高珍珍, 王蓉, 龔松玲, 朱容, 劉章勇, 金濤, *

不同類型秸稈還田對稻田土壤氨氧化微生物群落結構的影響

高珍珍1, 王蓉2, 龔松玲1, 朱容1, 劉章勇1, 金濤1, *

1. 長江大學農學院, 湖北, 荊州 434025 2. 黃岡市農業(yè)科學院, 湖北, 黃岡 438000

為探討油菜、蠶豆秸稈還田對稻田土壤氨氧化微生物群落結構的影響, 以江漢平原堿性潮土為研究對象, 設置單施化肥(NS)、油菜秸稈+單施化肥(RS)、蠶豆秸稈+單施化肥(BS)3個處理, 借助Illumina Miseq高通量測序平臺, 探究不同類型秸稈還田對水稻土氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細菌(AOB)群落多樣性及群落結構的影響。結果表明, 不同類型秸稈還田對AOB群落Alpha多樣性指數(shù)的影響強于AOA。對于AOB群落, 相比NS處理, 秸稈還田(RS和BS)處理提高了其多樣性指數(shù)。其中, RS處理的多樣性指數(shù)高于BS處理。Veen分析結果顯示, 相比AOA, 不同類型秸稈還田對AOB基因序列OTU數(shù)目和分布的影響較大。其中, RS處理對OTU分布的影響強于BS處理。綱水平上, 不同類型秸稈還田對AOA群落的物種組成及物種相對豐度沒有顯著影響(>0.05)。但對于AOB群落, RS處理中unclassified_p__Proteobacteria的相對豐度比NS處理高2倍(<0.05), 比BS處理高1.45倍(>0.05); 相比NS處理, RS處理減少了norank_p__ammonia-oxidizing_bactera_ensemble的相對豐度, 而BS處理缺失這一物種。綜上可知, 堿性潮土中AOB對不同類型秸稈還田的響應強于AOA。相比BS處理, RS處理對AOB群落結構的影響更大。

油菜秸稈; 蠶豆秸稈; 氨氧化古菌; 氨氧化細菌

0 前言

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 其群落結構的變化能夠直接影響土壤環(huán)境、養(yǎng)分條件等[1-2], 在土壤氮素循環(huán)過程中起著舉足輕重的作用。硝化作用作為土壤氮素循環(huán)的關鍵環(huán)節(jié)之一, 與氮素有效利用率及硝酸鹽淋溶、土壤酸化等密切相關[3-4]。硝化作用一般由2種微生物驅動完成, 即由亞硝化細菌驅動的氨氧化過程(Ammonia oxidation), 和由硝化細菌驅動的亞硝酸氧化過程(Nitrite oxidation)。其中, 氨氧化過程對整個硝化作用的速率起決定作用[5], 主要由含氨單加氧酶基因的氨氧化細菌(Ammonia oxidizing bacteria, AOB)和氨氧化古菌(Ammonia oxidizing archaea, AOA)驅動完成[6]。AOA和AOB的數(shù)量、群落結構直接影響土壤的氮素形態(tài)轉化及其利用, 與土壤質量密切相關[7]。稻田干濕交替的灌溉方式為AOA和AOB提供了特殊的生境, 成為農田生態(tài)系統(tǒng)中硝化作用及其微生物生態(tài)研究的熱點[8]。

水稻在我國糧食產業(yè)安全和農業(yè)經濟發(fā)展中起重要作用, 是我國約60%以上的人口的主食[9]。研究表明, 秸稈還田能夠增加水稻產量[9, 10], 改變土壤中氮固定相關微生物的多樣性[11-12]、豐度, 進而影響硝化作用強度[13-15], 最終將影響整個農田生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)。蘭木羚等[16]研究結果表明, 水稻、玉米、油菜、小麥秸稈還田均能提高水田土壤微生物的物種豐富度和優(yōu)勢度指數(shù), 其中油菜和小麥秸稈還田對土壤微生物群落結構的影響最大。陳春蘭等[17]研究表明, 水稻秸稈還田對AOB群落豐度和結構都沒有顯著影響, 甚至降低了amoA基因多樣性指數(shù)和均勻度。劉曉蒨[18]研究表明, 小麥秸稈還田可以豐富AOA和AOB群落多樣性和群落結構。高嵩涓[19]研究結果表明, 紫云英、油菜、黑麥草還田對雙季稻田AOA和AOB amoA中的主要OTU(相對豐度大于0.8%)的影響不同。由此可見, 不同類型秸稈還田對稻田AOA和AOB群落多樣性和群落結構的影響不同。

