張瑤　宋爽　楊明秀　彭莉莉　張俊華

摘要 選育和應(yīng)用抗病品種是防治水稻細(xì)菌性病害最經(jīng)濟(jì)有效的措施。本研究采用苗期噴霧法和針刺法對(duì)黑龍江省42個(gè)水稻主栽品種進(jìn)行抗性鑒定。結(jié)果表明，利用針刺法鑒定的各水稻品種中表現(xiàn)中抗以上的品種有14個(gè)，其中高抗品種2個(gè)，對(duì)接種水稻品種病斑長(zhǎng)度進(jìn)行差異顯著性分析，42個(gè)水稻主栽品種間抗性存在顯著差異;利用噴霧法鑒定各品種，病級(jí)表現(xiàn)1級(jí)的品種有7個(gè)，占16.7%。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，針刺法和噴霧法對(duì)抗病品種鑒定的結(jié)果基本一致。本研究鑒定的2個(gè)高抗稻種資源對(duì)于抗細(xì)菌性褐斑病生產(chǎn)實(shí)踐提供重要價(jià)值。因此，加大對(duì)水稻品種資源的深入研究，對(duì)實(shí)現(xiàn)水稻細(xì)菌性褐斑病的可持續(xù)控制有著重要意義。

關(guān)鍵詞 主栽水稻品種; 細(xì)菌性褐斑病; 抗性鑒定

中圖分類號(hào)： S 435.111.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019155

Resistance identification of rice varieties to bacterial leaf brown spot diseases in Heilongjiang

ZHANG Yao， SONG Shuang， YANG Mingxiu， PENG Lili， ZHANG Junhua*

（College of Agriculture， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China）

Abstract

Breeding resistant varieties is one of the most economical and efficient measure which can prevent rice bacterial leaf brown diseases. Two methods were conducted to test 42 leading rice varieties in Heilongjiang province for identification of resistance. The result of inoculating all these rice varieties by artificial acupuncture illustrated that only 14 varieties showed medium to high resistance， of which two varieties showed high resistance levels. Significant difference analysis on the length of lesions inoculated with rice varieties demonstrated that there were obvious differences among 42 leading rice varieties. Spraying inoculation test indicated that seven of these rice varieties showed Grade I susceptibility， accounting for 16.7%. Comparing and analyzing these data， we found that two inoculation methods had basically consistent results. Particularly， two high resistance varieties found in this study are of important significance for the production practice of bacterial leaf brown spot diseases. Therefore， further research on rice germplasm resources has the profound influence for the sustainable control of rice bacterial leaf brown spot diseases.

Key words

leading rice variety; bacterial leaf brown spot disease; identification of resistance

水稻細(xì)菌性褐斑病是由丁香假單胞菌丁香致病變種Pseudomonas syringae pv. syringae引起的一種重要的水稻細(xì)菌性病害[1]。該病1955年在匈牙利發(fā)現(xiàn)，1960年在我國(guó)首次報(bào)道。水稻細(xì)菌性褐斑病在我國(guó)東三省地區(qū)較為常見(jiàn)，自水稻苗期至成熟期都有發(fā)生，主要為害水稻葉片。低溫潮濕條件下水稻易感病。發(fā)病初期水稻葉片上產(chǎn)生水漬狀病斑，后病斑逐漸擴(kuò)大，形成褐色壞死斑[2]。近年來(lái)，該病在黑龍江省不同地區(qū)一直有不同程度的發(fā)生，影響了水稻品質(zhì)及產(chǎn)量。該病的發(fā)生和流行除受到菌源與環(huán)境因素影響外，還與品種的抗病性密切相關(guān)，因此，利用抗病品種來(lái)控制病害流行是最經(jīng)濟(jì)有效的措施[3-4]。研究水稻細(xì)菌性病害常采用噴霧法接種，該方法的優(yōu)點(diǎn)是病菌主要從氣孔侵入使接種體分散均勻，植株各個(gè)部位均可接觸到細(xì)菌。噴霧法接種操作方便，效率高，接近于病菌的自然侵染狀態(tài)，鑒定結(jié)果與品種在田間表現(xiàn)相近，一直受到國(guó)內(nèi)外研究者的好評(píng)[5-6]。也有研究者針對(duì)田間暴風(fēng)雨后病害突然暴發(fā)的特點(diǎn)及有些年份在噴霧接種后出現(xiàn)發(fā)病不均勻或病情不穩(wěn)定等狀況，提出采用針刺接種法，通過(guò)在葉片上造成一些傷口提高病菌侵染概率[7]。針刺法接種成功率高，噴霧法接種葉片表面受菌均勻。目前，國(guó)內(nèi)外未曾報(bào)道過(guò)不同水稻品種對(duì)水稻細(xì)菌性褐斑病的抗性研究，因此對(duì)水稻細(xì)菌性褐斑病的最佳接種方法及抗感分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)還未明確。本文收集到黑龍江省水稻生產(chǎn)上的42個(gè)主栽品種，利用致病力強(qiáng)的菌株采用針刺法和噴霧法分別對(duì)這42個(gè)水稻品種進(jìn)行抗性鑒定。以期對(duì)水稻細(xì)菌性褐斑病的防治和育種提供理論依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種：共42個(gè)，均是黑龍江省水稻產(chǎn)區(qū)主栽品種。

