蔣 敏， 李 恒， 李 會(huì)， 史勁松

（江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫214000）

0 引 言

微生物實(shí)驗(yàn)是我院制藥工程專(zhuān)業(yè)本科教學(xué)的核心基礎(chǔ)課程之一，在本專(zhuān)業(yè)技能培養(yǎng)中具有極其重要的意義［1］。目前，開(kāi)設(shè)的常規(guī)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)可以有效地保證學(xué)生掌握微生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技能，但要培養(yǎng)出雙“一流”高校人才，還需注重培養(yǎng)學(xué)習(xí)興趣和創(chuàng)新思維，重點(diǎn)提升分析解決問(wèn)題的綜合能力，因此有必要緊密結(jié)合前沿性科研成果，圍繞微生物基本實(shí)驗(yàn)核心點(diǎn)，輻射發(fā)散至藥理學(xué)、藥物分析等多個(gè)實(shí)驗(yàn)方向，對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行擴(kuò)充，形成輻射狀的綜合性教學(xué)模式，提升本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)的縱橫向飽滿度。

隨著分子生物學(xué)、腸道微生學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，腸道微生態(tài)與機(jī)體健康的研究也已經(jīng)普及到食品［2］、化工［3］、醫(yī)藥［4］等多個(gè)領(lǐng)域，其作用也日益受到人們的關(guān)注與重視［5］，可以認(rèn)為研究微生物／微生物群與其宿主的關(guān)系已成為現(xiàn)代應(yīng)用微生物學(xué)的重要發(fā)展方向之一。因此開(kāi)設(shè)圍繞“健康”為主旨的微生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)在制藥工程專(zhuān)業(yè)教學(xué)工作中具有一定的意義。

本綜合性實(shí)驗(yàn)依托于學(xué)院腸道微生態(tài)的研究成果［6-12］，以一株前期分離得到的安全有效的益生菌［13-14］—羅伊氏乳桿菌為研究對(duì)象，由學(xué)生進(jìn)行菌株觀察與鑒定，應(yīng)用腸道厭氧發(fā)酵模擬器-氣相色譜對(duì)該菌株腸道“益生”作用進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，在小鼠腸道菌群失調(diào)模型上進(jìn)行宏觀考察。通過(guò)開(kāi)設(shè)此綜合性實(shí)驗(yàn)，不僅可以促進(jìn)學(xué)生鞏固經(jīng)典微生物基本操作，掌握分子生物學(xué)、藥物分析、藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)技能，還可提高學(xué)生創(chuàng)新思維和科研熱情。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.25 g（MnSO4·H2O 0.19 g），MgSO4·7H2O 0.58 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：KMOS 8.0、胰蛋白胨3.0、蛋白胨3.0、酵母提取物4.5、膽鹽3 號(hào)0.4、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.8、氯化鐵血紅素0.05、NaCl 4.5、KCl 2.5、MgCl2·6H2O 0.45、CaCl2·6H2O 0.2、KH2PO40.4、Tween80 1.0、微量元素（MgSO4·7H2O 3.0、MnCl2·4H2O 0.32、FeSO4·7H2O 0.1、CoSO4·7H2O 0.18、CaCl2·2H2O 0.1、ZnSO4·7H2O 0.18、CuSO4·5H2O 0.01、NiCl2·6H2O 0.092）2.0，pH 6.5，121 ℃濕熱滅菌20 min。

10名健康志愿者糞便；羅伊氏乳桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株；本實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等均購(gòu)上海生工；PCR過(guò)程中所用引物購(gòu)于上海生工，PCR過(guò)程中所用酶及試劑均購(gòu)自索萊寶生物；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸（GC，純度≥99.5%）購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；其他試劑：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

顯微鏡；酶標(biāo)儀；PCR擴(kuò)增儀；低速離心機(jī)；厭氧工作站（37℃，80% 二氧化碳，10% 氫氣，10% 氮?dú)猓?；酸度?jì)；渦旋儀；高壓蒸汽滅菌鍋；金屬??；氣相色譜儀；切片機(jī)；pH自動(dòng)控制加液機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB／c小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供，飼養(yǎng)溫度（23±2）℃，相對(duì)濕度（50±5）%，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株的生理生化鑒定

