王志昇 李夢婷 姬勇敢 楊萌萌

寧夏醫(yī)科大學(xué)1實驗動物中心，2藥學(xué)院（銀川750004）

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有85.4 萬例新發(fā)患者，其中約50%發(fā)生在我國，并呈逐年上升趨勢，現(xiàn)有的治療手段如手術(shù)、放療、化療等都有不同的弊端，無法徹底根除［1-2］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因治療已成為治療腫瘤最具潛力的方法之一。基因治療要想成功實施，靶基因的選擇至關(guān)重要。眾所周知，原發(fā)腫瘤的發(fā)展以及轉(zhuǎn)移關(guān)鍵依靠新生血管的生成來提供氧氣和營養(yǎng)。因此，內(nèi)皮抑素、血管抑素基因等抗血管生成基因治療作為一種抗癌策略廣受關(guān)注［3］。內(nèi)皮抑素是膠原ⅩⅧ的C 末端水解片段，是研究最廣泛的內(nèi)源性血管生成抑制劑之一。血管抑素是纖溶酶原內(nèi)部蛋白水解片段的四個Kringle結(jié)構(gòu)域中的第一個，被認(rèn)為是一種有效的內(nèi)源性血管生成抑制劑。目前血管抑素和內(nèi)皮抑素已在不同的表達(dá)系統(tǒng)如慢病毒［4］、腺相關(guān)病毒［5］以及減毒鼠傷寒沙門氏菌［6］等獲得了表達(dá)，并在不同的腫瘤模型中表現(xiàn)出了一定的抗腫瘤潛力。然而，這些病毒或細(xì)菌載體在人體內(nèi)的生物安全性有待進(jìn)一步驗證。與這些病原體相比，桿狀病毒是一種昆蟲病毒，對哺乳動物和人類無致病性，但能有效進(jìn)入多種哺乳動物細(xì)胞這一特點使其成為良好基因傳遞潛能的載體。因此，本研究為了提高抗血管生成基因治療的效果和安全性，擬以桿狀病毒為載體，表達(dá)由人內(nèi)皮抑素和血管抑素組成的融合蛋白（human endostatin and angiostatin，hEA），以此來評價桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 的抗血管生成功能和抗肝癌效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞pFastBac DUAL 質(zhì)粒購自美國Thermo 公司；pUNO1-hEndo18Angio 質(zhì)粒購自美國InvivoGen 公司；pEGFP-C1 質(zhì)粒、大腸埃希菌DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞、昆蟲Sf-9 細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞HepG2 和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心保存。Sf-9 細(xì)胞在含有10 %胎牛血清（FBS）的Grace 昆蟲培養(yǎng)基（含3.3 g/L 水解乳蛋白和3.3 g/L 酵母提取物）于27 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；HepG2 和HUVEC 細(xì)胞用含有10 % FBS的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 實驗動物4～6 周齡，體質(zhì)量為18～22 g，SPF 級雄性BALB/c 裸小鼠由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物飼養(yǎng)在寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心標(biāo)準(zhǔn)化的SPF 級動物屏障環(huán)境中，動物實驗方案經(jīng)由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理審查委員會審核并獲得批準(zhǔn)。

1.1.3 主要試劑各種內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶和dNTP 購自美國Thermo 公司；DNA Marker 購自南京諾唯贊生物公司；質(zhì)?；厥赵噭┖?、DNA 凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技公司；MTT 試劑盒、BCA 試劑盒購自江蘇凱基生物；丁酸鈉購自Sigma 公司；FBS、Grace 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基及Lipofectamine 2000 購自Gibco 公司；Angiostatin ELISA 試劑盒購自南京云克隆公司；Matrigel 基質(zhì)膠購自美國康寧公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器PCR 儀（T100，美國BIORAD 公司）；全波長酶標(biāo)儀（Multiskan FC，美國Thermo 公司）；倒置顯微鏡（Axio Vert.A1，德國蔡司公司）；高速冷凍離心機（Centrifuge 5430R，美國Eppendorf 公司）；CO2培養(yǎng)箱（Forma 311，美國Thermo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 pBac-ChEA 質(zhì)粒的構(gòu)建以質(zhì)粒pFastBac DUAL 為骨架，將pPh 啟動子替換為CMV 啟動子，CMV 啟動子從pEGFP-C1 質(zhì)粒通過引物CMV-F：5′-CGCGGTATACTAGTTATT AATAGTAATCAA-3′和CMV-R：5′-GCGGGATCCGGATCTGACGGTTCACTAAAC-3′擴增獲得（下劃線為分別引入的BST Z17I和Bam HI 酶切位點），獲得的重組質(zhì)粒命名為pBac-CMV。以質(zhì)粒pUNO1-hEndo18Angio 為模板，設(shè)計引物hEA-F：5′-TCAGGATCCCGCCACCA-TGTAC AGGATGCAACTC-3′和hEA-R：5′-GCGAAGCTTTCATACAACACTCGCTTCTGT-3′（下劃線為分別引入的Bam HI 和Hind III 酶切位點），用于擴增hEndo18Angio（hEA）基因，將hEA PCR 產(chǎn)物雙酶切回收后插入同樣位點酶切后的pBac-CMV 質(zhì)粒中，獲得的重組質(zhì)粒命名為pBac-ChEA。