供試菌株：供試細(xì)菌性褐斑病菌株P(guān)R701（GenBank accession number：MK453195），分離鑒定為Pseudomonas syringae pv. syringae，經(jīng)反復(fù)接種驗(yàn)證，為致病力較穩(wěn)定的菌株，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，用50%甘油凍存于-20℃冰箱備用。

NA培養(yǎng)基：氯化鈉5 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂粉20 g，定容至1 000 mL，pH 7.0;NA液體培養(yǎng)基：氯化鈉5 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，定容至1 000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 接種與調(diào)查

水稻種子播種前用75%乙醇進(jìn)行表面消毒后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗干凈。于5月中旬進(jìn)行盆栽播種，每品種每盆播種20～25粒（盆高10.5 cm，直徑11.5 cm）。6月下旬，待水稻葉片為5～6葉期時(shí)，對(duì)盆栽水稻植株進(jìn)行噴霧和針刺接種，每盆為1次重復(fù)，每處理設(shè)3次重復(fù)。將供試菌株于NA培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)菌落到NA液體培養(yǎng)基，27℃恒溫?fù)u床150 r/min培養(yǎng)24 h，配制成3×108cfu/mL的菌懸液[8]。

噴霧接種時(shí)采用噴壺手動(dòng)噴霧，移動(dòng)噴頭將菌液均勻地噴灑在水稻葉片上，每盆噴菌量3～5 mL，接種后套袋保濕，溫室溫度控制在28℃左右，濕度70%～90%，21 d后調(diào)查不同品種的發(fā)病情況，記錄每株水稻苗的總?cè)~數(shù)、病葉數(shù)、病葉級(jí)數(shù)[9]。

針刺接種時(shí)選平展葉片，利用單針蘸取菌懸液進(jìn)行接種。針刺部位位于葉片中上部位中脈兩側(cè)，每片葉片接種5個(gè)點(diǎn)，每盆接種15片葉，針刺接種菌懸液濃度為3×108 cfu/mL，使針刺部位與菌懸液接觸充分，保證接種成功[10-11]。套袋保濕，21 d后，每盆測(cè)量10個(gè)病斑，記錄病斑長(zhǎng)度，通過(guò)SPSS軟件計(jì)算每個(gè)處理的平均值，將病斑的平均長(zhǎng)度作為衡量不同品種抗感水平的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 抗感分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

本研究中水稻細(xì)菌性褐斑病抗感分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照水稻細(xì)菌性條斑病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)際水稻所對(duì)白葉枯病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)鑒定結(jié)果篩選制定水稻細(xì)菌性褐斑病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：以完整葉為標(biāo)準(zhǔn)，0級(jí)，無(wú)病斑;1級(jí)，病斑面積為葉面積10%以下;3級(jí)，病斑面積為葉面積的11%～25%;5級(jí)，病斑面積為葉面積的26%～45%;7級(jí)，病斑面積為葉面積的46%～59%;9級(jí)，病斑面積為葉面積的60%以上 [12-14]。

