李智念 羊煉 劉露
摘 要:通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序,本文建立了使用獼猴桃枝條為樣品,直接檢測獼猴桃潰瘍病PSA病原菌的方法。該方法跳過了病原菌培養(yǎng)和DNA提取步驟,大大縮短了檢測時(shí)長,利用微型PCR儀系統(tǒng),使針對(duì)獼猴桃潰瘍病的簡單、低成本、快速現(xiàn)場檢測成為可能。
關(guān)鍵詞:獼猴桃潰瘍病;檢測方法;直接PCR
中圖分類號(hào):S436.634文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1003-5168(2020)20-0139-03
Abstract: By optimizing the PCR reaction system and reaction program, a method for directly detecting the pathogenic bacteria of kiwi fruit ulcer PSA by using kiwi twigs as a sample was established in this paper. The method skips the steps of pathogen culture and DNA extraction, greatly shortens the detection time, and utilizes a micro-PCR system, which makes simple, low-cost and fast on-site detection for kiwi fruit ulcer possible.
Keywords: kiwi fruit ulcer;detection method;direct PCR
近年來,我國獼猴桃種植面積不斷增加,細(xì)菌性潰瘍病快速蔓延[1-2]。在沒有特效防治藥品的現(xiàn)狀下,加強(qiáng)外引苗木的檢疫、及早清除園中感染植株是防范潰瘍病,避免果園全軍覆沒的重要手段。植株感病的早期雖然不表現(xiàn)出相應(yīng)性狀,但已經(jīng)具備傳播擴(kuò)散致病菌的能力,要及早發(fā)現(xiàn)已染病植株并不容易。
PCR檢測能夠高效準(zhǔn)確地鑒定出PSA病原菌,但現(xiàn)有的方法一般要首先采樣培養(yǎng)病原菌,然后提取培養(yǎng)出的菌落DNA,再進(jìn)行PCR檢測。這樣的流程需要專業(yè)人員操作,很難應(yīng)用到獼猴桃園的常規(guī)檢測。面對(duì)基層獼猴桃園主的自主快速檢測方法,目前國內(nèi)還少有報(bào)道。本研究通過優(yōu)化普通PCR的反應(yīng)體系與程序,跳過病原物培養(yǎng)和DNA提取過程,直接以獼猴桃枝條為樣本進(jìn)行PCR反應(yīng);整合現(xiàn)有儀器設(shè)備,避開了常規(guī)PCR試驗(yàn)對(duì)高速離心機(jī)、成像系統(tǒng)或熒光定量系統(tǒng)的依賴,建立了一套簡單、可靠、準(zhǔn)確、快速、低成本的檢測方法,旨在為發(fā)展出一種基層獼猴桃園主用得起、用得上的獼猴挑潰瘍病早期檢測技術(shù),為我國獼猴桃栽培的健康發(fā)展提供幫助。
1 材料與方法
1.1 供試菌種
從明顯發(fā)生潰瘍病的獼猴桃枝條中分離保存的PSA病原菌。
1.2 獼猴桃枝條
分別以明顯發(fā)生潰瘍病的獼猴桃枝條(見圖1)、未見病征的獼猴桃枝條(見圖2)和已確認(rèn)未感染PSA病原菌的獼猴桃枝條(見圖3)為樣品。
1.3 PCR引物
通過文獻(xiàn)分析選取P3F/P5R(5′-GGTTTCGGACACCGCAGGTTCTACCGAG-3′,5′-CTTCCTGATCCCCGTTACCCATCGAC-3′)[3]用于PCR檢測,由上海生工進(jìn)行合成。
1.4 獼猴桃枝條組織取樣量的確定
直接PCR檢測反應(yīng)對(duì)樣品用量由一定要求,樣品量太少,會(huì)導(dǎo)致底物含量過低,無法完成檢測;樣品量太多會(huì)污染PCR反應(yīng)體系,導(dǎo)致目標(biāo)片段的擴(kuò)增無法順利完成[4-9]。為確定取樣量的范圍,本試驗(yàn)以ddH2O為陰性對(duì)照,以稀釋后的獼猴桃PSA菌液為陽性對(duì)照,通過取不同質(zhì)量的健康枝條樣品與PSA菌液混合進(jìn)行PCR檢測來確定樣品取樣量的上限,通過從感病枝條中取不同重量樣品進(jìn)行PCR檢測來確定樣品取樣量的下限。
PCR反應(yīng)體系為:2×Taq PCR Master Mix10ul,上下游引物各0.5 μL,DNA模板10 μL。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 3 min; 95℃變性10 s,58 ℃退火30 s;72 ℃延伸20 s,38個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;20 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測,核算染料為低毒的GelRed染料。
1.5 檢測系統(tǒng)的輕簡化驗(yàn)證
