桂 莎，劉 芳，張立丹，樊小林?

復(fù)合菌劑防控香蕉枯萎病的效果及其微生物學(xué)機(jī)制*

桂 莎，劉 芳，張立丹，樊小林?

（廣東高校環(huán)境友好型肥料工程技術(shù)研究中心，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，廣州 510642）

由病原菌尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型（f. sp.（Foc））侵染引起的香蕉枯萎病對(duì)全世界香蕉產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了毀滅性的影響，且目前尚無(wú)廣泛采用的防治方法。研究復(fù)合生防真菌制劑對(duì)香蕉枯萎病的防治效果，以期為大田香蕉枯萎病的防治提供依據(jù)。設(shè)置3組不同的菌劑處理，分別為對(duì)照組CK、復(fù)合菌劑NFP、復(fù)合菌劑NFPT，通過(guò)兩季的盆栽試驗(yàn)，研究復(fù)合菌劑對(duì)香蕉枯萎病的防治效果及其對(duì)土壤微生物多樣性的影響；利用 Illumina Miseq 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因和真菌ITS區(qū)域進(jìn)行測(cè)序分析，采用實(shí)時(shí)熒光qPCR定量分析各處理病原菌的數(shù)量。結(jié)果表明：（1）復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）對(duì)香蕉枯萎病有較好的防治效果，其防效分別為43%和48%。（2）施用復(fù)合菌劑增加了細(xì)菌和真菌群落豐富度和多樣性?；贐ray-curtis距離矩陣的主坐標(biāo)分析（PCoA）結(jié)果表明NFP和NFPT改變了細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)。NFP和NFPT處理增加了潛在有益微生物中與香蕉枯萎病病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)的大理石雕菌屬、類(lèi)諾卡氏菌屬、野野村式菌屬、、屬和屬的相對(duì)豐度，顯著減少了病原菌尖孢鐮刀菌的數(shù)量，重塑了土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能，增強(qiáng)其抗病性。

復(fù)合真菌制劑；香蕉枯萎?。籌llumina Miseq 高通量測(cè)序；土壤微生物多樣性

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型f. sp.（Foc）侵染引起的一種土傳病害，給世界香蕉產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。目前防治香蕉枯萎病的常用措施主要有土壤熏蒸[3]、輪作[4]和培育新品種[5]等。然而土壤熏蒸會(huì)破壞土壤環(huán)境，與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的理念相悖[6]；病原菌產(chǎn)生的厚垣孢子在無(wú)宿主的情況下可長(zhǎng)期存活于土壤中[2]，因此，土壤一旦被Foc侵染，在長(zhǎng)達(dá)30年的時(shí)間易感病香蕉品種均難以成功種植[4]；抗病新品種的培育周期長(zhǎng)，且品質(zhì)難以保證[7]。因此，香蕉枯萎病的防治亟需新方法。

生物防治作為一種有前途且環(huán)境友好的病害防治方式，正受到廣泛的關(guān)注，為香蕉枯萎病的防治提供了一種新的、有潛力的方式[8]。在眾多的生防微生物中，生防真菌相比于生防細(xì)菌而言有更大的潛力在土壤中生長(zhǎng)和繁殖[9]，因此，真菌更多地用于防治某些作物因尖孢鐮刀菌引起的病害[9]，目前已有許多生防真菌用于枯萎病的防治[10-12]。盡管許多不同的生防真菌對(duì)枯萎病的防治表現(xiàn)出了一定的防效，但是由于在生物防治過(guò)程中，生物和非生物因素相互作用的復(fù)雜性，對(duì)枯萎病防治的實(shí)際效果不盡相同[13]，為此可通過(guò)多種生防菌的結(jié)合應(yīng)用解決該問(wèn)題。多種拮抗菌結(jié)合施用較一種拮抗菌單獨(dú)施用有更好的防病效果[14]，大量研究[14-15]表明多種生防菌結(jié)合施用能有效地抑制枯萎病。本研究的前期工作證明香蕉施用多種生防真菌制成的復(fù)合菌劑，對(duì)香蕉枯萎病有明顯的防治效果。已有研究[16-17]報(bào)道了某些種類(lèi)的生防真菌防病機(jī)理是直接對(duì)抗和間接對(duì)抗，但是多種生防真菌配合的防病機(jī)理尚不明確。本文假設(shè)復(fù)合真菌制劑防治香蕉枯萎病的機(jī)理可能在于，香蕉定植前在香蕉根區(qū)接種復(fù)合真菌制劑改變了香蕉根區(qū)土壤微生物結(jié)構(gòu)，刺激了土著微生物中某些有益菌屬相對(duì)豐度的增加。為研究復(fù)合真菌制劑防控香蕉枯萎病的效果，本研究開(kāi)展了兩次盆栽試驗(yàn)，通過(guò)細(xì)菌16S rRNA基因和真菌ITS區(qū)域的高通量測(cè)序，系統(tǒng)研究了根區(qū)細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)復(fù)合真菌制劑的響應(yīng)，以期探討復(fù)合真菌制劑防治香蕉枯萎病的機(jī)理，為以復(fù)合真菌制劑防治大田香蕉枯萎病的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

