姜津 羅婷婷 潘煒倫 馮俊杰 鄭皖程 李博

1廣州血液中心（廣州510000）；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣州510515）；3南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（廣州510515）

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是一種細(xì)胞膜來(lái)源的具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)的囊泡，可攜帶重要信息物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及小分子等進(jìn)行細(xì)胞間通訊［1］。由于EV 可穩(wěn)定存在于體液循環(huán)中，使得其成為具有天然優(yōu)勢(shì)的藥物遞送平臺(tái)。目前，EV 已被成功用于化學(xué)藥物、RNA 藥物及納米材料遞送系統(tǒng)的構(gòu)建［2］。但是，由于缺乏高效的純化和載藥方法，EV 作為藥物遞送平臺(tái)的應(yīng)用受到明顯限制。故需構(gòu)建可高效純化與載藥的人工合成脂質(zhì)體、細(xì)胞膜泡等EV 類(lèi)似物用于藥物遞送研究［3］。紅細(xì)胞（red blood cells，RBC）膜同為磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，是人工合成EV類(lèi)似物的重要原料之一。與EV 相比，RBC 更容易從人體中獲得，幾十年來(lái)一直安全、常規(guī)地用于輸血治療。且RBC 是體內(nèi)含量最豐富的細(xì)胞類(lèi)型（約占細(xì)胞總數(shù)的84%），胞內(nèi)不含細(xì)胞核、線(xiàn)粒體等細(xì)胞器［4］，因此紅細(xì)胞膜可大規(guī)模獲取并高效提取純化。在此基礎(chǔ)上制備的人工紅細(xì)胞膜泡（artificial red blood cells membrane vesicle，ARBCMV）可作為遞送載體裝載不同的成像或治療材料，應(yīng)用于疾病的診斷和治療。最近，通過(guò)低滲裂解與物理擠出方法制備的ARBCMV 成功包封聲動(dòng)力治療納米顆粒，并在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其增強(qiáng)腫瘤造影引導(dǎo)的聲動(dòng)力治療效果，但其直接裝載化學(xué)藥物的能力尚未得到證實(shí)［5-6］。阿霉素是一種常用的蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤化療藥物，抗瘤譜較廣，且具有優(yōu)良的熒光特性和光學(xué)穩(wěn)定性。但其毒性反應(yīng)大，長(zhǎng)期單獨(dú)使用可造成不可逆的心臟毒性、骨髓抑制等副反應(yīng)，同時(shí)其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短，難以達(dá)到深層組織腫瘤病灶，構(gòu)建穩(wěn)定且安全的載藥系統(tǒng)能提高其利用效率并減輕毒副作用［7-9］。因此，有必要探索ARBCMV 負(fù)載并遞送藥物的可行性，從而進(jìn)一步拓展ARBCMV 在藥物遞送領(lǐng)域的應(yīng)用。本研究選用低滲裂解與物理擠出方法制備ARBCMV，以人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞來(lái)源EV為對(duì)照，首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究比較兩者形態(tài)、粒徑分布及合成效率，在細(xì)胞水平驗(yàn)證其與人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的融合，并創(chuàng)新性探索載阿霉素ARBCMV 的載藥量及遞送阿霉素進(jìn)入人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的能力，為構(gòu)建穩(wěn)定并安全的阿霉素載藥系統(tǒng)打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料RBC 取自廣州血液中心高轉(zhuǎn)氨酶報(bào)廢血，為經(jīng)過(guò)白細(xì)胞濾器的去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞（400 mL 血袋裝，A 型血，2～6 ℃體外保存35 d以?xún)?nèi)），人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS 1×，pH 7.4，Gibco，500 mL/瓶，C10010500BT-1）、DMEM 培養(yǎng)液（Gibco，500 mL/瓶，C11995500BT-1）、胰酶消化液（Gibco，500 mL/瓶，25200-072）、青霉素-鏈霉素溶液（Gibco，100 mL/瓶，15140122）、胎牛血清（Gibco，50 mL/瓶，A8160802）、去外泌體胎牛血清（Biolog Ical，50 mL/瓶，C38010050-1）、鹽酸-阿霉素（Aladdin，D107159-25 mg）、150 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿（Nest，715001）、六孔培養(yǎng)板（Sorfa，220100）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Solarbio，25 g/瓶，A8020-25）、Hoechst 33342 活細(xì)胞染色液（Solarbio，50 mL/瓶，C0030-50）、0.22 μm 濾器（Merck millipore，250 個(gè)/箱，SLGP033RB）、0.5 mL 超濾管（Merck millipore，100 K，UFC510096-1）、親脂性染料PKH-67（Sigma，1KT，MINI67-1KT）、0.4 μm 聚碳酸酯膜19 mm（Whatman，800282），0.2 μm 聚碳酸酯膜19 mm（Whatman，800281）