本文選取我國南方稻區(qū)兩種常見的冬季作物-蠶豆、油菜秸稈進行水稻盆栽試驗, 借助Illumina Miseq高通量測序平臺探究不同類型秸稈還田對稻田土壤AOA和AOB群落多樣性及群落結構的影響, 旨在揭示不同類型秸稈還田條件下稻田土壤氨氧化微生物群落多樣性及群落結構的變化, 為深入研究秸稈還田條件下稻田硝化微生物調控土壤氮素機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2018年6月在湖北省荊州市長江大學農學院試驗基地(30°6′N, 111°54′E)開展, 該地毗鄰長江與南水北調工程, 屬江漢平原轄內, 水源充沛, 年降水量1100 mm左右, 無霜期200 d, 溫光資源充足, 具有雨熱同季的典型亞熱帶季風性氣候特點。土壤類型為潮土, 土壤母質為河流沖積物。試驗前土壤肥力指標: pH 7.43, 有機質16.8 g·kg-1, 全氮1.59 g·kg-1, 堿解氮115.7 mg·kg-1, 速效磷5.17 mg·kg-1, 速效鉀129.59 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

采用盆栽試驗, 試驗用盆為圓柱形塑料盆(32.5 cm× 28.5 cm)。試驗前將供試土壤風干、粉碎, 去除碎石、雜草、根系等雜物, 過10 mm篩。每盆裝25 kg過篩風干土, 置于試驗基地露天區(qū)。試驗設置3個處理: 單施化肥(NS); 油菜秸稈+單施化肥(RS); 蠶豆秸稈+單施化肥(BS), 每個處理4次重復。油菜與蠶豆秸稈經植株磨樣機粉碎后與土壤充分混合均勻, 每盆還田量均為83.33 g。另外每盆施入5.43 g尿素, 6.94 g過磷酸鈣, 1.94 g氯化鉀。氮肥按照基肥: 分蘗肥: 穗肥=5:2.5:2.5施用, 磷肥一次性基施, 鉀肥按照基肥、穗肥各50%施用。水稻供試品種為隆兩優(yōu)華占, 油菜秸稈供試品種為華油雜62號, 蠶豆秸稈供試品種為大青蠶豆。秸稈于水稻插秧前一周施入盆中, 水稻于2018年6月6日插秧, 每盆4穴, 每穴2苗, 9月20日收獲。水稻生長期間均采用前期灌水、中期(分蘗末期)曬田、后期(齊穗后期)干濕交替的灌溉模式。

1.3 土壤樣品采集

于2018年8月21日水稻齊穗期每盆選取3個點采集水稻耕作層(0—15 cm)土壤, 3份土樣混合均勻, 并剔除雜草、根系、碎石等雜物后分成兩部分。一部分土壤樣品迅速用錫箔紙包裹, 放入液氮中進行冷凍處理, 帶回實驗室后, 置于-80℃超低溫冰箱保存, 用作微生物測定分析。另一部分土壤樣品用自封袋包裹帶回實驗室, 室內風干后用于測定土壤全碳、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、pH值。

1.4 土壤理化性質測定

土壤理化性質測定參照第三版《土壤農化分析》。土壤全氮、全碳使用元素分析儀(ECS4024, Costech, Italy)測定; 土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮測定用2 mol·L-1KCl溶液浸提土樣, 于室溫下振蕩、過濾后得到浸提液, 一部分直接用紫外分光光度計測定土壤NO3-, 另一部分采用靛酚藍比色法測定土壤NH4+。pH采用電位法(水: 土=2.5:1)測定。

1.5 土壤DNA提取與PCR擴增

稱取0.25 g超低溫保存的土壤樣品, 采用DNA試劑盒(MO BIO Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA)提取土壤DNA。提取的總DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, DNA的濃度和純度(A260-280)用NanoDrop ND-1000UVevis分光光度計檢測(ThermoScientific, Rockwood, TN, USA)。氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細菌(AOB)的基因的PCR引物分別為Arch-amoAF (5’-STAATGGTCTGG CTTAGACG-3’) / Arch-amoAR (5’-GCGGCCAT CCATCTGTATGT-3’)[20]和b-amoA-1F (5’-GGGG TTTCTACTGGTGGT-3’) / amoA-2R (5’-CCCCT CKGSAAAGCCTTCTTC-3’ )[21]。每個樣本3個重復,將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, 使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物, Tris-HCl洗脫; 2%瓊脂糖電泳檢測; QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量。PCR反應體系為20 μL, 包括2×sybr MIX(with ROX) 10 μL, 0.2 μL的兩種上、下游引物(10 μmol·L-1), 1 μL稀釋8倍后的樣品, 用RNase-Free ddH2O補足至20 μL。程序設置: 95 ℃5 min; 94 ℃30 s, 51 ℃30 s, 72 ℃50 s, 72 ℃10 min, 共35個循環(huán), 瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.6 Illumina Miseq高通量測序