盆栽試驗(yàn)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行。供試土壤為微堿性砂壤土，是灘涂填海造田的蕉園土壤，采自廣東省中山市翠亨島，土壤pH 7.41，有機(jī)質(zhì)含量19.78 g?kg–1，礦質(zhì)態(tài)氮11.12 mg?kg–1，有效磷8.53 mg?kg–1，速效鉀141.0 mg?kg–1。

供試香蕉為巴西蕉（Lour.）無(wú)病組培苗的假植苗。香蕉假植苗長(zhǎng)至14 cm、7片綠葉時(shí)，選取生長(zhǎng)健壯、一致的幼苗進(jìn)行試驗(yàn)。

復(fù)合真菌活菌制劑由西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院植物病理研究室提供，復(fù)合真菌制劑NFP由非致病性尖孢鐮刀菌（non-pathogenicsp.）和淡紫擬青霉菌（sp.）按1︰1比例復(fù)配而成，復(fù)合真菌制劑NFPT由非致病性尖孢鐮刀菌（non-pathogenicsp.）、淡紫擬青霉菌（sp.）和木霉菌（sp.）按9︰9︰4的比例復(fù)配而成。有效活菌數(shù)均大于5×108g–1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別于2017年9月27日至2018年1月29日和2018年5月10日至2018年8月1日開(kāi)展了兩次盆栽試驗(yàn)。兩次試驗(yàn)結(jié)果的規(guī)律一致，本文以第二次盆栽試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析和討論。兩次盆栽試驗(yàn)方案相同，分別設(shè)置CK（不接種生防菌劑）、復(fù)合菌劑NFP、復(fù)合菌劑NFPT 3個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)30個(gè)重復(fù)，單株為1個(gè)重復(fù)，每盆移栽一株香蕉，共90盆香蕉，隨機(jī)排列。所有處理的香蕉氮磷鉀用量相等，N︰P2O5︰K2O（質(zhì)量比）均為1︰0.25︰0.75。每個(gè)處理的施N量均為0.2 g?kg–1干土，在香蕉生長(zhǎng)過(guò)程將各處理的總養(yǎng)分均分為12份，分別溶于水后，每周澆灌施肥1次。每盆的含水量用稱(chēng)重法保持在田間持水量的70%。

1.3 試驗(yàn)方法

在香蕉苗假植期對(duì)其進(jìn)行復(fù)合菌劑接種，具體方法是將三葉期的香蕉苗從沙培苗床中拔出，洗掉根上附著的河沙，假植于7 cm×10 cm的黑色營(yíng)養(yǎng)杯中，定植介質(zhì)是無(wú)病椰糠+泥炭專(zhuān)用混合基質(zhì)，假植苗移栽時(shí)，將2 g復(fù)合菌劑NFP和NFPT分別施于定植穴，使菌劑與香蕉根直接接觸。假植期進(jìn)行正常水肥管理，待香蕉苗長(zhǎng)至7片葉時(shí)，選擇生長(zhǎng)一致的香蕉苗移栽于盆缽，開(kāi)始香蕉盆栽試驗(yàn)。盆栽期按照上述方法進(jìn)行水肥管理，參考大田管理措施進(jìn)行香蕉枯萎病外的其他病蟲(chóng)害防治。

香蕉尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型4號(hào)生理小種（Foc4）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室提供。將Foc4接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，在25 ℃下黑暗活化培養(yǎng)7 d，然后用直徑8 mm打孔器從菌落邊緣采取菌餅，接種于裝有500 mL液體PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中，在28 ℃、180 r?min–1搖床培養(yǎng)7 d。將得到的菌懸液用四層紗布過(guò)濾掉菌絲后，用無(wú)菌水稀釋至106CFU?mL–1備用。

供試土壤分兩層裝盆，先裝下層4 cm （約1.5 kg），頂層7 cm（約2.5 kg）先不裝土，移栽假植苗后再用土壤覆蓋香蕉苗及其基質(zhì)塊。移栽前將選好的七葉一心健壯、一致的香蕉苗脫掉營(yíng)養(yǎng)缽袋，移植于已裝下層土壤的盆缽正中，然后將預(yù)留的頂層土壤覆蓋于香蕉苗基質(zhì)塊周?chē)够|(zhì)塊上仍能覆蓋1 cm土壤。每盆移栽1株香蕉，澆水至田間持水量的70%進(jìn)行緩苗。移栽的香蕉正常生長(zhǎng)1個(gè)月后，采用傷根接種法接種病原菌。具體操作方法為用潔凈玻棒在香蕉假莖四周每個(gè)方位自上而下插入土壤中后拔出，分別在插入的四個(gè)方位中接種10 mL濃度為106CFU?mL–1的Foc4菌懸液，接種量為104CFU?g–1（干土）。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

