楊興變 鄭雯 何珺 康冀川 李洪慶

摘?要：本文建立了一種利用大孔樹(shù)脂分離富集缺陷假單胞菌HD13發(fā)酵液中抑制水稻紋枯病菌活性物質(zhì)的方法。以水稻紋枯病菌為測(cè)試病原菌，采用缺陷假單胞菌HD13發(fā)酵液考察D101、LX-60、XDA-6、LSA-12、XDA-8G、LX-17共

6種大孔樹(shù)脂對(duì)HD13菌株發(fā)酵液中抑制水稻紋枯病菌活性物質(zhì)的分離效果。結(jié)果表明：XDA-8G樹(shù)脂對(duì)其有很好的分離和富集作用，主要集中在40%乙醇洗脫液中，該方法成本低、操作簡(jiǎn)單、快速，可為后續(xù)大量發(fā)酵提供實(shí)踐依據(jù)。

關(guān)鍵詞：缺陷假單胞菌發(fā)酵液;活性物質(zhì);大孔樹(shù)脂;水稻紋枯病菌

中圖分類號(hào)：TQ920.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2020）02-0085-04?國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.03.015

Study on the method for enriching and isolating the inhibiting active substances of Thanatephorus cucumeris from fermantientation broth of Pseudomonasdiminita HD13 by Macro-Porous Adsorption Resin

YANG Xingbian.1， ZHEN Wen.1，2，HE Jun.1，KANG Jichuan.1*，LI Hongqing.3*

（1.Engineering and Research Center of Guizhou Province of China，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China ; 2.College of Pharmacy，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;3. College of Chemistry and Environmental Science，Guizhou Minzu University，Guiyang，Guizhou 550025，China ）

Abstract：In this paper， a method for separating and enriching inhibiting active substances of Thanatephorus cucumeris from the fermentation broth of Pseudomonasdiminita HD13 by using macroporous resin was established. Using Thanatephorus cucumeris as the test pathogen， six macroporous resins （D101， LX-60， XDA-6， LSA-12， XDA-8G and LX-17） were used to separate the inhibiting active substances of Thanatephorus cucumeris from the fermentation broth of Pseudomonasdiminita HD13.The results showed that XDA-8G resin had a good separation and enrichment effect. The inhibiting active substances were concentrated in the 40% alcohol eluent. The method has low cost， simple and fast operation， and can provide practical basis for subsequent large-scale fermentation.

Keywords：the fermentation broth of Pseudomonasdiminita; active substances; macroporous resin;Thanatephorus cucumeris

缺陷假單胞菌屬于假單胞桿菌科，假單胞桿菌屬，球菌類型，是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性好氧桿菌，能夠利用多種有機(jī)物，為自身提供碳源和能源。因而在自然界中分布十分廣泛，其專性需氧，可在植物根系內(nèi)部建立種群并抑制其它微生物的生長(zhǎng)，其產(chǎn)生的 2，4-二乙酰滕黃酚、藤黃綠菌素、吩嗪類、脂多肽、硝吡咯菌素、氫氰酸等類型的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)多種微生物具有抑制作用[1-3]。BURR等[4]報(bào)道熒光假單胞菌對(duì)甜菜、馬鈴薯等作物具有增產(chǎn)作用;WELLER等[5]

利用熒光假單胞菌防治小麥全蝕病;THOMASSHOW等[6]利用惡臭假單胞菌抑制鐮刀菌厚垣孢子的萌發(fā);楊藝煒[7]發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌對(duì)煙草黑脛病及其游動(dòng)孢子有抑制作用。此外，假單胞菌屬對(duì)棉花黃萎病、水稻稻瘟病、水稻鞘腐病、煙草黑脛病、小麥全蝕病、番茄斑萎病毒等均有較好的防治效果[8-11]。

微生物來(lái)源廣，生長(zhǎng)周期短，可通過(guò)大規(guī)模發(fā)酵實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，與動(dòng)植物相比，具有潛在的產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢(shì)。微生物

及其代謝產(chǎn)物的多樣性，為發(fā)現(xiàn)新藥以及先導(dǎo)化合物提供了豐富的資源[12]。然而，發(fā)酵液中含有眾多次級(jí)代謝產(chǎn)物的同時(shí)，也存在眾多成分不明及復(fù)雜的天然基質(zhì)，諸如牛肉膏、蛋白胨等。因此，從發(fā)酵液中分離和純化得到高純度的微生物活性物質(zhì)是研發(fā)工作的最終目標(biāo)，而建立其活性物質(zhì)快速富集與分離的方法對(duì)實(shí)現(xiàn)這一最終目標(biāo)具有非常重要的意義。

缺陷假單胞菌HD13是貴州省生化工程中心真菌室從微生物菌劑中得到的一株拮抗細(xì)菌。初步研究表明，該菌株對(duì)水稻紋枯病菌、煙草黑脛病、辣椒灰霉病、番茄黑斑病、水稻稻疫病、小麥赤霉病、辣椒炭疽病、番茄早疫病等多種植物病原菌均具有拮抗活性，對(duì)水稻紋枯病菌抑菌活性最為顯著，且發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性良好。唐遠(yuǎn)江等

