李北 李永恒 羅虎

摘 ? ? ?要： 濃醪發(fā)酵技術(shù)具有可以提高發(fā)酵強(qiáng)度、縮短發(fā)酵時(shí)間、節(jié)約一次水的用量、提高設(shè)備利用率等諸多優(yōu)勢(shì)。高性能液化酶、糖化酶和高效優(yōu)良酵母技術(shù)的開發(fā)，為解決濃醪發(fā)酵過(guò)程中黏度高帶來(lái)的物料輸送困難、傳質(zhì)傳熱效率低下和高滲透壓影響酵母生長(zhǎng)繁殖問(wèn)題提供了可能，提高了木薯濃醪發(fā)酵酒精技術(shù)的可行性。本文對(duì)高性能釀酒酵母進(jìn)行木薯濃醪同步糖化發(fā)酵研究，確定了最佳發(fā)酵條件為：接種量30%、氮源添加量為2.45 kg/t木薯。同時(shí)，篩選出NWTU1糖化酶和抑菌效果好的抑菌劑A，解決了濃醪同步糖化定量供糖的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了濃醪發(fā)酵酒分達(dá)到15%以上，殘?zhí)呛恳策_(dá)到發(fā)酵結(jié)束指標(biāo)。通過(guò)酒母培養(yǎng)工藝的研究，確定酒母培養(yǎng)的外觀糖為11～13oBx，解決了濃醪發(fā)酵過(guò)程滲透壓高不利于酵母生長(zhǎng)、酒母質(zhì)量差的問(wèn)題。

關(guān) ?鍵 ?詞：木薯;糖化酶;濃醪發(fā)酵

中圖分類號(hào)：TQ 920.6 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）05-0969-04

Abstract： High gravity fermentation technology can improve the fermentation intensity， shorten the fermentation time， save the amount of primary water， improve the utilization of equipment. With the development of high-performance liquefying enzyme， saccharifying enzyme and high-efficiency yeast technology， it is possible to solve the problems of difficult material transportation， low efficiency of mass transfer and heat transfer and high osmotic pressure affecting yeast growth and reproduction caused by high viscosity in the process of high-density mash fermentation， as well as increase the feasibility of cassava thick mash fermentation alcohol technology. In this paper， the simultaneous saccharification of cassava and high-performance Saccharomyces cerevisiae was studied. The optimal fermentation conditions were determined as follows： 30% inoculum amount， nitrogen source 2.45 kg/t（cassava powder）. NWTU1 saccharifying enzyme and bacteriostatic agent A with good bacteriostatic effect were screened out. The problem of simultaneous saccharification and quantitative sugar supply of high-performance Saccharomyces cerevisiae was solved. The liquor content of high-performance fermentation was over 15%， and the content of residual sugar reached the fermentation end index. Through the study of the culture technology of the mother of wine， the appearance sugar of the mother of wine culture was determined to be 11～13obx， which solved the problem that high osmotic pressure was not conducive to the growth of yeast and the quality of the mother of wine was poor.

Key words： cassava; Saccharifying enzyme; high gravity fermentation

酒精是國(guó)民經(jīng)濟(jì)中的重要物質(zhì)，應(yīng)用于生物能源、化工生產(chǎn)、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域[1]。生物能源燃料乙醇可以替代成品油[2-4]，利用非糧木薯生產(chǎn)燃料乙醇[5-6]符合國(guó)家能源產(chǎn)業(yè)政策要求。

濃醪發(fā)酵就是發(fā)酵過(guò)程中的高濃度醪液發(fā)酵，其濃醪發(fā)酵的特點(diǎn)具體表現(xiàn)為高滲透壓、高酵母數(shù)、高產(chǎn)酒率等。濃醪發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用可使企業(yè)在獲得最大產(chǎn)率的同時(shí)，提高企業(yè)生產(chǎn)能力，降低生產(chǎn)成本。酒精濃醪發(fā)酵意義在于[7-10，16，17]：