接種病原菌后每隔 10 d 調(diào)查 1 次，連續(xù)調(diào)查 5 次并計(jì)算病情指數(shù)[19]。香蕉枯萎病病情分為6級(jí)[18]，0級(jí)：健株，無(wú)癥狀；1級(jí)：病株有20%以下的葉片顯病癥；2級(jí)：病株有20%～40%的葉片顯病癥；3級(jí)：病株有40%～80%的葉片顯病癥；4級(jí)：僅有頂部1～2片健康葉；5級(jí)：整株枯死。

防病效果/%=[(對(duì)照病情指數(shù)–處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)]×100

香蕉枯萎病發(fā)病初期，每處理隨機(jī)選取12盆香蕉，用土鉆取土，每盆取4鉆，每4盆的土壤混合均勻后得到1個(gè)混合樣，每處理3個(gè)混合土樣，即3個(gè)重復(fù)，3個(gè)處理共9個(gè)土壤樣品，用自封袋低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，去除植物根系并過(guò)2 mm篩后保存于–80℃冰箱，用于16S rRNA和ITS測(cè)序分析。

采用土壤DNA提取試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，美國(guó)）提取土壤微生物總DNA，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，Thermo Scientific，Wilmington，美國(guó)）檢測(cè)提取的DNA的濃度和純度。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。

樣本總DNA提取后，設(shè)計(jì)基因特異性引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增；真菌特異性引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA）和ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）用來(lái)擴(kuò)增真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)（ITS）的ITS1 區(qū)域。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 °C延伸45 s，細(xì)菌16S rRNA 27個(gè)循環(huán)，真菌ITS 35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化，形成測(cè)序文庫(kù)，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

土壤樣本尖孢鐮刀菌（）的豐度用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法測(cè)定，上游引物FOC1（CAGGGGATGTATGAGGAGGCT）和下游引物 FOC2（GTGACAGCGTCGTCTAGTTCC）[19]用來(lái)擴(kuò)增rRNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)（ITS）。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用 SPSS 20.0 和 EXCEL 2007 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用Origin Pro 8.1軟件進(jìn)行作圖。對(duì)Illumina Miseq測(cè)序得到的原始細(xì)菌和真菌序列進(jìn)行成對(duì)讀長(zhǎng)（Paired-end reads，PE reads）拼接、質(zhì)控過(guò)濾和去除單序列、嵌合體；使用 UPARSE 軟件對(duì)優(yōu)化后的序列在 97% 的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)得到分類(lèi)操作單元（OTU），采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，并比對(duì)細(xì)菌（Silva）和真菌（UNITE）的分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU 進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋?zhuān)y(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。利用MOTHUR（ version v.1.30.1）軟件進(jìn)行微生物阿爾法（Alpha）多樣性指數(shù)的計(jì)算，包括Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)、辛普森指數(shù)（Simpson）和覆蓋度Good’s coverage指數(shù)。利用Qiime軟件計(jì)算beta多樣性距離矩陣，R語(yǔ)言進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）分析和作圖。利用Qiime軟件進(jìn)行Mantel test分析。利用R（V2.15.3）pheatmap工具包計(jì)算皮爾森（Pearson）相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合菌劑對(duì)香蕉枯萎病防病效果和病原菌數(shù)量的影響

復(fù)合菌劑對(duì)香蕉枯萎病病情指數(shù)和防病效果的影響如圖1所示。由圖1a）可知，CK處理病情指數(shù)在各個(gè)時(shí)期均最高。在接種病原菌后15 d，CK處理最先發(fā)病，其次是NFP處理。隨著香蕉的生長(zhǎng)，各處理病情指數(shù)均上升。接種35 d后，CK處理病情指數(shù)迅速上升，至接種后55 d，CK處理病情指數(shù)高達(dá)65%，而NFP和NFPT處理病情指數(shù)增長(zhǎng)緩慢且顯著低于CK處理，較CK分別低28%和31%。

將CK 的防病效果指定為0 時(shí)，NFP和NFPT處理的防病效果分別為43%和48%（圖1b））。

注：圖中CK表示不施用生防菌劑，NFP表示施用由非致病性尖孢鐮刀菌和淡紫擬青霉菌按1︰1比例復(fù)配而成的復(fù)合生防真菌制劑，NFPT表示施用由非致病性尖孢鐮刀菌、淡紫擬青霉菌和木霉菌按9︰9︰4的比例復(fù)配而成復(fù)合生防真菌制劑。下同。Note：CK stands for no application of biocontrol agent；NFP for application of a complex anti-fungal agent prepared by combining non-pathogenic Fusarium oxysporum sp. and Purpureocillium sp. in 1︰1 ratio；and NFPT for application of a complex anti-fungal agents prepared by combining non-pathogenic Fusarium oxysporum sp.，Purpureocillium sp. and Trichoderma sp. in 9︰9︰4 ratio. The same below.