PCR產物回收后測定其濃度, 之后按照每個樣本的測序量要求, 進行相應比例的混合, 使各處理用于測序的樣品DNA濃度保持一致, 雙末端測序采用Illumina Miseq測序平臺進行, 本實驗的測序工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技公司完成。

MiSeq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù), 首先根據(jù)PE reads之間的overlap關系, 將成對的reads拼接(merge)為一條序列, 同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾, 根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列, 并校正序列方向, 即為優(yōu)化數(shù)據(jù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。使用美吉生物云平臺完成微生物多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 不同類型秸稈還田對稻田土壤理化性質的影響

在水稻抽穗期0—15 cm土層中(表1), 相比NS處理, 秸稈還田(RS和BS)處理降低了土壤全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量, 提高了土壤全碳和碳氮比, 差異不顯著。其中RS處理的土壤全氮、全碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮均高于BS處理, 而土壤pH值和碳氮比低于BS處理, 差異不顯著。

表1 不同類型秸稈還田處理下稻田土壤理化性質

注: NS、RS和BS分別表示單施化肥、油菜秸稈+單施化肥和蠶豆秸稈+單施化肥處理。數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示各處理在5%水平差異顯著。下同。

2.2 AOA和AOB群落核心物種分析

核心物種, 即共有物種, 是所有樣本共有物種數(shù)目。根據(jù)核心物種曲線是否達到平緩, 可以評估本次測序樣品量是否足夠。由圖1可知, 隨著樣本數(shù)量的增加, AOA(圖1a)和AOB(圖1b)在OTU水平的核心物種曲線趨于平緩。結果表明, 本研究測序樣品量足以反映土壤樣品AOA和AOB基因微生物信息。

2.3 AOA和AOB群落Alpha多樣性分析

AOA和AOB群落Alpha多樣性指數(shù)的單因素方差分析結果顯示(表1), 3個處理之間AOA群落Alpha多樣性指數(shù)沒有明顯變化。而各處理AOB群落的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Sobs指數(shù)均表現(xiàn)為RS>BS>NS。結果表明, 不同類型秸稈還田對AOB群落多樣性的影響強于AOA。對于AOB群落, 相比單施化肥, 秸稈還田(油菜和蠶豆秸稈)提高了其多樣性。其中, 油菜秸稈還田的多樣性高于蠶豆秸稈還田。

圖1 AOA(a)和AOB(b)群落OTU水平核心物種數(shù)目

Figure 1 Numbers of shared OTU of AOA(a) and AOB(b) community

注: AOA和AOB分別表示氨氧化古菌和氨氧化細菌。下同。

表2 AOA和AOB群落Alpha多樣性指數(shù)

注: 數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示各處理在5%水平差異顯著。

2.4 AOA和AOB群落物種組成Veen分析

對AOA(圖2a)和AOB(圖2b)基因序列進行OTU水平Veen分析。3個處理共有39個相同的OTUs, 占AOA基因序列總OTUs的68.42%。相比NS處理, 秸稈還田(RS和BS)處理新出現(xiàn)9個OTUs, 占總OTUs的15.79%。其中RS處理獨有5個OTUs, 占總OTUs的8.77%; BS處理獨有3個OTUs, 占總OTUs的5.26%。

相比AOA , 不同類型秸稈還田條件下AOB基因序列OTUs分布差異較大。3個處理共有55個相同的OTUs, 占AOB基因序列總OTUs的8.79%。相比NS, 秸稈還田處理新出現(xiàn)397個OTUs, 占總OTUs的63.42%。其中RS處理獨有228個OTUs, 占總OTUs的36.42%; BS處理獨有131個OTUs, 占總OTUs的20.93%。結果表明, 相比AOA, 不同類型秸稈還田對AOB基因序列OTU數(shù)目和分布的影響較大, 但對AOB基因共有OTU數(shù)目的影響較小。相比單施化肥, 秸稈還田改變了AOA和AOB基因序列的OTU數(shù)目和分布, 增加了OTU水平的組成類群, 其中油菜秸稈還田對OTU分布的影響強于蠶豆秸稈還田。