一是在有限空間增加發(fā)酵濃度，達(dá)到增加發(fā)酵強(qiáng)度和提高產(chǎn)能的目的。

二是降低能耗，提高成熟醪酒分，生產(chǎn)系統(tǒng)中單位產(chǎn)品所消耗水電汽隨之降低，達(dá)到降低生產(chǎn)成本的目的。

三是酒精精餾提純過(guò)程中，醪液酒分越高，精餾單位產(chǎn)品廢醪液殘留的酒分損失總量就越少，提高產(chǎn)品收率。

四是醪液酒分提高，單位產(chǎn)品所產(chǎn)生的廢醪減少，提高了飼料回收率，降低污水處理量，實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)，達(dá)到可持續(xù)發(fā)展的目的。

本文主要研究了木薯濃醪發(fā)酵技術(shù)，開發(fā)了木薯高酒分生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)工藝包。

在進(jìn)行濃醪發(fā)酵[9-14]時(shí)，醪液高滲透壓和高酒精濃度會(huì)限制酵母菌的生長(zhǎng)繁殖[15-19]，從而對(duì)酒精發(fā)酵產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。因此，酵母的選擇和發(fā)酵工藝的改進(jìn)是進(jìn)行濃醪同步糖化發(fā)酵[13-15]的關(guān)鍵，而以木薯為底物的濃醪發(fā)酵工藝并不多見(jiàn)。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?材料與試劑

木薯，廣西地區(qū)種植加工的干片;a-淀粉酶（10萬(wàn)U/g），諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司;葡萄糖水解酶（10 萬(wàn)U/g），諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司;尿素，安徽金禾化工有限公司;酸性蛋白酶（10 萬(wàn)U/g），山東萍聚生物科技有限公司;安菌泰，柳州龍?zhí)┛萍加邢薰?酵母，廣西科學(xué)院選育的一種高性能釀酒酵母;葡萄糖，廣西柳州億炫化工有限公司;鹽酸，濟(jì)南坤豐化工有限公司;硫酸，廣西銀泉化工有限責(zé)任公司;氫氧化鈉、次甲基藍(lán)指示劑、斐林試劑、酚酞指示劑，廣西天地?fù)P生物科技有限公司。

1.2 ?儀器與設(shè)備

數(shù)碼生物顯微鏡，南寧啟博儀器設(shè)備有限公司;50 L三聯(lián)發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司;AL204分析天平，南寧啟博儀器設(shè)備有限公司;DL-1萬(wàn)用電爐，上海喬躍電子科技有限公司;S40pH計(jì)，上海增駿實(shí)業(yè)有限公司;HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股分有限公司。

1.3 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ?高性能釀酒菌株發(fā)酵效果試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)不同比例混配酵母發(fā)酵效果或單一品種酵母發(fā)酵效果進(jìn)行研究，對(duì)比其酒母罐的酸度、酵母數(shù)、死亡率以及雜菌數(shù)和發(fā)酵成熟醪中酸度、殘總糖等指標(biāo)，最終篩選出適用于木薯粉濃醪發(fā)酵酒精的優(yōu)良酵母菌種。試驗(yàn)條件為：液化醪固形物含量≥30%（wt）， pH=4.40～4.60， 接種量25%～30%，尿素添加量1.30 kg/t原料，糖化酶添加量1.0 kg/t原料，安菌泰添加量5 μg/g，發(fā)酵溫度32～33 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h。

1.3.2 ?酒母梯度濃度培養(yǎng)工藝的研究

通過(guò)優(yōu)選適合于木薯粉濃醪發(fā)酵的耐高酒分、耐高滲透壓、副產(chǎn)物低的酵母菌株或酵母組合菌株，并優(yōu)化酒母培養(yǎng)工藝，解決濃醪發(fā)酵酒母質(zhì)量差問(wèn)題。

1.3.3 ?不同糖化酶對(duì)發(fā)酵效果的影響

通過(guò)研究糖化酶對(duì)濃醪發(fā)酵的影響，探討通過(guò)工藝控制來(lái)定量供糖，使發(fā)酵醪中的單糖濃度維持在較低的水平，以降低滲透壓高對(duì)發(fā)酵造成的負(fù)面影響。確定濃醪同步糖化發(fā)酵的最佳工藝，解決糖化率不穩(wěn)定、雜菌污染嚴(yán)重、發(fā)酵成熟醪酒分不穩(wěn)定等問(wèn)題。