菌株活化后接入MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h，取少量菌液并適當(dāng)稀釋?zhuān)坎糓RS平板，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、生理生化鑒定。

2.2 16 S rDNA序列分析

用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16 S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ExTaq 酶0.25 μL，ddH2O 18.25 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性，2 min；循環(huán)過(guò)程為95℃變45 s，退火溫度56℃，45 s，72℃延伸90 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃保持，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收純化，送上海生工有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定種屬類(lèi)別。

2.3 體外評(píng)價(jià)

2.3.1 腸道發(fā)酵器的搭建與穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

文獻(xiàn)［15］方法：結(jié)合實(shí)際研究搭建模擬腸道發(fā)酵器（見(jiàn)圖1），按照配方配置發(fā)酵培養(yǎng)基，高溫滅菌后向系統(tǒng)中通入高純氮?dú)?，控制系統(tǒng)的溫度、攪拌速度、pH等，使其保持穩(wěn)定。取新鮮的健康捐獻(xiàn)者的糞便樣品5 g，滅菌PBS制成20%（w／v）菌懸液，震蕩混勻，離心（8 000 r／min，1 min）取上清，將上清液通過(guò)補(bǔ)料口接種到已經(jīng)預(yù)運(yùn)行48 h的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵以輸送新鮮培養(yǎng)基和廢液，使發(fā)酵罐的液位恒定。PCRDGGE檢測(cè)證明連續(xù)發(fā)酵的前期（0～8 d），系統(tǒng)中菌群波動(dòng)較大，處于不穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入第9、10 d后，DGGE圖譜上條帶相似度高，種類(lèi)及豐富度基本沒(méi)有變化，說(shuō)明此時(shí)發(fā)酵器內(nèi)的菌群處于穩(wěn)定狀態(tài)，UPGMA相似性聚類(lèi)分析結(jié)果基本與DGGE結(jié)果一致。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇經(jīng)發(fā)酵器連續(xù)厭氧發(fā)酵10 d后的穩(wěn)定的腸道微生物群落為研究對(duì)象，研究羅伊氏乳桿菌的腸道調(diào)節(jié)作用。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)

以穩(wěn)定恒化器中的腸道微生物菌群作為發(fā)酵系統(tǒng)，設(shè)置兩組實(shí)驗(yàn)：對(duì)照組與羅伊氏乳桿菌組（接種量為1%），厭氧條件下連續(xù)培養(yǎng)36 h，取樣檢測(cè)。

2.3.3 SCFA 檢測(cè)

圖1 模擬腸道發(fā)酵器

文獻(xiàn)［16-17］方法：取1 mL培養(yǎng)液，4℃，12 000 r／min下離心10 min除菌體。取500 μL上清，離心去除沉淀，加入1 mL乙醚萃取15 min，低溫離心分離，取上清進(jìn)樣。精密稱(chēng)取乙酸、丙酸、丁酸、戊酸適量，加乙醚制成儲(chǔ)備液，加入內(nèi)標(biāo)物（50 μg／mL），待進(jìn)樣。以標(biāo)準(zhǔn)物和內(nèi)標(biāo)物濃度比為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算待測(cè)物濃度。采用氣相色譜法檢測(cè)短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acid，SCFA）含量，色譜柱：DB-WAX 30M（I.D.0.32 mm，5 μm）；升溫程序：50℃保持3 min，以6℃／min升至120℃，保持0.5 min，以6℃／min升至220℃，保持5 min；載氣（N2）流速3 mL／min，載氣（H2）流速47 mL／min；空氣流量400 mL／min；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比1∶3。數(shù)據(jù)采用Origin 8軟件作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。

2.4 樣品處理

2.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

1周的適應(yīng)期后，小鼠隨機(jī)分成3組，每組8只，取兩組小鼠，連續(xù)7 d灌胃頭孢曲松鈉生理鹽水溶液（1.25 mg／g bw）造模。將模型小鼠平均分為模型組和羅伊氏乳桿菌組兩組，其中羅伊氏乳桿菌組連續(xù)15 d灌胃羅伊氏乳桿菌菌液（濃度為0.5×1010CFU／g bw）。模型組和對(duì)照組連續(xù)15 d灌胃等體積生理鹽水。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品處理方法