由各處理病原菌qPCR分析結(jié)果可知（圖2），復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）病原菌數(shù)量顯著低于CK處理（<0.05），其中復(fù)合菌劑NFP處理病原菌數(shù)量最低，較CK降低了10.15%。以上結(jié)果表明，復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）香蕉枯萎病病情指數(shù)和病原菌數(shù)量均顯著低于CK處理，對(duì)香蕉枯萎病的防效顯著。

圖2 復(fù)合菌劑對(duì)病原菌尖孢鐮刀菌（Foc）數(shù)量的影響

2.2 復(fù)合菌劑對(duì)土壤微生物多樣性的影響

在去除短的、低質(zhì)量的序列、單序列和嵌合體后，9個(gè)樣本共獲得244 105條高質(zhì)量16S rRNA序列和556 075條高質(zhì)量ITS序列用于后續(xù)的群落分析。將每個(gè)樣本的測(cè)序量按最小樣本序列數(shù)（細(xì)菌為20 041條序列、真菌為41 942條序列）抽平至相同的測(cè)序深度后按照97%的相似性進(jìn)行聚類(lèi)，分別得到1 771個(gè)細(xì)菌分類(lèi)操作單元（OTUs）和836個(gè)真菌分類(lèi)操作單元（OTUs）。細(xì)菌和真菌的平均樣本覆蓋度（Average Good’s coverage）分別為98.5%和99.8%，并且細(xì)菌和真菌的稀釋曲線(xiàn)漸趨平緩，這兩者共同說(shuō)明了對(duì)樣本土壤微生物群落的測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和，能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。

阿爾法多樣性分析可用來(lái)研究環(huán)境中微生物的多樣性，通過(guò)單樣本的阿爾法多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性。Sobs和Chao1指數(shù)可用來(lái)反映群落的豐富度，指數(shù)越大，表明物種總數(shù)越大。辛普森指數(shù)可用來(lái)反映群落的多樣性，辛普森值越大，說(shuō)明群落多樣性越低。由表1可以看出，與CK相比，NFPT處理對(duì)土壤細(xì)菌豐度無(wú)顯著性的影響，對(duì)真菌豐度提高有促進(jìn)作用。復(fù)合菌劑NFP和NFPT處理后土壤真菌辛普森指數(shù)顯著低于CK處理，說(shuō)明施用復(fù)合菌劑可顯著提高土壤中真菌群落多樣性。

主坐標(biāo)分析（PCoA分析，Principal co-ordinates analysis）是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，可用PCoA分析來(lái)研究樣本群落組成的相似性或差異性?；贐ray-curtis距離算法的主坐標(biāo)分析結(jié)果表明，不同處理間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯（圖3）。對(duì)細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)而言，不同處理間差異明顯（置換多元方差分析PERMANOVA：細(xì)菌，2=0.256，=0.001；真菌，2=0.318，=0.006）。前兩個(gè)主成分約分別解釋細(xì)菌和真菌群落總變異的47.47%和59.97%。此外，第一主成分（PC1）是最重要的，且CK處理和復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）細(xì)菌和真菌群落組成在第一主成分軸上（PC1）有顯著差異，Bray-curtis距離矩陣在第一主成分軸上（PC1）對(duì)細(xì)菌和真菌群落組成差異的解釋度分別為29.45%和43.14%。

表1 不同處理土壤微生物群落的豐富度和多樣性指數(shù)

注：表中數(shù)值均為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)值后小寫(xiě)字母不同表示處理間差異顯著。Note：The values in the table were of mean±deviation. Different letters in the same column mean significant differences at the<0.05 probability level according to ANOVA.

圖3 各處理基于Bray-Curtis距離的土壤微生物群落（a）細(xì)菌，b）真菌）相似性分析

各處理土壤細(xì)菌在門(mén)和屬分類(lèi)水平上相對(duì)豐度情況如圖4a）和圖4b）所示。由圖4a）可知，各處理土壤細(xì)菌豐度前10優(yōu)勢(shì)菌門(mén)從高至低分別為變形菌門(mén)Proteobacteria、放線(xiàn)菌門(mén)Actinobacteria、綠彎菌門(mén)Chloroflexi、酸桿菌門(mén)Acidobacteria、芽單胞菌門(mén)Gemmatimonadetes、硝化螺旋菌門(mén)Nitrospirae、擬桿菌門(mén)Bacteroidetes、厚壁菌門(mén)Firmicutes、藍(lán)細(xì)菌門(mén)Cyanobacteria、Parcubacteria，大約占各處理土壤細(xì)菌總序列數(shù)的98%以上。由圖4a）可以看出，與CK 處理相比，施用復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）對(duì)土壤細(xì)菌放線(xiàn)菌門(mén)Actinobacteria、酸桿菌門(mén)Acidobacteria、浮霉?fàn)罹T(mén)Planctomycetes豐度的提高有促進(jìn)作用。CK處理有較高的變形菌門(mén)Proteobacteria、芽單胞菌門(mén)Gemmatimonadetes、厚壁菌門(mén)Firmicutes相對(duì)豐度。由圖4b）可以看出，各處理土壤細(xì)菌前5優(yōu)勢(shì)屬分別為、大理石雕菌屬、鏈霉菌屬、類(lèi)諾卡氏菌屬、土微菌屬。與CK處理相比，施用復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）有利于土壤細(xì)菌大理石雕菌屬、類(lèi)諾卡氏菌屬和德沃斯氏菌屬相對(duì)豐度的提高。CK處理有較高的鏈霉菌屬和土微菌屬相對(duì)豐度。