1.2.2 重組病毒粒子的獲得重組病毒的獲得按照Bac-to-Bac（Invitrogen）表達(dá)系統(tǒng)說明書操作。將pBac-ChEA 轉(zhuǎn)化DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)三抗（卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素）篩選，提取桿狀病毒DNA，經(jīng)由Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染Sf-9 細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞大部分從瓶底脫落時，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清液，作為原毒種P1 代毒，再以1 MOI 的重組病毒量繼續(xù)感染Sf-9 細(xì)胞，完成重組病毒的增殖，直至P3 代毒，分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。對照質(zhì)粒pBac-CMV 按照同樣方法處理。經(jīng)PCR 鑒定正確的重組病毒分別命名為Bac-ChEA和Bac-CMV，病毒的滴度通過噬斑實驗測定。

1.2.3 在HUVEC 細(xì)胞中的表達(dá)將Bac-ChEA 和Bac-CMV 以MOI 400 轉(zhuǎn)導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞，所加入的病毒先用昆蟲培養(yǎng)基稀釋，然后與不含NaHCO3的DMEM 培養(yǎng)基配成1∶4 的比例，然后將混合培養(yǎng)液加入細(xì)胞中，使其完全覆蓋細(xì)胞，于27 ℃，搖床上孵育5～6 h，吸出培養(yǎng)液，加入含有3 mmol/L 丁酸鈉的DMEM 完全培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，第2 天更換為不含丁酸鈉的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到第3 天收集細(xì)胞，按照Angiostatin ELISA 試劑盒說明書的方法進(jìn)行操作，最后用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測各孔的吸光度值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各組hEA 蛋白的濃度。

1.2.4 對HUVEC 細(xì)胞增殖能力的影響將HUVEC 細(xì)胞接種于96 孔板中（4 × 103個/孔），待細(xì)胞貼壁后，將Bac-ChEA 和Bac-CMV 以MOI 400 轉(zhuǎn)導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞，對照組為不含病毒的空轉(zhuǎn)導(dǎo)組。直到第3 天，每孔加入50 μL 1×MTT 試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸出上清液，加入150 μL DMSO，立即通過酶標(biāo)儀在490 nm 波長下測定其吸光度值。細(xì)胞存活率（%）=OD實驗組/OD對照組×100%

1.2.5 對HUVEC細(xì)胞遷移能力的影響將HUVEC細(xì)胞接種于6 孔板中（7 × 105個/孔），待細(xì)胞貼壁 后，將Bac-ChEA 和Bac-CMV 以MOI 400 轉(zhuǎn) 導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞，對照組為不含病毒的空轉(zhuǎn)導(dǎo)組，過夜培養(yǎng)后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用槍頭在每孔中筆直劃一條線，使其成為無細(xì)胞區(qū)域，用PBS 清洗后加入含有1 % FBS 的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別于培養(yǎng)開始時和培養(yǎng)24 h 時在倒置顯微鏡下拍照，最后用Image J 軟件統(tǒng)計劃痕縮小的面積。

1.2.6 對HUVEC 細(xì)胞血管形成能力的影響將Bac-ChEA 和Bac-CMV 以MOI 400 轉(zhuǎn) 導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞，對照組為不含病毒的空轉(zhuǎn)導(dǎo)組，72 h 后消化并收集細(xì)胞。用Matrigel 基質(zhì)膠包被96 孔培養(yǎng)板，37 ℃孵育30 min，然后將重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞制成懸液（5×105cell/mL），每孔加入100 μL，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后用倒置顯微鏡觀察血管網(wǎng)絡(luò)形成并拍照，每孔任意選取5 個視野，實驗重復(fù)3 次，通過Image J 軟件統(tǒng)計分析血管網(wǎng)絡(luò)總主段長度。