[1]將缺陷假單胞菌HD13菌株30 ℃發(fā)酵4 d后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾、濃縮，再經(jīng)石油醚、氯仿、正丁醇等不同有機(jī)試劑萃取、硅膠層析柱分離、浸提等步驟分離得到活性組分[1]，該方法成本高、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)。因此，本文以水稻紋枯病菌為測(cè)試病原菌，考察D101、LX-60、XDA-6、LSA-12、XDA-8G、LX-17等6種大孔樹(shù)脂對(duì)HD13菌株發(fā)酵液中抑制水稻紋枯病菌活性成分的富集與分離效果，以期篩選到其富集和分離效果最佳的樹(shù)脂，進(jìn)一步簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)程序，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1?供試菌株

缺陷假單胞菌（Pseudomonasdiminita）HD13，水稻紋枯病病原菌（Thanatephorus cucumeris）WK，均保藏于貴州省生化工程中心。

1.1.2?供試樹(shù)脂

供試樹(shù)脂為非極性（D101，LX-60）、弱極性（XDA-6，LSA-12）、極性（XDA-8G，LX-17），均由西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司提供。

1.1.3?供試試劑

工業(yè)乙醇（95%）、HCL（貴州省生化工程中心易制毒實(shí)驗(yàn)室提供）、NaOH（分析純）、蒸餾水（貴州省生化工程中心中試基地）。

山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)2020年

1.1.4?培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA） 、 營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）固體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）液體培養(yǎng)基。

1.2?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1?水稻紋枯病病原菌（WK）的活化

將WK菌種接種于9 cm的PDA培養(yǎng)皿中，28 ℃暗培養(yǎng)，待菌絲體長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?缺陷假單胞菌HD13發(fā)酵液的制備

將菌株HD13接種于NB固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h活化。制備NB液體培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌30 min后接種活化好的菌株，30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h作為種子液。將HD13的種子液以1%的接種量接種于裝有2 L NB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中，作為發(fā)酵液于30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)3 d。

1.2.3?不同型號(hào)大孔樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液抑菌活性成分的影響

取HD13發(fā)酵液120 mL加入活化好的樹(shù)脂（20 g）柱中，控制流速在1.5 mL/min左右，以20 mL為單位接取流出液6份，分別濃縮至干，稱重;再分別用20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、無(wú)水乙醇各120 mL依次沖洗，收集各組分洗脫液，并將各組分洗脫液與原發(fā)酵液分別濃縮至干，稱重。

1.2.4?活性實(shí)驗(yàn)

采用菌絲生長(zhǎng)抑制法進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。具體方法為：試驗(yàn)組加入0.05 g流出液或洗脫液濃縮物，對(duì)照組加入0.05 g HD13發(fā)酵液濃縮物，空白組加入0.05 g蒸餾水，加入比例適當(dāng)?shù)沫傊奂榜R鈴薯葡萄糖瓊脂粉2.4 g，60 mL蒸餾水，充分搖勻，121 ℃滅菌，再在無(wú)菌條件下，倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，制成含藥培養(yǎng)基、對(duì)照培養(yǎng)基及空白培養(yǎng)基，每個(gè)做3組平行。待培養(yǎng)基冷卻凝固，在無(wú)菌條件下，用直徑7 mm打孔器在培養(yǎng)好的WK菌落邊緣切取菌餅，用接種針將切取的菌餅正放于培養(yǎng)皿中央，蓋上皿蓋，倒置于培養(yǎng)箱中，28 ℃下培養(yǎng)至空白組菌絲體長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。通過(guò)十字交叉法測(cè)定菌落直徑，按下列公式計(jì)算WK菌絲生長(zhǎng)的抑制率[13]。

2?結(jié)果與分析

由表1可知，發(fā)酵液經(jīng)D101、LX-60、 XDA-6、LSA-12樹(shù)脂處理后，其重量主要分布在20%乙醇洗脫部分，發(fā)酵液經(jīng)XDA-8G樹(shù)脂處理后，其重量主要分布在20%及40%乙醇洗脫部分，發(fā)酵液經(jīng)LX-17樹(shù)脂處理后，其重量主要分布在流出液部分，說(shuō)明LX-17樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液中物質(zhì)基本不吸附。從各型號(hào)樹(shù)脂流出液的重量合計(jì)來(lái)看，各型號(hào)樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液中物質(zhì)的吸附能力為XDA-8G>D101> LX-60> LSA-12> XDA-6>LX-17。

表2、表3試驗(yàn)結(jié)果表明，D101、LX-60、XDA-6、LSA-12、LX-17型號(hào)大孔樹(shù)脂對(duì)缺陷假單胞菌HD13發(fā)酵液中抑制水稻紋枯病菌的活性物質(zhì)基本無(wú)富集作用。經(jīng)XDA-8G處理后，抑制水稻紋枯病菌的活性物質(zhì)主要集中在40%的乙醇洗脫部分，其抑制率達(dá)到37.3%，是發(fā)酵液的6.2倍，說(shuō)明用XDA-8G處理能起到很好的富集和分離作用。