各處理土壤真菌在門(mén)和屬分類(lèi)水平上相對(duì)豐度情況如圖4c）和圖4d）所示。由圖4c）可以看出，各處理90%以上的土壤真菌序列屬于子囊菌門(mén)Ascomycota、接合菌門(mén)Zygomycota、擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota。與CK 處理相比，施用復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）有利于增加土壤真菌接合菌門(mén)Zygomycota、unclassified_k__Fungi、擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota相對(duì)豐度，CK處理有較高的子囊菌門(mén)Ascomycota相對(duì)豐度。由圖4d）可以看出，各處理土壤真菌前5優(yōu)勢(shì)屬分別為、鐮孢菌屬、、屬、曲霉屬。與CK處理相比，施用復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）鐮刀菌屬、屬相對(duì)豐度明顯升高，、、曲霉屬、屬、毛殼菌屬相對(duì)豐度明顯下降。

圖4 各處理土壤微生物（a）細(xì)菌門(mén)，b）細(xì)菌屬，c）真菌門(mén)，d）真菌屬）相對(duì)豐度

由圖5a）可知，復(fù)合真菌制劑NFP處理擬青霉屬相對(duì)豐度在3個(gè)處理中最高，但各處理間差異不顯著；復(fù)合真菌制劑NFPT處理木霉屬相對(duì)豐度較CK處理高（圖5b）），但差異未達(dá)顯著水平。此外，由圖5c）可以看出，施用復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）鐮刀菌屬相對(duì)豐度高于CK處理，但差異也未達(dá)到顯著水平。

圖5 各處理中擬青霉屬Paecilomyces（a））、木霉屬Trichoderma（b））和鐮刀菌屬Fusarium（c））相對(duì)豐度

2.3 土壤微生物多樣性與香蕉枯萎病的相關(guān)性

由Mantel Test分析可知，土壤細(xì)菌和真菌群落組成與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著相關(guān)（細(xì)菌，=0.509，=0.001；真菌，=0.370，=0.035）。由表2可知，公認(rèn)的與植物抑病相關(guān)的細(xì)菌門(mén)類(lèi)相對(duì)豐度，如擬桿菌門(mén)Bacteroidetes和放線(xiàn)菌門(mén)Actinobacteria與香蕉枯萎病病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著。包含多種叢枝菌根的球囊菌門(mén)Glomeromycota相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)也無(wú)顯著相關(guān)性。但是變形菌門(mén)Proteobacteria、芽單胞菌門(mén)Gemmatimonadetes、厚壁菌門(mén)Firmicutes和子囊菌門(mén)Ascomycota相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著正相關(guān)，酸桿菌門(mén)Acidobacteria相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著負(fù)相關(guān)。

表2 土壤細(xì)菌和真菌門(mén)相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)的皮爾森相關(guān)系數(shù)

注：*表示相關(guān)性在5%水平差異顯著；**表示相關(guān)性在1%水平差異顯著。下同。Note：* indicates significant correlation at the 5% level；** significant correlation at the 1% level. The same below. ①Phyla，②Relative abundance，③Correlation coefficient.

由表3可知，細(xì)菌、鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著正相關(guān)。真菌、曲霉菌屬、、、毛殼菌屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著正相關(guān)。盡管公認(rèn)的有益菌屬如類(lèi)芽孢桿菌屬、木霉屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)相關(guān)性不顯著，一些潛在的生防屬如、大理石雕菌屬、類(lèi)諾卡氏菌屬、、_、、屬、野野村式菌屬、屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著負(fù)相關(guān)。有趣的是，鐮刀菌屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著。由圖5c）可以看出，復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）鐮刀菌屬相對(duì)豐度高于CK處理，但差異未達(dá)到顯著水平；進(jìn)一步的qPCR結(jié)果（圖2）顯示復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）病原菌尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著低于CK處理。

表3 土壤細(xì)菌和真菌屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)的皮爾森相關(guān)系數(shù)

