金潔　施琪浩　蔣鑫　章少陽　張嘉琪　董俊杰　洪文燕　秦利明　張英杰　鐘愛國

摘????? 要：利用 Gaussion 09W軟件在DTF/B3LYP 6-311+G水平下優(yōu)化并計算了新型基因興奮劑促紅細胞生成素阿法依伯?。‥PO）的四大分子光譜：紫外-可見吸收光譜，紅外吸收光譜，拉曼吸收光譜以及核磁共振吸收光譜;計算了22種常見單取代衍生物的氫和氧原子信息指數(shù)，討論了其在馬拉松運動員體液酸堿性（pK_a）檢測中的預(yù)報應(yīng)用。所得結(jié)果可協(xié)助對阿法依伯汀分子光譜理解及體液檢測。

關(guān)? 鍵? 詞：制藥工程實驗;基因興奮劑;促紅細胞生成素;譜學(xué)分析

中圖分類號：G822.8?????? 文獻標(biāo)識碼： A?????? 文章編號： 1671-0460（2020）06-1107-04

Spectroscopic Analysis and Identification of Alfaibertin in Pharmaceutical Engineering Specialty Experiments

JIN Jie， SHI Qi-hao， JIANG Xin， ZHANG Shao-yang， ZHANG Jia-qi， DONG Jun-jie，

HONG Wen-yan， QIN Li-min， ZHANG Ying-jie， ZHONG Ai-guo^*

（College of Pharmaceutical， Chemical and Materials Engineering， Taizhou University， Taizhou Zhejiang 318000， China）

Abstract： Using Gaussion 09W software， the four macromolecular spectra of the novel gene stimulant EPO were optimized and calculated at DTF/B3LYP 6-311+G level： UV-Vis， IR， LM and¹HNMR，¹³CNM. R. Its specific application in marathon athletes' body fluid detection was discussed. The research is helpful for having a more perceptual understanding of the three-dimensional structure of erythropoietin molecule.

Key words： Pharmaceutical engineering experiments; Gene stimulants; Erythropoietin; Spectral analysis

藥物EPO是促紅細胞生成素（erythropoietin）的英文簡稱^[1-3]。人體中的促紅細胞生成素是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，能夠促進紅細胞生成。1985年科學(xué)家應(yīng)用基因重組技術(shù)，在實驗室獲得重組人EPO。1989年安進（Amgen）公司的第一個基因重組藥物阿法依伯?。‥pogen）獲得FDA的批準(zhǔn)，成為名副其實的"重磅炸彈"基因藥物，創(chuàng)下了生物工程藥品單個品種之最，是當(dāng)今最成功的基因工程藥物^[4]。國內(nèi)已有10多家單位獲準(zhǔn)生產(chǎn)紅細胞生成素阿法依伯?。ㄒ妶D1）。

鑒于大劑量使用 EPO 對人體危害和對體育運動公平性的沖擊， 我國從1998年開始就對 7個體能項目進行血液檢查，是世界上最早對 EPO 進行血檢的國家之一。由于使用這種重組基因興奮劑所產(chǎn)生的 EPO 與內(nèi)源性的非常相似，目前還沒有好辦法區(qū)分開來。本文試圖從波譜學(xué)和分子酸堿性兩個角度分析其特征，所得結(jié)果可為運動員體液檢測提供數(shù)據(jù)參考。

1? 計算方法

PC電腦一臺安裝; Chem 3 D、GaussView 5.0.9、Gaussian 09 W、ACD-Labs 6.0、ChemDraw 8.0、Multiwfn 3.5、Origin 8.5等軟件。通過 Multiwfn 3.5 軟件來計算EPO分子的4種熵值（申農(nóng)熵、費歇爾熵、二級費歇爾熵、Parr熵）。采用 ACD-Lab 6.0 軟件測得的 pK_a 的線性關(guān)系。用高斯軟件等軟件系統(tǒng)對EPO建模優(yōu)化，并判斷化學(xué)結(jié)構(gòu)鍵對其酸度系數(shù)（pK_a）是否影響，此文將通過計算EPO及其衍生物的二級費歇爾熵、Parr 熵、申農(nóng)熵、費歇爾熵與其酸性 pK_a值，來得到各類熵和酸度系數(shù)相關(guān)性線性方程，并選出其中相關(guān)性最高的關(guān)于預(yù)測酸度系數(shù) （pK_a） 的線性方程。除此之外，此文還將通過軟件模擬其紅外（拉曼）光譜 （IR）、紫外-可見光譜（UV-VIS）、核磁譜圖（¹HNMR，¹³CNMR），來指認(rèn)EPO的分子光譜。