針刺接種抗感分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照水稻細(xì)菌性病害[9，15]及噴霧法接種病斑級(jí)別結(jié)果進(jìn)行界定：高抗（HR），平均病斑長(zhǎng)度≤1 mm;中抗（MR），1 mm<平均病斑長(zhǎng)度≤2 mm;中感（MS），2 mm<平均病斑長(zhǎng)度≤3.5 mm;高感（HS），平均病斑長(zhǎng)度>3.5 mm。

2 結(jié)果與分析

2.1 針刺接種水稻品種對(duì)水稻細(xì)菌性褐斑病菌的抗感反應(yīng)

采用針刺接種法，42個(gè)水稻主栽品種對(duì)PR701菌株的抗性差異區(qū)分較明顯。42個(gè)水稻品種對(duì)細(xì)菌性褐斑病表現(xiàn)高抗、中抗、中感、高感的資源分別占比為4.76%（2個(gè)）、28.57%（12個(gè)）、57.14%（24個(gè)）、9.52%（4個(gè)），見(jiàn)圖1。對(duì)PR701菌株表現(xiàn)中抗及以上水平的品種有14個(gè)，占33.3%，其中，‘豐育2號(hào)‘龍澤12‘墾稻17等表現(xiàn)中抗水平， ‘牡丹江29‘龍澤16號(hào)表現(xiàn)為高抗，牡丹江和龍澤系列其他品種篩選結(jié)果也均為中抗以上水平。中感和高感水平的大多數(shù)為龍粳系列品種（表1）。

對(duì)接種后產(chǎn)生的病斑長(zhǎng)度進(jìn)行差異顯著分析，結(jié)果（表2）表明，供試的42個(gè)水稻主栽品種對(duì)PR701菌株的抗性存在顯著差異。其中，‘松粳10‘東農(nóng)428‘龍糯325‘新墾17‘龍稻20號(hào)‘合江1號(hào)等品種感病性較強(qiáng);‘牡丹江29‘龍澤16號(hào)等品種抗病性較強(qiáng)，圖2為針刺接種后抗感品種葉片表現(xiàn)。

所有供試的雜交水稻品種中，龍粳與龍稻系列水稻品種居多，抗性鑒定結(jié)果表明，龍粳系列、龍稻系列、松粳系列品種大多數(shù)表現(xiàn)為中感以上水平;而牡丹江系列、龍澤系列、部分墾稻系列品種對(duì)水稻細(xì)菌性褐斑病抗性較好，表1中42個(gè)水稻品種抗感差異明顯，其中‘牡丹江29‘龍澤16號(hào)為高抗品種，說(shuō)明雜交水稻品種的抗性與其父本、母本的抗性密切相關(guān)?！档そ?9‘龍澤16號(hào)在生產(chǎn)栽培過(guò)程中可廣泛推廣種植，以提高水稻的品質(zhì)及產(chǎn)量。

2.2 噴霧接種水稻品種對(duì)水稻細(xì)菌性褐斑病菌的抗感反應(yīng)

結(jié)合針刺接種結(jié)果，制備PR701菌懸液對(duì)不同水稻品種進(jìn)行噴霧接種，根據(jù)病斑面積占總?cè)~片面積的大小，得到不同水稻品種抗性分級(jí)結(jié)果，圖3為不同抗性級(jí)別病斑在水稻葉片上的表現(xiàn)情況。根據(jù)表2可知，在所有供試的水稻品種中，對(duì)PR701菌株病級(jí)表現(xiàn)1級(jí)的品種有7個(gè)，占16.7%，代表如‘牡丹江29‘龍澤16號(hào)‘豐育2號(hào)‘墾稻17等;病級(jí)表現(xiàn)3級(jí)的品種有20個(gè)，占47.6%，代表如‘龍稻13‘牡丹江28‘墾稻6等;病級(jí)表現(xiàn)5級(jí)的品種有11個(gè)，占26.2%，代表如‘龍稻20號(hào)‘空育131‘龍粳39號(hào)等;抗性表現(xiàn)7級(jí)的品種有3個(gè)，占7.1%，分別為‘龍糯325‘新墾17‘東農(nóng)428;抗性表現(xiàn)9級(jí)的品種有1個(gè)，占2.4%，代表品種‘松粳10。通過(guò)上述數(shù)據(jù)可知，噴霧接種抗性表現(xiàn)為3級(jí)