實(shí)驗(yàn)定期進(jìn)行稱(chēng)重并監(jiān)測(cè)小鼠的攝食量，飲水量，記錄數(shù)據(jù)，灌胃結(jié)束后將小鼠頸椎脫位處死，腹部75%乙醇消毒，解剖，取盲腸內(nèi)容物測(cè)定SCFA，盲腸內(nèi)容物取出后，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，75%乙醇脫水、石蠟包埋、切片、染色，顯微鏡下觀察。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 菌株鑒定結(jié)果

顯微鏡下菌落為乳白色，不透明，濕潤(rùn)，中心不凸起，屬于細(xì)菌。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株分別進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果如表1所示。進(jìn)一步分析生理生化鑒定結(jié)果可知，該菌株均能利用糖類(lèi)物質(zhì)生長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)酸，且大部分菌株對(duì)膽鹽的耐受能力較強(qiáng)。以菌株的基因組為模板，PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為1.5 kb，該片段提交至GenBank中，與已報(bào)道的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，比對(duì)結(jié)果最終確定本實(shí)驗(yàn)的試驗(yàn)菌為羅伊氏乳桿菌。

表1 菌株生理生化特征

3.2 體外腸道發(fā)酵器評(píng)價(jià)

SCFA是含1～6個(gè)碳原子的有機(jī)羧酸，是目前最常用的腸道微生態(tài)研究指標(biāo)之一，其主要包含乙酸、丙酸、丁酸和戊酸［18］?，F(xiàn)代藥理學(xué)與臨床研究表明，SCFA參與腸上皮細(xì)胞的能量供應(yīng)，不僅可影響腸腔pH和電解質(zhì)平衡、腸黏膜屏障的通透性、腸道高敏感和腸動(dòng)力的調(diào)節(jié)，還與抗炎、抗腫瘤等密切相關(guān)。已有研究表明，不同種類(lèi)SCFA的生理功能各有特點(diǎn)，如丁酸為腸道上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源，可通過(guò)激活氯離子／丁酸通道、促進(jìn)鈉離子／氫離子交換等途徑促進(jìn)腸道水與離子的吸收，改善腹瀉情況［19-20］，此外，丁酸還可通過(guò)抑制組蛋白去乙酰化酶，抑制端粒酶活動(dòng)，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［21］；丙酸有助于保護(hù)腸黏膜屏障，通過(guò)STAT3信號(hào)通路減少炎癥與氧化損傷［22］等。

不同組SCFA檢測(cè)結(jié)果如表2所示。數(shù)據(jù)可見(jiàn)，外源添加羅伊氏乳桿菌對(duì)腸道SCFA產(chǎn)生的種類(lèi)沒(méi)有影響，但對(duì)含量有顯著影響。相較于對(duì)照組，添加了羅伊氏乳桿菌后，丙酸、丁酸、戊酸含量分別顯著增加了25.9、3及9倍，而乙酸未發(fā)生顯著變化。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羅伊氏乳桿菌可影響腸道SCFA結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮益生作用。

3.3 菌群失調(diào)模型建立及評(píng)價(jià)

3.3.1 體重檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間無(wú)小鼠死亡，各組小鼠飲水量與采食量無(wú)顯著差異。對(duì)照組小鼠體重在實(shí)驗(yàn)期間無(wú)顯著變化，而模型組和羅伊氏乳桿菌組小鼠在造模后體重均有所下降，經(jīng)過(guò)15 d灌胃處理后兩組體重均有所回升，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異。

