫杉醇的敏感性CCK-8實驗結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染后的72 h，過表達miR-548c-5p 可以顯著抑制SGC7901/VCR細胞的增殖，而將紫杉醇與miR-548c-5p 聯(lián)合，進一步抑制了細胞增殖（圖4A）。Twanwell結(jié)果表明，紫杉醇與miR-548c-5p 聯(lián)合，對SGC7901/VCR 細胞侵襲的抑制作用最強（圖4B）。以上結(jié)果證實，miR-548c-5p聯(lián)合紫杉醇可以進一步抑制SGC7901/VCR 增殖和侵襲，miR-548c-5p 可以明顯提高SGC7901/VCR 對紫杉醇的敏感性。

圖2 過表達miR-548c-5p 下調(diào)Notch1 和Hes1Fig.2 Overexpression of miR-548c-5p downregulates Notch1and Hes1

圖3 miR-548c-5p 抑制SGC7901/VCR 細胞增殖、遷移和侵襲Fig.3 miR-548c-5p suppresses proliferation，migration and envision of SGC7901/VCR cells

圖4 miR-548c-5p 增強SGC7901/VCR 細胞對紫杉醇的敏感性Fig.4 miR-548c-5p enhances the sensitivity of SGC7901/VCR cells to paclitaxel（PTX）

3 討論

在全世界范圍內(nèi)，胃癌是致死率最高的疾病之一［6］。盡管在過去的幾十年里，胃癌發(fā)病率和病死率普遍下降，胃癌仍是全球第二大癌癥死亡原因，占新診斷癌癥的10%左右。目前，胃癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、化療和放療［7］?；熑匀皇翘岣呖汕谐瓦M展期胃癌患者的整體生存和生活質(zhì)量的主要治療手段。對于晚期患者，化療干預(yù)被認為可以抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，延長病人的生存期。然而，在許多情況下，治療失敗是因為癌細胞的固有或者獲得性的多藥耐藥（MDR）［8］。當前，藥物耐受被認為是一個多因素參與的過程，主要機制包括降低水溶性藥物的攝取，增強DNA損傷的修復(fù)，抑制腫瘤細胞凋亡，改變藥物的代謝和增加化療藥物的能量依賴性泵出等［9-10］。然而，影響胃癌的藥物耐受的機制仍未完全闡明。因此，有必要深入了解胃癌細胞耐藥的分子機制。

miRNA 是內(nèi)源性的非編碼RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達，并已被證明可以在不同的生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，包括細胞凋亡、增殖、應(yīng)激反應(yīng)和代謝［11］。已有研究揭示，miRNA 與多種腫瘤細胞化療敏感性或抵抗，包括卵巢癌細胞和乳腺癌細胞［12-13］。然而，關(guān)于miRNA 在胃癌化療耐藥中的作用，目前的研究仍然較少。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，有一部分microRNA 在胃癌耐壓細胞系中SGC7901/VCR 細胞和親代細胞系SGC7901中發(fā)生差異性表達。例如，miRNA-106b 基因的染色體7q22 位點，而該位點在SGC7901/VCR 細胞中通常是缺失的。在SGC7901/VCR 細胞中，有研究發(fā)現(xiàn)miR-16 和miR-15b 發(fā)生下調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b 和miR-16 可直接調(diào)控BCL2 的表達，從而調(diào)節(jié)癌細胞對化療藥物誘導(dǎo)凋亡的敏感性［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-548c-5p 在CD90+HepG2 細 胞中呈低表達，轉(zhuǎn)染miR-548c-5p 可以下調(diào)凋亡蛋白（bcl-2、bcl-XL 和caspase-3）的表達，并可以抑制細胞的增殖、遷移和侵襲，促進凋亡［15］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-548c-5p在胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR 中的表達明顯下調(diào)，過表達miR-548c-5p 降低Notch1 和Hes1 的表達水平。

Notch 通路是多種腫瘤微環(huán)境中最重要的通路之一。Notch 受體與其配體的結(jié)合導(dǎo)致蛋白水解并釋放Notch1 激活的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通常移位至細胞核內(nèi)，并驅(qū)動多個靶蛋白的表達，如Hes/Hey 家族和c-Myc［16］。大量研究證實，Notch 通路與腫瘤細胞化療藥物耐受密切相關(guān)［17］。然而，Notch 信號通路在胃癌細胞耐藥中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-548c-5p 在胃癌耐藥細胞株中的表達顯著降低，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Notch 是其潛在的靶點；Notch1 信號通路關(guān)鍵分子Notch1和Hes1在耐藥細胞株中的表達也明顯低于普通胃癌細胞。另外，通過轉(zhuǎn)染miR-548c-5p mimics，分析SGC7901/VCR 細胞的細胞生物學(xué)行為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-548c-5p 對SGC7901/VCR 細胞的增殖和侵襲具有明顯的抑制作用，而過表達Notch1 可以抵消miR-548c-5p 對SGC7901/VCR 細胞的抑制作用。以上研究證實，miR-548c-5p 可以通過靶向Notch1 通路，參與胃癌細胞的增殖、侵襲和耐藥的調(diào)控。而將miR-548c-5p 與紫杉醇聯(lián)合使用，可以進一步抑制SGC7901/VCR 細胞的增殖和侵襲，表明miR-548c-5p 可以提高胃癌細胞對化療藥物的敏感性，有望為提高胃癌化療療效提供新的靶點和策略。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-548c-5p 在胃癌耐藥細胞株中表達發(fā)生下調(diào)，過表達miR-548c-5p 可以抑制胃癌耐藥細胞的增殖和侵襲，另外，miR-548c-5p可以顯著提高胃癌耐藥細胞對紫杉醇的敏感性，分析發(fā)現(xiàn)，Notch 通路可能是miR-548c-5p 的重要靶點。本研究將為提高胃癌對化療藥物敏感性提供新的實驗依據(jù)及新的靶點。當然，本研究也存在欠缺之處，首先miR-548c-5p 的作用可能是由其不同靶基因的表達綜合作用的結(jié)果，關(guān)于miR-548c-5p 在胃癌中的調(diào)控機制還需要進一步深入研究和闡釋；另外，本研究僅停留在細胞層面上，進一步將補充體內(nèi)實驗并結(jié)合臨床樣本進行驗證。