2? 結(jié)果與討論

2.1? EPO分子骨架結(jié)構(gòu)分析

EPO分子結(jié)構(gòu)在很大程度上影響了其反應(yīng)性、極性、相態(tài)、顏色、磁性和生物活性。分子結(jié)構(gòu)涉及原子在空間中的位置，與化學(xué)鍵種類有關(guān)，包括鍵長、鍵角以及相鄰三個鍵之間的二面角（見表1）。

2.2? EPO分子前線軌道分析

EPO分子及其常見5種單取代基衍生物的前線軌道圖列于表2。其前線軌道能級差?E隨著取代基順序—H、—CH₃、—C₂H₅、—NH₃、—OH、—NO₂ 增大。

2.3? EPO分子光譜分析

2.3.1? 紫外-可見吸收光譜

紫外吸收光譜是由于物質(zhì)吸收紫外光導(dǎo)致價電子從低能級躍遷至高能級，產(chǎn)生了吸收峰形成的。通過分子對紫外光的吸收所產(chǎn)生的紫外可見光譜和吸收程度就可以對物質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、含量進行鑒定。通過 GaussView 5.0.9 實現(xiàn)建模并計算，得到EPO的模擬吸收譜，用Origin 8.5進行譜圖處理。圖2顯示EPO在 239.24 nm 處有最大吸收波長，在近紫外區(qū)范圍內(nèi)發(fā)生了n→σ^*躍遷。

2.4? 紅外-拉曼吸收光譜

在本中通過 GaussView 5.0.9 實現(xiàn)建模并計算，得到EPO紅外吸收譜圖和拉曼吸收光譜圖（圖3），頻率則通過利用 Frequency 計算得到，最后用 Origin 8.5 進行譜圖處理。拉曼光譜是印度物理學(xué)家 Raman 于 1928 年發(fā)現(xiàn)的，上述給我們通過拉曼光譜來實現(xiàn)對分子主要官能團與結(jié)構(gòu)特征的探究提供材料。

EPO的紅外光譜圖的吸收峰如下：在776 cm^-1處的吸收峰是苯環(huán)上的一取代特征峰;在1 352 cm^-1處的吸收峰為 R—SO₂—OH 的反對稱伸縮振動;在 1 504 cm^-1處的吸收峰為C—C的伸縮振動;在

3 960 cm^-1處的吸收峰為 C=O 的伸縮振動。在譜圖中還存著某些吸收頻率較小基團的吸收峰。EPO的拉曼光譜圖的吸收峰如下：在 1 024 cm^-1處的吸收峰為單取代苯 C—H 的變形振動;在 3 360 cm^-1處的吸收峰為 C—H 對稱伸縮振動;在 3 960 cm^-1處的吸收峰為 O—H 的對稱伸縮振動。拉曼光譜圖分析如圖3（b） 所示。拉曼光譜圖的吸收峰如下：在1 584 cm^-1處的吸收峰為 OH 的對稱伸縮振動;在

3 360 cm^-1處的吸收峰為 C—H 對稱伸縮振動;在 3 960 cm^-1處的吸收峰為 C—H 的對稱伸縮振動。

2.5? 熒光-磷光發(fā)射光譜

通過高斯 09 軟件實現(xiàn) EPO 建模結(jié)構(gòu)優(yōu)化，熒光發(fā)射光譜圖頻率則通過 Energy 方法計算得到，再借助 Origin 8.5 作圖分析如圖4所示。圖4a 顯示了EPO 在 239.5 nm 處有最大發(fā)射波長，且在近紫外區(qū)范圍內(nèi)。而其磷光發(fā)射在249.9 nm 處（圖4b），有較長發(fā)射波長的原因是發(fā)生分子內(nèi)發(fā)生了電子 n→π* 躍遷。

2.6? 核磁共振吸收光譜

核磁共振可用于測定分子中某些原子的數(shù)目、類型和相對位置。使用 GaussView 5.0.9 和 Origin 8.5 進行譜圖處理。使用軟件 Chem Draw 8.0 打開模型，采用 Predict 1 H-NMR shifts 和 Predict 13 C-NMR shifts 方法計算得到核磁光譜圖，如圖 5 所示。