圖2 AOA(a)和AOB(b) amoA基因序列OTU水平Veen圖

Figure 2 Veen drawing of AOA (a) and AOB (b)gene on OTU level

2.5 AOA和AOB在綱水平上群落組成分析

Heatmap圖可使高豐度和低豐度的物種分塊聚集, 通過顏色變化來反映不同分組在各分類學水平上群落組成的相似性和差異性。綱水平上, AOA(圖3a)群落共由6個物種組成, 其中, environmental_ samples_p__Thaumarchaeota和unclassified_k__no-rank_d__Archaea為兩個主要優(yōu)勢類群, 分別占AOA基因總序列的49.48%-51.76%和37.79%- 41.12%。NS、RS和BS處理中6個物種的相對豐度均沒有顯著差異(p>0.05)。

相比AOA, 不同類型秸稈還田對AOB群落結構的影響較大。綱水平上, AOB(圖3b)群落共由6個物種組成, 其中,-變形菌綱(Betaproteobacteria)為主要優(yōu)勢類群, 占AOB基因總序列的95.20%—96.53%。處理RS中unclassified_p__ Proteobacteria的相對豐度比NS高2倍(<0.05), 比BS高1.45倍(>0.05)。NS、RS、BS處理中norank_p__ ammonia- oxidizing_bactera_ensemble的平均相對豐度分別是0.13%、0.02%、0。結果表明, 各處理之間AOA群落組成極為相似, 沒有顯著差異。但相比AOA, 各處理之間AOB群落組成差異較大。相比單施化肥, 油菜秸稈還田顯著提高了AOB群落unclassified_ p__Proteobacteria的相對豐度, 減少了ammonia- oxidizing_bactera_ensemble的相對豐度; 而蠶豆秸稈還田缺失ammonia-oxidizing_bactera_ ensemble。

Figure 3 Heatmap of AOA (a) and AOB (b) community on class level

3 討論

不同類型秸稈還田對AOB群落Alpha多樣性指數(shù)的影響強于AOA。相比單施化肥, 秸稈還田(油菜、蠶豆秸稈)增加了土壤全碳含量, 提高了AOB群落的Alpha多樣性指數(shù)。這與黃容等[14]部分研究結果一致。Sessitsch等[22]研究也發(fā)現(xiàn)土壤全碳含量越高, 微生物多樣性越高。但本研究各處理之間的土壤理化性質、多樣性指數(shù)的方差分析結果均無顯著差異, 其原因可能是本試驗年限短, 秸稈還田條件下土壤環(huán)境因子及其對土壤微生物多樣性的影響有限。

Veen分析結果顯示, 相比AOA, 秸稈還田對AOB基因序列OTU數(shù)目和分布的影響較大。這與堿性條件下土壤硝化作用主要由AOB主導的研究相一致[23-24]。且與單施化肥相比, 秸稈還田對AOA群落結構沒有明顯影響, 但顯著改變了AOB群落結構, 這進一步證實了上述研究結果。研究表明, 在高pH、高濃度NH3土壤中, AOB比AOA具有更強的適應能力[25]。Prosser等[26]研究表明, 有機無機肥配施會增加土壤NH3含量, 且本試驗土壤呈堿性。因此, 本研究AOB對秸稈還田的響應強于AOA。秸稈還田為土壤微生物提供了大量的碳源和能源, 但不同類型秸稈與養(yǎng)分釋放、微生物活性之間存在密切關聯(lián)[27]。因此, 不同類型秸稈還田對AOB群落組成的影響存在差異。相比蠶豆秸稈, 油菜秸稈還田能夠釋放更多的有機碳, 土壤微生物利用碳源的能力更強[28-29], 導致AOB群落微生物多樣性增加, 群落結構顯著變化。

對于AOB群落, 秸稈還田處理的ammonia- oxidizing_bactera_ensemble的相對豐度均低于單施化肥處理。這與楊亞東等[30]研究結果一致, 即相比單施化肥, 有機肥配施化肥能夠降低硝化微生物ammonia-oxidizing_bactera_ensemble的相對豐度。蠶豆秸稈還田中缺失這一物種, 其原因可能是蠶豆作為豆科固氮作物, 提供的土壤氮素以一種更穩(wěn)定的形式釋放, 從而減少速效NH4+-N[31], 導致硝化微生物活性減弱。這與Paungfoo-Lonhienne等[32]研究結果一致, 即豆科作物能夠抑制硝化微生物的作用, 減弱硝化強度。綜上所述, 相比單施化肥, 秸稈還田具有抑制硝化微生物ammonia-oxidizing_bactera_ ensemble的作用, 從而減弱硝化強度。但蠶豆秸稈還田對這一微生物的影響強于油菜秸稈還田, 更具有減弱硝化強度的潛勢。