常規(guī)PCR結(jié)果判讀一般是,通過凝膠成像系統(tǒng)底部的紫外燈管,激發(fā)鑲嵌了核酸染料的DNA片段發(fā)出熒光,再通過頂部的相機(jī)鏡頭拍攝下條帶的照片,傳輸至計(jì)算機(jī),呈現(xiàn)結(jié)果。為了適應(yīng)基層低成本輕簡化的操作需求,人們可以嘗試使用紫外手電筒代替成像系統(tǒng)來激發(fā)條帶,直接目測判讀的方式來解讀PCR結(jié)果。
2 結(jié)果與分析
2.1 取樣量對(duì)PCR反應(yīng)的影響
分別取1、0.5、0.1、0.05、0.02、0.01、0.008、0.005、0.002、0.001 g確定未感染獼猴桃PSA菌的健康枝條,將其分別加入500 μL含有PSA菌的ddH2O中搗碎,取10 μL搗碎后的樣品混合液作為反應(yīng)底物,進(jìn)行PCR反應(yīng);以ddH2O為陰性對(duì)照,以稀釋后的獼猴桃PSA菌液為陽性對(duì)照。如圖4所示,PCR結(jié)果表明,陽性對(duì)照擴(kuò)增出目標(biāo)條帶,而陰性對(duì)照未出帶,與預(yù)期相符,即反應(yīng)體系正常工作;樣品質(zhì)量在0.001~0.020 g的反應(yīng)都擴(kuò)增出條帶,并且以0.008 g樣品所對(duì)應(yīng)的條帶亮度最高,而0.05~1.00 g樣品質(zhì)量對(duì)應(yīng)的反應(yīng)都未見條帶。這表明在本檢測體系條件下,最適的取樣量為0.008 g左右,樣品量高于0.02 g則很可能會(huì)打亂反應(yīng)體系,導(dǎo)致檢測PCR擴(kuò)增無法進(jìn)行。
分別取1、0.5、0.1、0.05、0.02、0.01、0.008、0.005、0.002、0.001 g確定明顯感染獼猴桃PSA菌的枝條,將其分別加入500 μL的ddH2O中搗碎,取10 μL搗碎后的樣品混合液作為反應(yīng)底物,進(jìn)行PCR反應(yīng);以ddH2O為陰性對(duì)照,以稀釋后的獼猴桃PSA菌液為陽性對(duì)照。如圖5所示,PCR結(jié)果表明,陽性對(duì)照擴(kuò)增出目標(biāo)條帶,而陰性對(duì)照未出帶,與預(yù)期相符,即反應(yīng)體系正常工作;樣品量在0.008~0.020 g的反應(yīng)都擴(kuò)增出條帶,并且以0.008 g樣品所對(duì)應(yīng)的條帶亮度最高,而0.05~1.00 g樣品質(zhì)量和0.000 1~0.0050 g樣品質(zhì)量對(duì)應(yīng)的反應(yīng)都未見條帶。這表明在本檢測體系條件下,取樣量低于0.005 g會(huì)導(dǎo)致模板量過低,無法檢測出已感病材料。
通過對(duì)不同取樣量的檢測結(jié)果分析可知,在21 μL反應(yīng)體系下,取0.008~0.050 g的獼猴桃枝條組織,加入ddH2O(可用怡寶純凈水代替)中搗碎,取10 μL混合液作為PCR反應(yīng)的底物,能完成獼猴桃PSA病原菌的直接PCR檢測。
2.2 輕簡化系統(tǒng)的可行性驗(yàn)證
為適應(yīng)基層果園無專業(yè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、無專業(yè)分子檢測人員的應(yīng)用場景,將實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行了設(shè)備和試劑進(jìn)行輕簡化嘗試。
試劑準(zhǔn)備階段:將500 μL怡寶純凈水裝入1.5 mL EP管中;將引物與PCR反應(yīng)MIX制成預(yù)混液,并分裝入PCR反應(yīng)管中冷凍保存;將2%瓊脂糖凝膠制作完成后,用自封袋密封保存;將10 mL的50倍TAE母液裝入塑料試管保存。
模擬使用階段:分別取檢測范圍內(nèi)的健康枝條樣品、染病枝條樣品,加入預(yù)裝500 μL純凈水的EP管中,小研磨輥磨碎,取10 μL加入預(yù)裝有反應(yīng)液的PCR管中,上微型PCR儀器,以預(yù)定程序反應(yīng)。將預(yù)裝的TAE母液倒入新開的怡寶純凈水中,搖勻制成電泳緩沖液體。將完成反應(yīng)的PCR產(chǎn)物上樣到預(yù)制的瓊脂糖凝膠中,在微型電泳儀上進(jìn)行電泳反應(yīng)。電泳完成后用紫外手電筒照射,進(jìn)行目視判定,染病枝條樣品出現(xiàn)明顯的亮條帶,而健康枝條樣品并未出現(xiàn)條帶,如圖6所示。
3 結(jié)論
隨著對(duì)獼猴桃潰瘍病菌(丁香假單胞菌獼猴桃變種Pseudomonas syrimgae PV.actinidiae,PSA)[10-13]研究的深入,基于普通PCR的檢測方法已經(jīng)被逐漸建立和完善,如已報(bào)道的KN-RCR[14]、RG-PCR[15]等技術(shù);也有基于定量PCR技術(shù)的檢測方法被報(bào)道。這些技術(shù)的建立,幫助專業(yè)人員準(zhǔn)確地區(qū)分出PSA和其他相似菌株,可以對(duì)無病征、未發(fā)病的果園進(jìn)行早期檢測。但是,這些檢測需要在專業(yè)的分子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,需要具有相應(yīng)分子生物學(xué)專業(yè)技能的人員操作,耗時(shí)較長,檢測成本較高?;鶎庸麍@主難以應(yīng)用PCR技術(shù)開展自主檢測,在日常果園管護(hù)中早發(fā)現(xiàn)、早處理還不現(xiàn)實(shí)。本研究通過實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證,建立了一套應(yīng)用普通PCR檢試劑、傻瓜化檢測的方法,無須專業(yè)背景即可在說明指導(dǎo)下完成操作,結(jié)果準(zhǔn)確。該方法所需儀器極為輕簡,相對(duì)于建立整套分子實(shí)驗(yàn)室,成本低廉。本研究建立的獼猴桃潰瘍病快速檢測方法,降低了檢測操作難度、檢測成本,縮短了檢測時(shí)間,應(yīng)用前景廣闊。