3? 反應(yīng)活性分析

3.1? 氫原子的信息理論指數(shù)與酸堿性分析

生命活動需要充足的氧氣，當(dāng)氧氣不足時，細胞里的氧氣含量下降，原本需要被清除的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HIF-1無法降解，從而讓低氧應(yīng)答元件能指導(dǎo)細胞大量合成促紅細胞生成素，進而制造更多的紅細胞來運輸更多的氧氣。很久以前科學(xué)家們就發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氧氣不足的時候，身體會合成一種叫做促紅細胞生成素的物質(zhì)（erythropoietin，EPO），它是一種糖蛋白激素，可以刺激骨髓生產(chǎn)更多的紅細胞，讓更多的氧氣有機會被運輸?shù)缴眢w組織里。北京時間10月7日，2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎共同授予William G. Kaelin Jr、Sir Peter J. Ratcliffe和 Gregg L. Semenza，以表彰他們在理解細胞感知和適應(yīng)氧氣變化機制中的貢獻。生物體感受氧氣濃度的信號識別系統(tǒng)是生命最基本的功能，然而學(xué)界對此卻所知甚少。正是三位諾獎得主的研究揭示了其中的機制。本文用高斯等軟件系統(tǒng)對EPO及其衍生物等對象建模優(yōu)化，并判斷取代基對其酸度系數(shù)（pK_a）是否影響。此文還將通過計算EPO及其衍生物的二級費歇爾熵I_F'、G_s、申農(nóng)熵S_s、費歇爾熵I_F與pK_a值，來得到各類熵和酸度系數(shù)相關(guān)性線性方程，并選出其中相關(guān)性最高的關(guān)于預(yù)測酸度系數(shù)（pK_a）的線性方程。從而來實現(xiàn)對其他新型衍生物的酸度系數(shù)預(yù)測的目的（見表3）。

3.2? 氧原子的信息理論指數(shù)與酸堿性分析

通過 GaussView 5.0.9 計算所得的苯磺酸及其 22 種衍生物 O、H 原子的申農(nóng)熵（S_s）、費歇爾熵 （I_F）、二級費歇爾熵（I_F）、Parr熵（G_s）和通過 ACD-Labs 6.0 預(yù)測得到的相應(yīng)衍生物酸度系數(shù)（pKa），結(jié)果如表4所示。

為了更明顯地表達出熵值變化與酸度系數(shù)（pKa）的線性關(guān)系，分別用EPO及其 22 種衍生物的申農(nóng)熵（S_s）、費歇爾熵（I_F）、二級費歇爾熵（I_F）、Parr熵 （G_s） 的熵值與 pK_a值進行 Origin 作圖分析，得出相關(guān)性系數(shù)。EPO及其 22 種衍生物 H 原子的申農(nóng)熵與 pK_a值關(guān)系如圖6a所示，相關(guān)系數(shù)為0.932 7，線性方程為y=126.024 57-74.388 98x。EPO及其 22 種衍生物 O 原子的申農(nóng)熵與pK_a值關(guān)系如圖6b所示，相關(guān)系數(shù)R為0.589 34，R²為0.287 99，線性方程為y=59.349 45-22.329 86x。

4? 結(jié) 論

通過高斯軟件系統(tǒng)構(gòu)建了EPO和它的22 種衍生物模型，優(yōu)化篩選之后得出以下結(jié)論。

1）EPO及其22種衍生物的H、O 原子的申農(nóng)熵（S_s）、費歇爾熵（I_F）、Parr熵（G_s）變化較小，而 H、O原子的二級費歇爾熵（I_F），變化較為明顯，其中 H 原子的 Parr熵與pK_a的線性方程的R值最大（R為0.933 51，R²為0.859 75），即相關(guān)性最好。因此可運用Parr熵與pK_a的線性方程（y=137.821 69-31.603 53x）來預(yù)測其他EPO衍生物的酸度系數(shù)。

2）通過紅外光譜 （IR）、拉曼光譜 （Raman）、紫外-可見光譜（UV-VIS）、核磁譜圖（¹H-NMR，¹³C-NMR） 對EPO及部分衍生物進行模擬預(yù)測， 為制藥工程專業(yè)實習(xí)提供材料，也對EPO衍生物的光譜預(yù)測與檢測提供了基礎(chǔ)性參考數(shù)據(jù)。

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