1.2.7 體內(nèi)抗腫瘤效果評價取200 μL 生長狀態(tài)良好的HepG2 細(xì)胞懸液（1 × 107cell/mL）接種在BALB/c 裸小鼠背部左側(cè)皮下，當(dāng)腫瘤體積長至100 mm3時，隨機分為3組，每組5只，分別在瘤內(nèi)注射200 μL Bac-ChEA 和Bac-CMV（1 × 108pfu/mL）以及等體積的PBS，每隔5 d 注射1 次，共注射3 次。每2 d 測量小鼠腫瘤體積，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到1 500 mm3時，認(rèn)定小鼠死亡，記錄小鼠的死亡情況。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，通過Kaplan-Meier 和Log-rank 檢驗分析小鼠的存活率；計量資料兩組對比采用t檢驗，數(shù)據(jù)結(jié)果以（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組桿狀病毒Bac-ChEA 的PCR 鑒定將重組質(zhì)粒pBac-ChEA 轉(zhuǎn)化DH10Bac 細(xì)胞，提取重組病毒Bac-ChEA DNA，轉(zhuǎn)染Sf-9 細(xì)胞3 d 后，細(xì)胞大量從瓶底脫落，倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞核膨大，胞內(nèi)顆粒增多，部分細(xì)胞裂解、死亡。此時收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)堿裂解法提取病毒DNA，經(jīng)PCR 和核酸瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在預(yù)期位置處出現(xiàn)了特異性條帶，結(jié)果見圖1，證明hEA 基因已成功整合入病毒基因組中。

圖1 重組桿狀病毒Bac-ChEA PCR 鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant baculovirus Bac-ChEA

2.2 在HUVEC細(xì)胞中的表達(dá)經(jīng)Angiostatin ELISA試劑盒檢測，Bac-ChEA 在HUVEC 細(xì)胞中能有效表達(dá)hEA 蛋白，其平均濃度達(dá)到了（223±20）pg/mL，而在轉(zhuǎn)導(dǎo)Bac-CMV 的細(xì)胞中基本檢測不到hEA 蛋白（圖2）。結(jié)果表明桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白在哺乳動物細(xì)胞中獲得了表達(dá)。

2.3 對HUVEC 細(xì)胞增殖能力的影響MTT 結(jié)果表明（圖3），Bac-CMV 組和空白對照組對細(xì)胞的增殖基本無影響，而Bac-ChEA 組能有效抑制HUVEC細(xì)胞的增殖，細(xì)胞平均存活率下降到了65%左右，與Bac-CMV組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），證明重組桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白能有效抑制HUVEC 細(xì)胞的增殖，而桿狀病毒本身對細(xì)胞的增殖無影響。

圖2 桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白在HUVEC 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Baculovirus mediated hEA protein expression in HUVEC cells

圖3 桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白對HUVEC 細(xì)胞增殖能力的影響（n=3）Fig.3 Effects of baculovirus-mediated hEA protein on the proliferation of HUVEC cells（n=3）

2.4 對HUVEC 細(xì)胞遷移能力的影響通過劃痕實驗評估其對細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果見圖4，Bac-ChEA 組與Bac-CMV 和空白對照組相比，細(xì)胞遷移速度減慢，進(jìn)一步通過計算劃痕傷口面積，發(fā)現(xiàn)Bac-ChEA 組與Bac-CMV 組相比能顯著抑制HUVEC細(xì)胞傷口愈合（P＜0.05），而Bac-CMV組與空白組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白能夠有效地抑制HUVEC 細(xì)胞的遷移。

2.5 對HUVEC 細(xì)胞血管形成能力的影響通過體外成管實驗驗證桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白是否具備抑制HUVEC 細(xì)胞血管形成的能力。結(jié)果如圖5所示，空白對照組和Bac-CMV 組中HUVEC 細(xì)胞相互聚集，形成清晰可見的小管網(wǎng)絡(luò)，而Bac-ChEA 組的細(xì)胞較分散，抑制了小管形成。進(jìn)一步統(tǒng)計血管網(wǎng)絡(luò)主段長度發(fā)現(xiàn)，與Bac-CMV 組相比，Bac-ChEA組的成管抑制能力更為顯著（P＜0.001）。說明重組桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白能有效抑制HUVEC 細(xì)胞血管的形成。

2.6 體內(nèi)抗腫瘤效果評價為了進(jìn)一步評價桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白體內(nèi)抗腫瘤效果，建立裸鼠皮下HepG2 腫瘤模型。結(jié)果表明（圖6a），PBS 組和Bac-CMV 組的平均腫瘤體積分別在給藥后24 d迅速增長至1 500 mm3，而Bac-ChEA 組明顯抑制了腫瘤體積的增長，直至第38 天才達(dá)到1 500 mm3。小鼠存活率結(jié)果（圖6b）證實，小鼠的壽命（中位生存期）從Bac-CMV 組的24 d 顯著延長（P＜0.05）至Bac-ChEA 組的36 d。這些結(jié)果共同證實桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白能夠在體內(nèi)有效地抑制腫瘤的生長，延長了其生存期。