①Relative abundance，②Correlation coefficient

3 討 論

3.1 復(fù)合菌劑防治香蕉枯萎病的效果

香蕉枯萎病是香蕉生產(chǎn)過(guò)程中毀滅性的土傳病害，已引起世界各香蕉生產(chǎn)國(guó)的廣泛關(guān)注，生物防治是香蕉土傳枯萎病防治的理想途徑[10]。本研究試圖探究復(fù)合菌劑抑制香蕉枯萎病的可能機(jī)制。研究結(jié)果表明，復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著低于CK處理（圖1），對(duì)香蕉枯萎病有較高的防效，且病原菌qPCR結(jié)果顯示，復(fù)合菌劑NFP和NFPT處理病原菌數(shù)量顯著低于CK處理（圖2），這與Larkin和Fravel等[14]報(bào)道的多種拮抗菌混合施用能更好地防治番茄枯萎病的結(jié)果一致。

3.2 復(fù)合菌劑對(duì)根區(qū)土壤微生物多樣性的影響

土壤微生物群落多樣性是反映土壤健康的重要指標(biāo)，土壤微生物群落是土壤生態(tài)系統(tǒng)持續(xù)發(fā)揮作用的重要媒介，優(yōu)化的土壤微生物結(jié)構(gòu)對(duì)防治土傳病害有積極的促進(jìn)作用[20]。本研究通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS測(cè)序，分析了土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性。采用絕對(duì)定量PCR（qPCR）分析了病原菌的數(shù)量。研究結(jié)果表明，復(fù)合菌劑NFP和NFPT處理對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落豐富度的增加有促進(jìn)作用，且顯著增加了真菌群落的多樣性（表1），且有研究[21-22]表明更高的土壤微生物群落豐富度和多樣性在提高土壤抗病性的過(guò)程中有重要的作用。本試驗(yàn)中施用復(fù)合菌劑NFP和NFPT后，土壤微生物群落發(fā)生了顯著的變化，基于Bray-curtis距離矩陣的PCoA分析結(jié)果表明，復(fù)合菌劑NFP和NFPT擁有結(jié)構(gòu)上與CK處理明顯不同的細(xì)菌和真菌群落（圖3），且Mantel Test分析結(jié)果表明土壤細(xì)菌和真菌群落組成與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著相關(guān)（細(xì)菌，=0.509，=0.001；真菌，=0.370，=0.035；表2和表3），說(shuō)明土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異可能是調(diào)控香蕉枯萎病發(fā)生的主要因子之一[23]。綜上所述，在土壤中施入兩種復(fù)合菌劑刺激了除功能菌外的某些相似的土壤微生物，這些被刺激增長(zhǎng)的土壤微生物可能會(huì)進(jìn)一步影響土壤中微生物的相互作用且可能具有潛在的拮抗性，從而幫助減少植物病害[24]。

施用復(fù)合菌劑是塑造土壤微生物群落組成的主要因素。就細(xì)菌屬水平上微生物組成的變化而言，施用復(fù)合菌劑處理明顯提高了放線(xiàn)菌門(mén)的大理石雕菌屬、類(lèi)諾卡氏菌屬、野野村式菌屬和酸桿菌門(mén)的、、屬相對(duì)豐度（圖4），且這些屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著負(fù)相關(guān)（表3），表明這些屬可能對(duì)香蕉枯萎病的抑制有重要作用。已有研究表明大理石雕菌屬、類(lèi)諾卡氏菌屬、野野村式菌屬能促進(jìn)大豆、苜蓿等作物生物量的提高[25]，提高作物抵抗病害的能力。本研究結(jié)果中酸桿菌門(mén)Acidobacteria相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（表2），這與Sanguin等[26]研究的抗病土壤有更高的酸桿菌門(mén)Acidobacteria豐度結(jié)果一致。本研究中酸桿菌門(mén)的、和屬相對(duì)豐度與抗病性呈顯著負(fù)相關(guān)（表3），但是它們的抗病機(jī)制尚不清楚。已有研究表明，芽孢桿菌屬能抑制某些作物的土傳病害[27]，但是在本研究中，相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)正相關(guān)（表3），這可能是因?yàn)橥寥烂富钚浴⑼寥牢锢砘瘜W(xué)性質(zhì)等土壤性質(zhì)的改變會(huì)影響微生物群落，從而影響作物與有益微生物間的相互關(guān)系[28]。施用復(fù)合菌劑也改變了真菌群落結(jié)構(gòu)組成。本研究中，子囊菌門(mén)Ascomycota和結(jié)合菌門(mén)Zygomycota在所有樣本中相對(duì)豐度最高（圖4c））。此外，使用復(fù)合菌劑降低了子囊菌門(mén)Ascomycota相對(duì)豐度，且子囊菌門(mén)相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著正相關(guān)（表3）。已有研究表明子囊菌門(mén)中包含一些致病菌[29]，且香蕉根際子囊菌門(mén)相對(duì)豐度的降低與抑制香蕉枯萎病關(guān)系密切[30]。在真菌屬水平上，施用復(fù)合菌劑顯著提高了屬相對(duì)豐度，且屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著負(fù)相關(guān)（=–0.769）（表3）。是子囊菌門(mén)一個(gè)新提出的屬[31]，尚無(wú)其與枯萎病關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。本研究中施用復(fù)合菌劑降低了毛殼菌屬和曲霉菌屬相對(duì)豐度，且毛殼菌屬和曲霉菌屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著正相關(guān)（表3）。據(jù)報(bào)道，毛殼菌屬與棉花黃萎病發(fā)生程度呈正相關(guān)[32]。且研究表明西瓜連作后，以曲霉菌屬等為主的真菌數(shù)量大幅增加，導(dǎo)致連作西瓜易發(fā)病[33]。