1.2 儀器Avanti 擠出器（上海默格機(jī)械有限公司）、ZetaView 納米顆粒追蹤分析儀（英國(guó)Malvern公司）、L-80XP 超高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter 公司），3H16RI 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），H-7650 透射電子顯微鏡（日本HITACHI 公司），SCIENTZSB-5200 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），CKX41 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）、LS-55 熒光分光光度計(jì)（美國(guó)Perkin-Elmer 公司）。

1.3 方法

1.3.1 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞來(lái)源EV的制備細(xì)胞培養(yǎng)：在含有10% 胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞，待其生長(zhǎng)密度為60%～70%時(shí)，用PBS 洗滌細(xì)胞，加入不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h。細(xì)胞饑餓處理后再次用PBS 洗滌，加入含有1%去外泌體血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞上清液并隨機(jī)選擇3 皿細(xì)胞用牛鮑計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

細(xì)胞上清前處理：300 g 離心10 min，2 000 g 離心20 min，10 000 g 離心30 min，離心后均取上清液，最后收集上清液共450 mL。

超速離心法提取外泌體：在離心管中加入36.8 mL 前處理后的細(xì)胞上清液，在135 000 g 的條件下4 ℃離心70 min，棄去上清液。再加入36.8 mL前處理后的上清液重懸管底沉淀，以同樣條件離心后棄去上清液，用200 μL PBS 重懸沉淀后放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 制備ARBCMV洗滌RBC：對(duì)RBC 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取與MDA-MB-231 細(xì)胞數(shù)相同的RBC 進(jìn)行低滲裂解［5］：吸取4.6 μL RBC 稀釋至200 μL 冷PBS 中，用高速冷凍離心機(jī)4 ℃800 g 離心5 min，棄去上清液，重復(fù)3 次。

提取RBC 膜：往洗滌后的RBC 加入200 μL 0.25×冷PBS，放置于冰上低滲裂解紅細(xì)胞20 min，在4 ℃10 000 g條件下離心5 min，棄去上清液，重復(fù)2 次。加入200 μL 純水重懸沉淀，在4 ℃10 000 g條件下離心5 min，棄去上清液，所得沉淀用PBS 洗滌1 次，最后用1 mL PBS 重懸細(xì)胞膜，超聲5 min，得到破碎的紅細(xì)胞膜。

ARBCMV 均一化處理：將所提取的紅細(xì)胞膜用孔徑為400 nm 的聚碳酯纖維膜反復(fù)擠壓5 次，再用孔徑為200 nm 的聚碳酯纖維膜擠壓15 次，得到納米級(jí)ARBCMV，保存于4 ℃?zhèn)溆谩Ｒ?jiàn)圖1。

圖1 ARBCMV 制備過(guò)程Fig.1 Synthesis procedure of ARBCMV

1.3.3 載阿霉素的ARBCMV 制備將阿霉素PBS溶液加入紅細(xì)胞膜提取液中，用400 nm 聚碳酯纖維膜擠壓5 次，再經(jīng)200 nm 的聚碳酯纖維膜擠壓15 次，在4 ℃19 000 g 條件下離心30 min，洗滌沉淀2 次。最后加入PBS 重懸沉淀，得到裝載阿霉素的ARBCMV。

1.3.4 ARBCMV 和EV 的比較用透射電子顯微鏡對(duì)ARBCMV 和EV 進(jìn)行觀察，比較兩者的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。用ZetaView 納米顆粒追蹤分析儀對(duì)稀釋后1 mL ARBCMV 和EV 溶液的顆粒數(shù)和粒徑分布進(jìn)行表征，在此基礎(chǔ)上對(duì)ARBCMV 和EV 分離時(shí)間和提取量進(jìn)行比較，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)兩樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.5 ARBCMV 與人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的融合取1 010 個(gè)ARBCMV 稀釋至250 μL PBS中，加入親脂性染料PKH-67 對(duì)其進(jìn)行染色5 min，以PBS 為空白對(duì)照。再加入500 μL 1% BSA PBS溶液吸附游離染料，用100 KD 超濾管13 900 g 離心10 min，重復(fù)洗滌3 次除去多余染料。將MDAMB-231 細(xì)胞鋪在6 孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS 洗滌2 次，加 入1 mL 培養(yǎng)液及1 mL PKH-67 標(biāo)記后的ARBCMV，避光孵育6 h。用PBS 洗滌細(xì)胞2 次除去游離ARBCMV 后加入Hoechst 33342 活細(xì)胞染料反應(yīng)15 min，PBS 洗滌兩次后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.6 載阿霉素ARBCMV的載藥量分析配制梯度的PBS 阿 霉素溶液：0、0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.22、0.26、0.30、0.34、0.50、0.76、1.00 μg/50 μL。分別測(cè)量其在488 nm 激發(fā)光下，590 nm 處的吸收峰值，根據(jù)熒光值繪制阿霉素?zé)晒鈽?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。測(cè)量載阿霉素ARBCMV 離心后上清液的熒光值，以及加入的阿霉素的熒光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得阿霉素量。ARBCMV 載阿霉素量=載藥前阿霉素量-載藥后上清液中阿霉素量。