4 結論

不同類型秸稈還田對AOB群落Alpha多樣性指數(shù)的影響強于AOA。相比單施化肥, 秸稈還田(油菜和蠶豆秸稈)提高了AOB群落多樣性指數(shù), 其中油菜秸稈還田的多樣性指數(shù)高于蠶豆秸稈還田。相比AOA, 秸稈還田對AOB基因序列OTU數(shù)目和分布的影響較大, 其中油菜秸稈還田對OTU分布的影響強于蠶豆秸稈還田。綱水平上, 不同處理之間AOA群落組成沒有顯著差異。但對于AOB群落, 相比單施化肥, 油菜秸稈還田顯著提高了unclassified_ p__Proteobacteria的相對豐度, 減少了ammonia- oxidizing_bactera_ensemble的相對豐度; 而蠶豆秸稈還田缺失ammonia-oxidizing_bactera_ensemble。綜上, 堿性潮土中AOB對不同類型秸稈還田的響應強于AOA, 是硝化作用的主要推動者。相比蠶豆秸稈還田, 油菜秸稈還田對AOB群落結構的影響更大。

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Effects of different types of straw returning on microbial community structure of ammonia oxidizers in paddy soil

GAO Zhenzhen1, WANG Rong2, GONG Songling1, ZHU Rong1, LIU Zhangyong1, JIN Tao1, *

1. College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China 2.Huanggang Academy of Agricultural Sciences, Huanggang, Hubei 438000, China

The purpose of this study was to investigate the effects of rape and broad bean straw returning on microbial community structure of ammonia oxidizers in paddy soil. Based on the alkaline soil of Jianghan Plainas the research object, the Illumina Miseq high-throughput sequencing platform was used to study the effects of different types of straw returning on the community diversity and structure of ammonia oxidizing archaea(AOA)and the ammonia oxidizing bacteria(AOB). Three treatments were compared, including conventional fertilization (NS), conventional fertilization plus rape straw (RS) and conventional fertilization plus broad bean straw (BS). The results showed that the effect of different types of straw returning on the Alpha diversity index of AOB community was stronger than that of AOA. For AOB community, compared with NS, straw returning (RS and BS) improved its diversity index, in which the diversity index of RS was higher than that of BS. Veen analysis showed that compared with AOA, the number and distribution of OTU in AOBgene sequence were significantly affected by different types of straw returning, in which the effect of RS was stronger than that of BS on OTU distribution. Different types of straw returning had no significant effect on the species composition and relative abundance of AOA community on class level (>0.05). While in AOB community, the relative abundance of unclassified_p__ Proteobacteria of RS was 2 times higher than that of NS (<0.05) and 1.45 times higher than that of BS (>0.05). Compared with NS, RS reduced the relative abundance of norank_p__ammonia-oxidizing_bactera_ensemble, BS missed this species. In conclusion, the response of AOB to different types of straw returning was stronger than that of AOA. Compared with BS, RS had a stronger effect on the microbial community structure of AOB.

rape straw; road bean straw; ammonia oxidizing archaea; ammonia oxidizing bacteria

10.14108/j.cnki.1008-8873.2020.04.009

高珍珍, 王蓉, 龔松玲, 等. 不同類型秸稈還田對稻田土壤氨氧化微生物群落結構的影響[J]. 生態(tài)科學, 2020, 39(4): 66–73.

GAO Zhenzhen, WANG Rong, GONG Songling, et al. Effects of different types of straw returning on microbial community structure of ammonia oxidizers in paddy soil[J]. Ecological Science, 2020, 39(4): 66–73.

S154

A

1008-8873(2020)04-066-08

2019-11-14;

2019-12-12

國家重點研發(fā)計劃(2017YFD0800102; 2017YFD0301400)

高珍珍(1996—), 女, 山西呂梁人, 碩士研究生, 主要從事農業(yè)生態(tài)和土壤氮素循環(huán)研究, E-mail: 2274658281@qq.com

金濤, 男, 講師, 主要從事農業(yè)生態(tài)與土壤氮循環(huán)研究, E-mail:jintao@yangtzeu.edu.cn