圖4 桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白對HUVEC 細(xì)胞遷移能力的影響（n=3）Fig.4 Effect of baculovirus-mediated hEA protein on the migration of HUVEC cells（n=3）

3 討論

桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)較其他病毒載體如腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等具有獨特的優(yōu)點：如對人類和哺乳動物不引起致病，能在I 級生物安全實驗室進(jìn)行操作；在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制缺陷，沒有預(yù)先存在的抗體；能容納大片段外源基因插入；重組病毒的構(gòu)建及純化操作簡單等［7］。這些優(yōu)點使得桿狀病毒在疫苗生產(chǎn)［8］、表面展示真核蛋白［9］等方面得到了廣泛的應(yīng)用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)桿狀病毒攜帶含有目標(biāo)細(xì)胞功能啟動子時，能有效地將基因轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞中，使得桿狀病毒作為基因傳遞載體在基因治療方面表現(xiàn)出了很大的潛力［10-11］。

圖5 桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白對HUVEC 細(xì)胞血管形成能力的影響Fig.5 Effect of baculovirus-mediated hEA protein on the angiogenesis of HUVEC cells

圖6 桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白體內(nèi)抗腫瘤效果評價Fig.6 Evaluation of antitumor effect of baculovirus-mediated hEA protein in vivo

本研究以桿狀病毒載體pFastBac DUAL 為骨架，將桿狀病毒pPh 啟動子替換為哺乳動物CMV啟動子，然后在其作用下表達(dá)hEA 基因。通過PCR 和ELISA 檢測hEA 基因成功插入桿狀病毒基因組中，并成功在HUVEC 細(xì)胞中獲得表達(dá)。盡管CMV 是廣譜型哺乳動物啟動子，但SINN 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，CMV 在胚胎干細(xì)胞（ESCs）中的表達(dá)活性很低，因此應(yīng)根據(jù)靶細(xì)胞的類型選擇合適的啟動子。由于血管生成涉及到內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及隨后血管的形成，因此為了證實hEA 蛋白的抗血管生成活性，本研究以HUVEC 細(xì)胞為模型，驗證hEA 蛋白的功能活性。結(jié)果表明，Bac-ChEA能有效抑制HUVEC 細(xì)胞的增殖、遷移以及血管網(wǎng)絡(luò)的形成，裸鼠肝癌腫瘤模型結(jié)果進(jìn)一步表明，Bac-ChEA 能有效抑制肝癌腫瘤體積的增長，小鼠壽命（中位生存期）從Bac-CMV 組的24 d 顯著延長至Bac-ChEA 組的36 d。盡管抗血管生成蛋白表現(xiàn)出了一定的抑制腫瘤生長的潛力，但其主要是通過抑制腫瘤血管生成而非直接針對腫瘤細(xì)胞達(dá)到抗腫瘤目的。有學(xué)者將內(nèi)皮抑素與促凋亡蛋白TRAIL 或與化療藥吉西他濱或與放射療法聯(lián)合應(yīng)用，都表現(xiàn)出了增強的協(xié)同作用［13-15］。因此，為了提高抗血管生成治療效果，聯(lián)合化療或放療以及在桿狀病毒載體中插入多種抗血管生成基因、免疫刺激和腫瘤靶向自殺基因等的雞尾酒療法，成為腫瘤基因治療今后的發(fā)展方向。盡管桿狀病毒作為基因傳遞載體表現(xiàn)出了一定的潛力，但桿狀病毒介導(dǎo)的外源蛋白在宿主細(xì)胞中瞬時表達(dá)以及在體內(nèi)應(yīng)用時載體易被補體系統(tǒng)滅活，極大地影響了蛋白的表達(dá)效率。為此，研究者們開發(fā)了一系列的桿狀病毒嵌合系統(tǒng)，如AAV ITR［16］，Sleeping Beauty［17］系統(tǒng)等，這些系統(tǒng)都可不同程度的延長外源基因的表達(dá)。為了抵抗血清補體系統(tǒng)滅活，通過在桿狀病毒表面展示補體調(diào)節(jié)因子，如DAF［18］、CD46-DAF-CD59 融合蛋白［19］等手段可以有效地抑制補體系統(tǒng)的攻擊。在筆者最近的研究中，借助SB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和表面展示技術(shù)，成功構(gòu)建了既能在哺乳動物細(xì)胞中長效穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白又能有效抵抗補體系統(tǒng)攻擊的重組桿狀病毒載體［20］。

總之，盡管桿狀病毒作為基因傳遞載體仍有不足，但桿狀病毒的安全性以及操作的簡便性使得其作為基因傳遞載體擁有獨特的優(yōu)勢，通過對桿狀病毒改造，可以極大地改善其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。