1.3.7 ARBCMV 遞送阿霉素進(jìn)入人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞的驗(yàn)證將MDA-MB-231 細(xì)胞鋪在6 孔板上培養(yǎng)24 h，PBS 洗滌2 次，加入顆粒數(shù)為1 010 的載阿霉素ARBCMV 和1 mL 培養(yǎng)液，避光孵育6 h。用PBS 洗滌細(xì)胞2 次除去游離ARBCMV后加入Hoechst 33342 活細(xì)胞染料反應(yīng)15 min，PBS洗滌2 遍后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARBCMV 和EV 的形態(tài)與粒徑見(jiàn)圖2。透射電子顯微鏡下，ARBCMV 和MDA-MB-231 EV 均為具有完整的膜性脂質(zhì)雙分子層的杯狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)為進(jìn)一步裝載藥物提供空間，直徑均為100～200 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［10］。ZetaView 納米顆粒追蹤分析儀檢測(cè)ARBCMV 和MDA-MB-231 EV 的顆粒數(shù)和粒徑分布結(jié)果，制備出的ARBCMV 粒徑峰值為（133.7 ± 5.4）nm，與TEM 的結(jié)果相符，濃度為（3.1±1.2）×1010/mL，從細(xì)胞上清液中提取的MDAMB-231 EV 粒徑峰值為（160.5 ± 4.2）nm，濃度為（10.2 ± 2.4）×1010/mL。結(jié)果證實(shí)人工制備而來(lái)的ARBCMV 粒徑相對(duì)更均一。

2.2 ARBCMV 和EV 分離時(shí)間和提取量比較見(jiàn)表1。ARBCMV 和EV 的分離時(shí)間和提取量比較可知，提取EV 需預(yù)先成功培養(yǎng)細(xì)胞，并超高速離心4 h，操作繁瑣且耗時(shí)達(dá)2～3 d，而ARBCMV 制備僅需普通冷凍高速離心機(jī)和擠出器即可完成實(shí)驗(yàn)，時(shí)長(zhǎng)大約100 min。等量細(xì)胞可提取的MDAMB-231 EV 平均數(shù)量為2.04 × 1010個(gè)，ARBCMV 平均數(shù)量為3.10 × 1010個(gè)，結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，在相同的細(xì)胞數(shù)量情況下，可以提取相近的囊泡數(shù)量，但制備ARBCMV 無(wú)需培養(yǎng)細(xì)胞，更加快速且高效，不依賴(lài)超高速離心機(jī)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求較低，因此更易于推廣應(yīng)用。

圖2 透射電子顯微鏡圖Fig.2 TEM images of ARBCMV

表1 MDA-MB-231 EV 與ARBCMV 分離時(shí)間與提取量比較Tab.1 Comparison of isolation time and yield between ARBCMV and MDA-MB-231 EV

2.3 ARBCMV 與人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的融合見(jiàn)圖3。ARBCMV 經(jīng)過(guò)PKH-67 膜染料染色后與細(xì)胞共孵育可使人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的細(xì)胞膜帶熒光，說(shuō)明ARBCMV 與人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞成功融合，具有作為藥物載體并作用于癌細(xì)胞的潛力。

圖3 ARBCMV 與人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的融合熒光圖（400×）Fig.3 Fluorescent images of breast cancer cells MDA-MB-231 fused with ARBCMV（400×）

2.4 載阿霉素ARBCMV 的載藥量分析通過(guò)阿霉素濃度梯度與熒光值檢測(cè)繪制阿霉素?zé)晒鈽?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。見(jiàn)圖4，熒光強(qiáng)度與阿霉素量相關(guān)性的回歸方程為y=282.230x+4.317，R2= 0.993。載藥前，取1 μL 阿霉素PBS 稀釋20 倍并測(cè)量熒光強(qiáng)度為29.000，代入公式得x=0.087 5，即加入紅細(xì)胞膜懸液中的1 μL 阿霉素量為1.749 μg。同理取擠出后離心所得上清液1 μL 稀釋20 倍后測(cè)得平均熒光強(qiáng)度為22.639，代入公式得x=0.064 9，即1 μL 上清液中阿霉素量為1.298 μg。因此，每mL ARBCMV阿霉素載入量為0.451 μg，說(shuō)明ARBCMV 能負(fù)載阿霉素，具有載藥的能力。