參考文獻(xiàn):
[1]高小寧,趙志博,黃其玲,等.獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病研究進(jìn)展[J].果樹學(xué)報(bào),2012(2):262-268.
[2]李黎,鐘彩虹,李大衛(wèi),等.獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的研究進(jìn)展[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013(5):124-133.
[3]Gallelli A,Talocci S,Pilotti M,et al.Realtime and qualitative PCR for detecting Pseudomonas syrimgae pv.actinidiae isolates causing recent outbreake of kiwifruit cacterial canker[J].Plant Pathology,2013(2):264-276.
[4]龐冰,王艷梅,郝建平,等.谷子種子DNA快速提取新方法[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2018(5):680-682.
[5]張晉強(qiáng),薛翼鵬,李曉云,等.血液直接PCR方法在豬嗜血支原體檢測中的應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015(8):1244-1247.
[6]羅天寬,張小玲,朱世楊,等.應(yīng)用水稻葉片直接PCR擴(kuò)增的方法[J].分子植物育種,2015(11):2590-2592.
[7]陸紹紅,陳睿,樓滌,等.直接PCR法檢測血液中伊氏錐蟲感染[J].寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào),2006(4):204-207.
[8]閔現(xiàn)華,韓躍武,劉箐,等.種傳番茄潰瘍病菌直接PCR和免疫捕捉PCR檢測方法之比較[J].植物檢疫,2010(4):12-16.
[9]邢珍娟,董立明,劉娜,等.應(yīng)用直接PCR技術(shù)快速篩查轉(zhuǎn)基因玉米方法研究[J].玉米科學(xué),2017(1):29-33.
[10]Abelleira A,Lopez M M,Penalver J,et al.First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syrimgae pv.actinidiae in Spain[J].Plant Diswase,2011(12):1583.
[11]Evereti K R,Taylor R K,Romberg M K,et al.First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syrimgae pv.actinidiae in New Zealand[J].Australasian Plant Disease Notes,2011(1):67-71.
[12]Vanneste J L,Poliakoff F,Audusseau C,et al.First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syrimgae pv.actinidiae in France[J].Plant Disease,2011(95):1311.
[13]趙利娜,胡家勇,葉振風(fēng),等.獼猴桃潰瘍病病原菌的分子鑒定和致病力測定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012(5):604-608.
[14]Koh Y J,Nou I S.DNA Markers for identification of Pseudomonas syrimgae pv.actinidiae[J].Molecules & Cells,2002(2):309-314.
[15]Reesgeorge J,Vanneste J L,Cornish D A,et al.Detection of Pseudomonas syringae pv.actinidiae uesing polymerase chain reactiin(PCR) primers based on the 16S-23SrDNA inertanscribed spacer region[J].Plant Pathology,2010(3):453-464.