和5級(jí)的水稻品種居多，這些品種在針刺接種過(guò)程中抗性表現(xiàn)多為中感水平，針刺接種結(jié)果與噴霧接種結(jié)果基本一致。

3 討論

目前水稻細(xì)菌性病害的抗性鑒定主要通過(guò)人工接種鑒定。本研究在水稻苗期進(jìn)行噴霧法與針刺法接種，得到的結(jié)果基本一致。菌株P(guān)R701是致病力較穩(wěn)定的菌株，利用PR701菌種鑒定出的抗性品種可為田間生產(chǎn)提供一定的參考。通過(guò)對(duì)不同水稻品種的抗性鑒定，我們得到對(duì)PR701菌株表現(xiàn)中抗水平以上的品種14個(gè)，如‘牡丹江29‘龍澤16號(hào)‘豐育2號(hào)‘墾稻17等，這些品種既可作為抗病品種在田間種植，又可以作為抗水稻細(xì)菌性褐斑病品種選育的良好抗源。從這些水稻品種中可發(fā)現(xiàn)，龍粳、龍稻、松粳系列品種大多數(shù)表現(xiàn)中感以上水平;而牡丹江、龍澤系列、部分墾稻系列品種對(duì)水稻細(xì)菌性褐斑病抗性較好，揭示父母親本的抗病性與品種的抗病性密切相關(guān)，這些抗性較好的親本材料也可以作為抗細(xì)菌性褐斑病的優(yōu)質(zhì)抗源材料。

本研究選用了針刺法與噴霧法接種對(duì)黑龍江省主栽水稻品種進(jìn)行抗性鑒定，這兩種接種方法都更接近田間水稻植株自然發(fā)病的狀況。水稻細(xì)菌性褐斑病病原菌主要從氣孔和傷口侵入[2]，水稻葉片的氣孔結(jié)構(gòu)和數(shù)量影響著植株的抗病性，低溫潮濕等環(huán)境因素更容易導(dǎo)致其發(fā)病，因此對(duì)不同品種抗性鑒定結(jié)果受到多種因素的影響[10，16]。

雖然水稻細(xì)菌性褐斑病發(fā)現(xiàn)至今已有幾十年歷史，但不同水稻品種對(duì)水稻細(xì)菌性褐斑病菌的抗性鑒定未見(jiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)外對(duì)于細(xì)菌性褐斑病病級(jí)的劃分及抗感水平分級(jí)也未有明確標(biāo)準(zhǔn)。本研究參照國(guó)際水稻所對(duì)水稻白葉枯病病級(jí)的劃分標(biāo)準(zhǔn)以及其他水稻細(xì)菌性病害的病級(jí)劃分，抗感分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[17-18]，將針刺接種法與噴霧接種法鑒定結(jié)果相結(jié)合，制定了一套對(duì)褐斑病菌的抗性鑒別標(biāo)準(zhǔn)，從中選出抗水稻細(xì)菌性褐斑病的品種。噴霧接種一般以病斑占葉面積比例作為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，針刺接種一般以病斑長(zhǎng)度分級(jí)[19]，但不同的水稻細(xì)菌性病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)存在差異，這也給品種對(duì)細(xì)菌性褐斑病的抗性鑒定帶來(lái)難度。在試驗(yàn)過(guò)程中，盡管我們保證了所有水稻品種的接種時(shí)間、接種方法、環(huán)境因素相同，但由于品種不同、溫室盆栽環(huán)境與田間自然環(huán)境存在差異，對(duì)結(jié)果可能略有影響。因此，加大對(duì)水稻品種資源的深入研究對(duì)實(shí)現(xiàn)水稻細(xì)菌性褐斑病的可持續(xù)控制有著重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 方中達(dá)， 任欣正. 我國(guó)水稻上的一種新的細(xì)菌性病害[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 1960， 6（1）： 90-92.

