王芳洲, 王友紹, 3, *

Cu2+、Pb2+脅迫對秋茄幼苗可溶性蛋白和抗氧化酶活性的影響

王芳洲1, 2, 王友紹1, 2, 3, *

1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 熱帶海洋環(huán)境國家重點實驗室, 廣州 510301 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 3. 中國科學(xué)院大亞灣海洋生物綜合實驗站, 深圳 518121

為研究重金屬脅迫對秋茄幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響, 砂培紅樹植物秋茄幼苗一個月,研究不同重金屬濃度(Cu2+: 0、3、15、30、45 mg·L–1, Pb2+: 0、1、5、10、15 mg·L–1)和不同實驗時間(0、3、7、14、28 d)對葉片的影響。測量的生理指標(biāo)包括: 可溶性蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD), 實驗條件下兩種重金屬對各項參數(shù)的影響一致。結(jié)果表明: 在特定濃度重金屬處理下(Cu2+: 0、3、15、30、45 mg·L–1, Pb2+: 0、1、5、10、15 mg·L–1), 可溶性蛋白含量隨著時間的增加基本呈先升后降趨勢; SOD活性呈降低趨勢; CAT活性最初受到明顯促進(jìn), 后促進(jìn)作用減弱; POD活性變化規(guī)律并不一致。在相同處理時間下, 可溶性蛋白含量隨Cu2+濃度的增加而降低, 在Pb2+處理下有所波動; SOD活性在各濃度條件下均降低; CAT活性基本呈降低趨勢; POD活性呈先升后降的趨勢。通過Pearson相關(guān)性分析和PCA分析表明, 可溶性蛋白含量與SOD、POD、CAT三種酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系, 相關(guān)系數(shù)分別為–0.401, –0.722, –0.521; 而SOD、POD和CAT活性則表現(xiàn)為顯著正相關(guān)關(guān)系, SOD與POD的相關(guān)系數(shù)為0.359, SOD與CAT的相關(guān)系數(shù)為0.384, POD與CAT的相關(guān)系數(shù)為0.485, 說明三種抗氧化酶協(xié)同作用形成一條抗氧化鏈抵御重金屬脅迫。

秋茄; Cu脅迫; Pb脅迫; SOD; POD; CAT

0 前言

隨著工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展, 以及人類日常活動的影響, 造成大量污染物排放至各水域, 最終隨地表徑流匯入海洋, 對沿岸和海洋環(huán)境造成嚴(yán)重污染[1-2]。其中, 重金屬污染作為一種全球典型的污染類型, 無法通過生物降解, 具有持續(xù)性、積聚性等特征, 因此受到廣泛關(guān)注[3-4]。紅樹林作為生長在熱帶、亞熱帶潮間帶的典型濱海濕地生態(tài)系統(tǒng), 對環(huán)境具有獨特的適應(yīng)性。紅樹植物對重金屬污染具有較強(qiáng)的耐受性, 是重金屬污染的源和匯[5-6]。以往的研究主要關(guān)注紅樹植物對溫度、鹽度、水淹以及某些重金屬等因素長期脅迫下的生理生態(tài)反應(yīng)[7-8]。對紅樹植物重金屬脅迫的研究中可發(fā)現(xiàn), 紅樹林底泥重金屬含量主要表現(xiàn)為:Fe >Mn > Zn > Cu, Pb >Ni> Cd[9-10]。當(dāng)Cu達(dá)到一定濃度時, 會降低植物生物量, 甚至阻礙植物萌發(fā)[11]。Pb濃度在一定范圍內(nèi)會對植物生長和代謝產(chǎn)生不利影響[12-13]。紅樹林植物已經(jīng)進(jìn)化出一系列對重金屬積累做出反應(yīng)的機(jī)制。主要的防御機(jī)制之一是抗氧化防御系統(tǒng)。重金屬脅迫可產(chǎn)生大量的活性氧(ROS), 如超氧自由基(O2?·)、單線態(tài)氧(1O2)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(OH·)等, 可破壞主要的生物大分子蛋白和核酸, 引起膜脂過氧化。植物體內(nèi)的各種抗氧化防御系統(tǒng)可以清除活性氧自由基, 保護(hù)細(xì)胞免受損傷。主要的抗氧化酶有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)[6][16]。SOD作為細(xì)胞對抗ROS的第一道防線, 可以將超氧自由基分解為H2O2和O2, CAT和POD可以將H2O2進(jìn)一步分解成H2O和O2, 三種抗氧化酶協(xié)同作用形成一條抗氧化鏈抵御重金屬脅迫[17-18]。在對秋茄葉片抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)的研究中發(fā)現(xiàn), 在Cd、Pb、Hg脅迫下, 秋茄葉片中GSH含量顯著增加, 表明秋茄的重金屬耐受性可能與抗氧化劑GSH的作用有關(guān)[19]。另有對秋茄幼苗抗氧化酶類的研究發(fā)現(xiàn), 用人工復(fù)合重金屬溶液處理秋茄幼苗60 d, SOD和POD活性隨著污染級別的增加呈先升后降的變化, CAT活性在葉片中不受污染程度的影響, 相對平穩(wěn), 但在高濃度的復(fù)合重金屬污染下, 活性有下降的趨勢; 此外分析還表明, 秋茄幼苗在遭受重金屬脅迫時, 根系比葉更能有效地清除組織中的活性氧自由基, 保護(hù)了根的生長, 從而提高了抗重金屬的能力[20]。本研究的目的是闡明常見紅樹植物秋茄的幼苗在不同濃度Cu, Pb脅迫初期, 不同處理時間的生化反應(yīng), 包括可溶性蛋白含量的變化和各種抗氧化酶活性的變化。不同于前人研究中秋茄幼苗長期重金屬脅迫下的生理特征的變化, 本研究主要探究重金屬脅迫處理下秋茄幼苗28 d, 內(nèi)各項生理指標(biāo)的變化, 旨在闡明秋茄幼苗在重金屬脅迫初期的應(yīng)激反應(yīng)狀況。所得結(jié)果有助于更好地了解重金屬脅迫下紅樹林植物在受污染水體中抗氧化脅迫系統(tǒng)的生理生化變化, 為紅樹林的保護(hù)修復(fù)和進(jìn)一步的發(fā)展提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗所用的秋茄胚軸均采自廣東省惠州市, 從中選取長度、大小相似的個體, 經(jīng)過 0.1%高錳酸鉀溶液處理15 min 后再用清水沖洗, 使用經(jīng)自來水洗凈并晾干的海砂進(jìn)行育苗。在胚軸培育的過程中, 保證充足的陽光供給, 每天早晚各用自來水澆灌一次, 每三天用1/2 Hoagland營養(yǎng)液澆灌一次以補充養(yǎng)分。培育至第三對葉完全展開后, 進(jìn)行取材。