表2 不同組SCFA的產(chǎn)生量

3.3.2 SCFA 檢測(cè)結(jié)果

不同組小鼠腸道內(nèi)SCFA含量檢測(cè)結(jié)果如表3所示。數(shù)據(jù)可見(jiàn)，模型組小鼠腸道內(nèi)SCFA含量顯著降低，其中總酸含量從（68.15 ± 6.5）mmol／L 下降至（16.27 ±0.79）mmol／L，其中乙酸含量從（32.56 ±2.32）mmol／L 顯著下降至（12.02 ±0.42）mmol／L，丁酸含量從（27.15 ±4.98）mmol／L 顯著下降至（4.25 ±1.22）mmol／L，而丙酸與戊酸幾乎檢測(cè)不出。而與模型組相比，羅伊氏乳桿菌組小鼠腸道內(nèi)總酸含量［（98.55 ±3.23）mmol／L］顯著高于模型組［（16.27 ±0.79）mmol／L］，其中乙酸、丁酸、戊酸分別為（35.93±0.99），（26.07 ±4.08），（0.49 ± 0.10）mmol／L，與對(duì)照組無(wú)顯著差異；與體外結(jié)果相一致的是丙酸含量增加最明顯，為（36.05 ±4.41）mmol／L，顯著高于對(duì)照組。分析可見(jiàn)，抗生素干擾小鼠腸道菌群平衡，造成了SCFA顯著下降，而羅伊氏乳桿菌能夠顯著改善腸道環(huán)境，提高SCA的產(chǎn)量，但體內(nèi)與體外的SCFA趨勢(shì)結(jié)果不完全一致，這可能是由于體外只能實(shí)現(xiàn)小部分腸道微生物的培養(yǎng)，導(dǎo)致了體內(nèi)外微生物菌群的差異。

表3 盲腸內(nèi)容物SCFA含量 mmol／L

3.3.3 腸道組織形態(tài)觀察

圖2所示為隨機(jī)抽取的盲腸組織切片光鏡圖，由圖可見(jiàn)，對(duì)照組小鼠腸道上皮細(xì)胞完整，絨毛排列整齊，模型組腸上皮細(xì)胞破壞嚴(yán)重，腸絨毛缺損明顯，排列紊亂，而經(jīng)過(guò)羅伊氏乳桿菌干擾的小鼠腸上皮結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相近，腸絨毛排列整齊且致密。

圖2 小鼠盲腸縱切面200×

表4所示為各組腸絨毛高度，數(shù)據(jù)顯示模型組小鼠腸絨毛高度［（76.4 ±7.5）μm］相較于對(duì)照組［（149.7 ±4.5）μm］顯著降低（P ＜0.05），經(jīng)過(guò)羅伊氏乳桿菌干預(yù)的小鼠腸絨毛高度［（165.9±5.1）μm］較模型組甚至空白對(duì)照組都有顯著增長(zhǎng)（P＜0.05）。結(jié)果表明，羅伊氏乳桿菌能夠在抗生素失調(diào)模型小鼠中發(fā)揮腸道保護(hù)作用。這可能是由于羅伊氏乳桿菌能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腸道SCFA的數(shù)量與結(jié)構(gòu)，改善抗生素引起的腸黏膜損傷，促進(jìn)腸絨毛的增長(zhǎng)等［23］。

表4 各組小鼠盲腸絨毛高度

4 結(jié) 語(yǔ)

（1）菌株的培養(yǎng)鑒定實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步鞏固學(xué)生微生物的基本操作技能，在此基礎(chǔ)上增加了常規(guī)的分子操作，拓寬了傳統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)課的視野，為學(xué)生進(jìn)一步從事相關(guān)科研工作奠定了基礎(chǔ)。

（2）以SCFA為定量指標(biāo)，搭建了體外腸道模擬發(fā)酵器，提高微生物實(shí)驗(yàn)課堂的趣味性，該實(shí)驗(yàn)單元著重培養(yǎng)了學(xué)生對(duì)氣相色譜、PCR等科研型儀器的操作能力。

（3）藥理學(xué)技術(shù)等已在多學(xué)科領(lǐng)域得到全面普及，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單元要求學(xué)生熟練掌握解剖、取樣等技能以獲取樣本，進(jìn)行關(guān)鍵性指標(biāo)檢測(cè)及常規(guī)病理切片，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)技能和提高科研素養(yǎng)具有重要的意義。

（4）通過(guò)本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)施，有助于學(xué)生掌握精準(zhǔn)化腸道微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與研究的一般方法與科研思路，為未來(lái)從事藥學(xué)、食品、微生物學(xué)等領(lǐng)域相關(guān)工作奠定基礎(chǔ)。