3?結(jié)論與討論

利用大孔樹(shù)脂處理假單胞菌發(fā)酵液的研究不多。翟熙倫[14]利用D101大孔樹(shù)脂對(duì)蒙氏假單胞菌發(fā)酵液進(jìn)行吸附，用不同濃度甲醇進(jìn)行洗脫，并進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定，隨著甲醇濃度升高，洗脫物質(zhì)的活性下降，說(shuō)明目標(biāo)活性物質(zhì)與其他雜質(zhì)得到了有效的分離。楊松等[15]利用非極性大孔樹(shù)脂sp207除去銅綠假單胞菌發(fā)酵液中醇溶性糖類物質(zhì)，利用陰離子交換樹(shù)脂吸附銅綠假單胞菌發(fā)酵液中產(chǎn)酰化高絲氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子抑制劑，并取得了較好的分離效果。

本文通過(guò)考察6種大孔樹(shù)脂對(duì)缺陷假單胞菌HD13發(fā)酵液中抑制水稻紋枯病菌活性物質(zhì)的富集和分離效果，發(fā)現(xiàn)XDA-8G對(duì)其具有很好的富集和分離作用，其主要集中在40%的乙醇洗脫部分，該洗脫部分干重為0.4615 g，為總發(fā)酵液干重質(zhì)量的26.5%;且抑制率達(dá)到37.3%，是發(fā)酵液的6.2倍，說(shuō)明用XDA-8G處理能將HD13發(fā)酵液中大部分的抑制水稻紋枯病菌活性物質(zhì)富集起來(lái)，且活性物質(zhì)集中在40%的乙醇洗脫部分。與唐遠(yuǎn)江等[1]對(duì)缺陷假單胞菌HD13發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾、濃縮，再經(jīng)石油醚、氯仿、正丁醇等不同有機(jī)試劑萃取、硅膠層析柱分離、浸提等實(shí)驗(yàn)步驟分離得到活性組分相比，該方法成本低、操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)周期短，可為后續(xù)大量發(fā)酵提供依據(jù)。

參?考?文?獻(xiàn)：

[1] 唐遠(yuǎn)江.缺陷假單胞菌 HD13（Pseudomonas diminuta）抗植物病原真菌及其活性組分的研究[D].

貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2016.

[2] 唐遠(yuǎn)江，雷幫星，康冀川，等.缺陷假單胞菌HD13發(fā)酵過(guò)程中生物量和抗菌活性的變化[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：92-95.

[3] 李宙陽(yáng)，周英.刃天青顯色法檢測(cè)銅綠假單胞菌對(duì)幾種抗菌藥物的敏感性[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2010，29（3）：237-241.

[4] BURR T J，SSHROTH M N，SUSLOW T.Increased potato yields by treatment of seed pieces with specific strain of Pseudomonas fluorescens and putida[J].Phytopathology，1978（68）：1377-1383.

[5] WELLER D M. Biological control of soilbome plant pathogens in the rhizosphere with bacteria [J].Annual

review of phytopathology， 1988（26） ：379-407.

[6] THOMASHOW L S，WELLER D M， BONSALL R F.Production of the antibiotic phenazine-1-carboxylic acid by fluorescent Pseudomonas in the rhizosphere of wheat[J].Applied and environmental microbiology， 1990（56）：908-912.

[7] 楊藝煒. 綠針假單胞菌XF10對(duì)煙草黑脛病菌的拮抗作用研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2018.

[8] HOWELL C R，STIPANOVIC R D.Suppression of pythium ultimum-induced damping-off of cotton seedlings by Pseudomonas fluorescens and its antibiotic pyoluteorin[J].Phytopathology，1980（70）：712-715.

[9] 沙月霞，張昂，伍順華，等.防治稻瘟病假單胞菌的篩選及效果評(píng)價(jià)[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2019， 34（3）：414-422.

[10] 李芮.解淀粉芽孢桿菌41B-1、銅綠假單胞菌841P-3對(duì)棉花根圍土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[11] KANDAN A，COMMARE R R. Nandakumar R，et al.Induction of phenylpropanoid metabolism by Pseudomonas fluorescens against tomato spotted wilt virus in tomato[J].Folia microbiologica，2002，47（2）：121-129.

[12] 王俊波，曹文濤.大孔樹(shù)脂吸附法高通量快速提取微生物次生代謝產(chǎn)物[J].華中農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（6）：731-735.

[13] 鄭雯，楊興變，康冀川，等.賴氨酸芽孢桿菌 He14 發(fā)酵產(chǎn)物抗真菌活性的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2019，45（18）：22-26.

[14] 翟熙倫.蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）的活性小分子物質(zhì)對(duì)TMV、PVY的抑制作用[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

[15] 楊松，陳曉藝，郭繼強(qiáng)，等.銅綠假單胞菌產(chǎn)?；呓z氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子抑制劑的生產(chǎn)及分離[J].生物技術(shù)通訊，2009，3（20）：373-375.