3.3 復(fù)合菌劑防治香蕉枯萎病的可能機(jī)制

本文的研究結(jié)果表明，復(fù)合菌劑（NFP和NFPT）中的功能菌（non-pathogenicsp.，sp.和sp.）在土壤中生存能力有限，對(duì)香蕉枯萎病病原菌直接的抑制作用很小，其抗病的機(jī)理可能為：引入土壤中的功能菌可能是作為關(guān)鍵群落成員，刺激了土著有益微生物中其他潛在的拮抗物種，增加了土壤微生物多樣性，改變了土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，這種生物防治相互作用的復(fù)雜關(guān)系說(shuō)明疾病抑制通常是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象，復(fù)雜的微生物群落可能對(duì)抑病有決定性作用[34]。研究表明，在抗病性土壤中，因?yàn)榉侵虏⌒约怄哏牭毒椭虏⌒约怄哏牭毒南嗷プ饔脤?dǎo)致了土壤的抗病性；非致病性尖孢鐮刀菌和致病性尖孢鐮刀菌區(qū)別在于，非致病性尖孢鐮刀菌從根部侵入后并不會(huì)繼續(xù)侵入維管系統(tǒng)導(dǎo)致植物發(fā)病[8]。在接種病原菌前接種的非致病性尖孢鐮刀菌（non-pathogenicsp.）可能會(huì)和病原菌搶占根表有限的侵染位點(diǎn)[35]；同時(shí)施入土壤中的木霉菌（sp）因其強(qiáng)大的繁殖和養(yǎng)分吸收能力可能會(huì)使其與病原菌爭(zhēng)奪有限的養(yǎng)分和空間[16]，制約了病原菌的生長(zhǎng)與繁殖；施入土壤中的生防真菌淡紫擬青霉菌（sp.）對(duì)植物寄生的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)有一定的生防效果，減少了根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)植物根系的損傷[36]，從而減少了病原菌的侵染。這些機(jī)制相互作用，相互協(xié)同，對(duì)提高復(fù)合菌劑的生防效果可能有積極的促進(jìn)作用。

本文中另一個(gè)想探討的問(wèn)題是接入土壤中的功能菌（non-pathogenicsp.，sp.和sp.）是否會(huì)對(duì)香蕉枯萎病病原菌產(chǎn)生直接的抑制作用？盡管復(fù)合真菌制劑NFPT處理木霉屬相對(duì)豐度較CK處理高（圖5b）），但是木霉屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)未達(dá)到顯著的負(fù)相關(guān)（表3）。此外，復(fù)合真菌制劑NFP處理擬青霉屬相對(duì)豐度在3個(gè)處理中最高（圖5a）），但是屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)也未達(dá)到顯著的負(fù)相關(guān)（表3）。本研究中復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）鐮刀菌屬相對(duì)豐度高于CK處理，但差異未達(dá)到顯著水平（圖5c）），鐮刀菌屬相對(duì)豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)（未達(dá)到顯著水平），且病原菌尖孢鐮刀菌的qPCR 分析結(jié)果表明復(fù)合真菌菌劑處理（NFP和NFPT）病原菌尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著低于CK處理（圖2），但是由于Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)序長(zhǎng)度的限制，測(cè)序結(jié)果不能在物種級(jí)別上進(jìn)行詳細(xì)的分類(lèi)特征描述，因此難以區(qū)分致病性尖孢鐮刀菌和非致病性尖孢鐮刀菌。綜上所述，本研究結(jié)果表明，引入土壤中的微生物（非致病性尖孢鐮刀菌Non-pathogenicsp.、木霉菌sp.和淡紫擬青霉菌sp.）在盆栽土壤中生存能力有限，并且它們的豐度對(duì)豐度和防治香蕉枯萎病的直接影響很小，并不對(duì)病原菌產(chǎn)生直接的拮抗作用。

本試驗(yàn)通過(guò)兩季的盆栽試驗(yàn)，利用對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因和真菌ITS區(qū)域的高通量測(cè)序，研究了復(fù)合真菌制劑對(duì)香蕉枯萎病的防治效果及其機(jī)理。但是由于16S rRNA和ITS 測(cè)序僅能開(kāi)展在菌屬層面的分析，因此，后續(xù)試驗(yàn)將通過(guò)宏基因組和轉(zhuǎn)錄組等分子生物學(xué)手段進(jìn)一步探索影響香蕉枯萎病發(fā)生的關(guān)鍵菌種及其功能基因，為防治香蕉枯萎病提供理論依據(jù)。本研究所得結(jié)果基于盆栽試驗(yàn)，需要進(jìn)一步在田間試驗(yàn)中驗(yàn)證，然后再應(yīng)用于生產(chǎn)。