[2] 胡吉成， 白金鎧. 水稻新病害——細(xì)菌性褐斑病的研究 第一報(bào)， 發(fā)生為害、病癥及病原鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 1960， 6（1）： 93-105.

[3] ZHAO Bingyu， LIN Xinghua， POLAND J， et al. A maize resistance gene functions against bacterial streak disease in rice [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA， 2005， 102（43）：15383-15388.

[4] WONNI I， DJEDATIN G， OUDRAOGO L， et al. Evaluation of rice germplasm against bacterial leaf streak disease reveals sources of resistance in African varieties [J/OL]. Journal of Plant Pathology Microbiology， 2015， 6（10）： 1000312.DOI：10.4172/2157-7471.1000312.

[5] 方中達(dá)， 任欣正， 等. 水稻白葉枯病及條斑病和李氏禾條斑病病原細(xì)菌的比較研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 1957， 3（2）： 99-124.

[6] 周明華， 杜國(guó)興， 陳正橋， 等. 水稻品種對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病抗性研究進(jìn)展[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2003， 30（3）： 325-330.

[7] 郭亞輝. 水稻品種（系）對(duì)細(xì)菌性條斑病的抗性及條斑病菌的致病力分化[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2000.

[8] 馮愛(ài)卿， 陳深， 楊健源， 等. 水稻品種資源對(duì)細(xì)菌性條斑病菌的抗性評(píng)價(jià)[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2018， 19（6）： 1045-1054.

[9] 肖友倫， 肖放華， 劉勇， 等. 湖南水稻主栽品種對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病的抗性鑒定[J]. 植物保護(hù)， 2011， 37（1）： 45-49.

[10]夏怡厚， 林維英. 水稻品種（系）對(duì)稻細(xì)菌性條斑病的抗性鑒定和抗原篩選[J]. 福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)， 1992， 21（1）： 32-36.

[11]李信申， 鄒麗芳， 蔡耀輝， 等. 江西省細(xì)菌性條斑病菌的致病型劃分和水稻抗性資源的鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2017， 47（6）： 808-815.

[12]IRRI. Standard evaluation system for rice [M]. Los Banos， the Philippines： International Rice Research Institute， 1996： 20-21.

[13]周明華， 許志剛， 沈秀萍. 水稻品種對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病的抗性鑒定[J]. 植物檢疫， 2001， 15（2）： 65-67.

[14]楊俊， 艾瑛， 王星， 等. 云南30個(gè)水稻品種對(duì)水稻白葉枯病的抗性評(píng)價(jià)[J]. 生物安全學(xué)報(bào)， 2018， 27（2）： 150-154.

[15]史波. 79個(gè)水稻品種對(duì)白葉枯病菌的抗性鑒定及抗病基因xa-5的檢測(cè)[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.

[16]殷濤. 安徽省中秈稻品種抗病性評(píng)價(jià)及篩選[D]. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2017.

[17]FRED A K， KISWARA G， YI G， et al. Screening rice cultivars for resistance to bacterial leaf blight [J]. Journal of Microbiology Biotechnology， 2016， 26（5）： 938-945.

[18]張榮勝， 戴秀華， 王曉宇， 等. 江蘇省水稻品種對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病抗性鑒定及評(píng)價(jià)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2014， 41（4）： 385-389.

[19]方中達(dá)， 過(guò)崇險(xiǎn). 中國(guó)水稻白葉枯病菌致病型的研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 1990， 20（2）： 81-88.

（責(zé)任編輯：楊明麗）