2.5 ARBCMV 遞送阿霉素進(jìn)入人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞的驗(yàn)證由于阿霉素在488 nm 激發(fā)光照射下發(fā)射紅色熒光，載阿霉素ARBCMV與人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞共孵育后熒光圖見(jiàn)圖5。紅光熒光的阿霉素成功進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可以通過(guò)這種方式達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。同時(shí)結(jié)合圖3，證明ARBCMV 能夠通過(guò)與細(xì)胞膜融合遞送阿霉素進(jìn)入人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中，具有作為藥物遞送載體的能力。

圖4 阿霉素?zé)晒鈽?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Standard curve of fluorescence intensity of doxorubicin

3 討論

圖5 ARBCMV 遞送阿霉素進(jìn)入人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞熒光圖（400×）Fig.5 Fluorescent images of breast cancer cells MDA-MB-231 treated with doxorubicin loaded ARBCMV（400×）

紅細(xì)胞在人體血液循環(huán)內(nèi)分布廣泛，取材簡(jiǎn)單方便。本研究在高效提取純化紅細(xì)胞膜的基礎(chǔ)上制備的ARBCMV，具有與EV 類(lèi)似的膜性脂質(zhì)雙分子層環(huán)狀結(jié)構(gòu)，粒徑峰值大小為（133.7±5.4）nm，合成效率高且不依賴(lài)超高速離心設(shè)備，具有負(fù)載阿霉素的能力。并在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其負(fù)載并遞送阿霉素進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞的可行性。由于ARBCMV具有流動(dòng)性的磷脂雙分子層，其可直接與靶細(xì)胞膜融合，從而提高被包封藥物的細(xì)胞內(nèi)化效率，可有效增強(qiáng)治療效果。ARBCMV 作為藥物遞送平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)如下［11］：（1）具有免疫逃避功能，體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)；（2）天然的生物相容性和可降解性；（3）避免納米制劑固有的毒性；（4）可大規(guī)模制備，造價(jià)低廉。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ARBCMV 包裹的載阿霉素和紫杉醇納米粒子在體外實(shí)驗(yàn)中的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果大約是紫杉醇和阿霉素的6 倍［12］；此外，ARBCMV 包裹的長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體在膠質(zhì)瘤小鼠模型體內(nèi)試驗(yàn)中顯示出更長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間和更顯著的療效，與商品化藥物相比，ARBCMV仿生納米顆?？娠@著提高小鼠的存活率［13］。因此，ARBCMV有望成為極具潛力的載藥遞送平臺(tái)應(yīng)用于腫瘤診療。

然而，由于ARBCMV 的膜結(jié)構(gòu)來(lái)源于紅細(xì)胞膜，作為藥物遞送平臺(tái)缺乏治療靶向性。因此，可以借鑒EV 工程化的方法，對(duì)ARBCMV 進(jìn)行修飾和編輯，以期獲得更精準(zhǔn)的腫瘤治療效果。例如，有研究在載阿霉素的EV 表面修飾iRGD 肽段，靶向腫瘤細(xì)胞特異性高表達(dá)的αv 整合素，增加其腫瘤靶向性，進(jìn)而有效減小荷瘤小鼠的腫瘤體積［14］。同時(shí)，cRGD 環(huán)肽可靶向結(jié)合αvβ3 整合素，也具有靶向惡性腫瘤細(xì)胞的作用［15］。前期研究證實(shí)cRGD 修飾在納米顆粒表面可增加載藥納米顆粒的腫瘤靶向性［16-17］，因此理論上cRGD 修飾的載藥ARBCMV 也具有腫瘤靶向性潛力，其治療效果及體內(nèi)組織分布有待動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)［18］。此外，目前也有研究通過(guò)雜化各種囊泡膜結(jié)構(gòu)豐富納米膜泡功能，如紅細(xì)胞膜與癌細(xì)胞膜的雜化膜包裹抗腫瘤藥物［19］，可將免疫逃避的作用與特定腫瘤靶向作用互補(bǔ)，同時(shí)發(fā)揮紅細(xì)胞膜與其它功能化膜的優(yōu)勢(shì)，用于腫瘤細(xì)胞靶向治療和腫瘤穿透治療的研究；功能化脂質(zhì)體與EV 融合增加EV 功能并保存其內(nèi)在含量和生物特性［20］，提高化療藥物的細(xì)胞傳遞效率等。以上研究均為ARBCMV 功能化修飾，進(jìn)而為提高腫瘤靶向治療效率并降低靶外副作用提供借鑒和理論依據(jù)。

綜上所述，本研究構(gòu)建了ARBCMV 高效制備平臺(tái)，合成負(fù)載阿霉素的ARBCMV，證實(shí)其在體外遞送阿霉素進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞的可行性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用新型ARBCMV 藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤精準(zhǔn)診療打下實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。