1.3.4 ?酒母接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

研究了酒母接種量在20%～50%范圍內(nèi)時(shí)，不同接種量對(duì)耗糖速度、酵母生長(zhǎng)情況以及產(chǎn)酒率的影響。

1.3.5 ?尿素添加量對(duì)發(fā)酵效果的影響

取一定量的液化醪，添加糖化酶（1.20 kg/t木薯）、抑菌劑（5 μg/g）、酒母（30%）以及不同量的尿素，然后在30～33 ℃條件下發(fā)酵。通過(guò)對(duì)成熟醪產(chǎn)酒率、酵母生長(zhǎng)情況以及尿素添加成本進(jìn)行分析，來(lái)確定尿素最佳添加量。

1.3.6 ?抑菌劑的篩選

取車間一定量的液化醪，依次添加尿素（2.45 kg/t木薯）、抑菌劑、糖化酶（1.2 kg/t木薯）、酒母（30%），然后在32～33 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵。最終通過(guò)實(shí)驗(yàn)，對(duì)比分析發(fā)酵醪中的揮發(fā)酸、酸度、升酸差、酵母情況、酒分等指標(biāo)，評(píng)價(jià)不同類型抑菌劑的抑菌效果。

1.3.7 ?分析檢測(cè)

采用酶解法測(cè)定淀粉含量;采用斐林試劑熱滴定定糖法測(cè)定還原糖、總糖的含量;采用血球計(jì)數(shù)板法檢測(cè)酵母質(zhì)量;采用酒精廠常用方法測(cè)定外觀糖度、酒精度、揮發(fā)酸、酸度等。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 ?高效酵母的篩選和適宜的混合比例的確定

在濃醪發(fā)酵過(guò)程中，選育耐高酒分、耐高滲透壓、低副產(chǎn)物的優(yōu)良酵母菌株可以大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)酒能力。

單一酵母與復(fù)配酵母發(fā)酵成熟醪比較結(jié)果見(jiàn)圖1。不同比例的酵母B與酵母A混合，酵母B的添加量越大，在同樣發(fā)酵條件下，成熟醪還原糖降低，酵母后發(fā)酵力強(qiáng)，酒分越高，酸度越低，發(fā)酵效率越高。但是B酵母添加比例超過(guò)30%時(shí)，則會(huì)降低前期發(fā)酵速度。因此，B酵母與A酵母菌株最佳比例為30%B+70%A。

傳統(tǒng)酒精發(fā)酵時(shí)間一般要60 ～70 h [6]，而從圖1可看出，酵母在發(fā)酵48 h后酒分就超過(guò)了15.0 %，殘?zhí)呛恳策_(dá)到發(fā)酵結(jié)束指標(biāo)，說(shuō)明使用該酵母可縮短發(fā)酵時(shí)間12～22 h，從而大量減少發(fā)酵能耗，提升設(shè)備利用率，增加酒精收率。

2.2 ?酒母培養(yǎng)濃度優(yōu)化和最佳工藝的確定

為了減少濃醪發(fā)酵過(guò)程中高滲透壓對(duì)酒母擴(kuò)培造成的影響，改善酒母形態(tài)，提高酒母質(zhì)量，必須根據(jù)酵母生長(zhǎng)的不同時(shí)期對(duì)糖耐量的不同特點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)，以確定最佳的擴(kuò)培工藝。試驗(yàn)條件：將液化醪分別按照外觀糖16～18oBx和11～13oBx兩個(gè)范圍進(jìn)行稀釋，然后接種干酵母，在28～30 ℃條件下培養(yǎng)8～12 h，通過(guò)對(duì)比不同液化醪濃度擴(kuò)培條件下酵母生長(zhǎng)形態(tài)、酵母出芽率、死亡率、產(chǎn)酒率等指標(biāo)，最終確定酒母培養(yǎng)最佳工藝條件。酒母培養(yǎng)濃度優(yōu)化和最佳工藝研究結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，在較低外觀糖條件下，酵母形狀從橢圓形轉(zhuǎn)向圓形，形態(tài)較原來(lái)稍小，酵母健壯。而在高糖濃度下酵母形狀出現(xiàn)拉長(zhǎng)，數(shù)量相對(duì)較少，酵母生長(zhǎng)明顯受抑制。