4 結(jié) 論

基于盆栽研究結(jié)果表明，施用復(fù)合真菌制劑顯著降低了香蕉枯萎病的病情指數(shù)，能有效防治香蕉枯萎?。皇┯脧?fù)合真菌制劑提高了細(xì)菌和真菌豐富度和多樣性，改變了細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)；加入土壤中的生防真菌菌株在發(fā)揮其拮抗作用的同時(shí)刺激了土壤自身潛在的有益微生物種群，與之協(xié)同作用，提高了復(fù)合真菌制劑對(duì)香蕉枯萎病的防治效果。

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Effects of Complex Anti-Fungal Agents Biocontrolling Fusarium Wilt on Banana and Its Microbiological Mechanism

GUI Sha, LIU Fang, ZHANG Lidan, FAN Xiaolin?

(College of Natural Resource and Environment Science, South China Agricultural University, R & D Center of Environment Friendly Fertilizer Science and Technology of Guangdong Provincial University, Guangzhou 510642, China )

【】Worldwidely, banana production is severely hindered by banana Fusarium wilt, a devastating soil-borne disease caused byf. sp.(Foc). With no widely adopted effective methods available to control or prevent the disease, it causes serious economic losses every year. In this study, complex biocontrol fungal agents were introduced and effects of their application preventing banana Fusarium wilt and potential mechanisms were explored, in an attempt to provide certain references for controlling disease on the large field scale. 【】 A pot experiment, lasting for 2 seasons were conducted and designed to have three groups of pots, namely, CK (no controlling agent applied), NFP (NFP for application of a complex anti-fungal agent prepared by combining non-pathogenicsp. andsp. in 1︰1 ratio), and NFPT (application of a complex anti-fungal agents prepared by combining non-pathogenicsp.,sp. andsp. in 9︰9︰4 ratio) for comparison between the pots for effects of the applications controlling banana Fusarium wilt and effects on soil microbial diversity. The Illumina Miseq high-throughput sequencing platform was used to analyze bacterial 16SrRNA gene and fungal ITS regions, the real-time fluorescence quantification PCR (RT-qPCR) was to determine number of pathogens in the soil. 【】Applications of the complex fungal agents (NFP and NFPT) have good effects of controlling banana Fusarium wilt disease, with control efficiency being 43% and 48%, respectively, and improve richness and diversity of bacteria and fungi. Principal coordinate analysis (PCoA) based on Bray-curtis distance matrix shows that significant differences in composition of the bacterial and fungal communities exist between the pots applied with the complex fungal agents and the pots in CK. The first principal component (PC1) explains 29.45% and 43.14% of the variability in the bacterial and fungal communities, respectively, and differs sharply between the treatment pots and the CK pots in composition of the overall bacterial and fungal communities. The microbes (non-pathogenicsp.,sp. andsp.) introduced into the soil are found quite limited in survivability in this study, and their abundance has only a marginal direct effect on the number ofand disease severity of the Fusarium wilt disease. However, they suppress the disease by altering composition of the soil microbiome. In particular, application of the complex fungal agents (NFP and NFPT) increases relative abundances of the beneficial indigenous microbial groups, such as,,, n,and_4. Their relative abundances are good indicators of the disease suppression effect and may play a keystone role in the process of the complex fungal agents suppressing banana Fusarium wilt disease. 【】 In a word, application of the complex fungal agents (NFP and NFPT) significantly reduces the banana Fusarium wilt disease severity index. All the findings presented above show that relative abundance of the introduced non-pathogenicsp.,sp. andsp. has only a marginal effect on. In contrast, the changes in abundance and community structures of the bacteria and fungi after application of the agents are the key factors suppressing the disease. Application of the agents stimulates the potential beneficial indigenous microbial groups that are significantly and negatively related to banana Fusarium wilt disease severity index. Thus, the effect of the complex fungal agents suppressing the disease seemed to be a joint one of the actual antagonism of the introduced microbes with the pathogens and their promoting growth of beneficial indigenous microbial groups.

Complex biocontrol fungal agents; Banana Fusarium wilt; Illumina Miseq High-throughput sequencing; Soil microbial diversity

S432.4+5

A

10.11766/trxb201904180111

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* 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFD0201100），廣東省省級(jí)重大科研項(xiàng)目（2016KZDXM029）和國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-31-06）資助 Supported by the National Key Research and Development Program of China（No. 2018YFD0201100），the Major Scientific Research Projects of Guangdong Province in China（No.2016KZDXM029） and the Special Project for the Construction of China Agriculture Research System（No. CARS-31-06）

，E-mail：crfxiaolinfan@126.com

桂 莎（1990—），女，湖南永州人，博士研究生，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)和肥料學(xué)研究。E-mail：932005243@qq.com

2019–04–18；

2019–07–23；

2019–09–24

（責(zé)任編輯：陳榮府）