1.2 實驗方法

從實驗材料中選擇大小長勢一致、沒有機(jī)械損傷和病蟲侵害的個體, 分成5組, 每組設(shè)置三個平行組, 每個平行組10株幼苗。將各組幼苗移植到經(jīng)自來水洗凈并晾干的海砂盆中, 放入人工氣候箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件設(shè)置如下: 溫度25 (± 1) ℃, 相對濕度75 (± 5) %, 光照周期12 h·d?1, 光照強(qiáng)度370μmol m?2s?1。每三天用含不同濃度CuSO4或PbCl2溶液的1/2 Hoagland營養(yǎng)液澆灌植株, 每次每盆澆灌營養(yǎng)液500 mL。分別于第3天、第7天、第14天和第28天進(jìn)行取樣。第3天進(jìn)行取樣實驗旨在觀測脅迫初期秋茄幼苗葉片的生理變化, 第7天、第14天和第28天取樣時間設(shè)定旨在探究呈倍數(shù)增長的脅迫時間與生理指標(biāo)變化的關(guān)系。具體取樣操作如下:

(1)使用裝有雙蒸水的洗瓶清洗長勢良好的葉片, 并用紙巾擦拭水分, 整個過程防止手觸碰葉片。

(2)用已消毒滅菌的剪刀剪下葉片, 進(jìn)行稱量后錫紙包好, 裝入密封袋, 放入冰盒暫時保存, 所有樣品取樣完成后放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

參照相關(guān)研究[20], 不同重金屬溶液濃度見表1。

1.2.1 可溶性蛋白的測定

可溶性蛋白的測定方法參照Bradford的考馬斯亮藍(lán)染色法[21]。利用牛血清蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 求出吸光度值()依蛋白濃度()而改變的回歸方程式。稱取0.5 g植物葉片于研缽中, 加入石英砂和少許聚乙烯吡咯烷酮(PVP), 用10 mL蛋白提取液迅速研磨成勻漿并轉(zhuǎn)移至離心管中, 10000 rpm, 4 ℃離心20 min, 上清液即為可溶性蛋白提取液。取0.01 mL上清, 加入0.09 mL Tris緩沖液(空白管為0.10 mL Tris緩沖液), 再向各管分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液, 搖勻并待其反應(yīng)2 min后, 在595 nm波長處比色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算樣品中可溶性蛋白的濃度。

表1 1/2 Hoagland 營養(yǎng)液中所含重金屬濃度

1.2.2 SOD的測定

參考黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性, 比色時測定管的吸光度值低于空白管的吸光度值, 通過公式計算可求出被測樣品中SOD?的活力[22]。

1.2.3 CAT的測定

過氧化氫酶(CAT)分解H2O2的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨迅速中止, 剩余H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物, 在405 nm處測定其生成量, 可計算出CAT的活力[23]。

1.2.4 POD的測定

利用過氧化物酶(POD)催化過氧化氫反應(yīng)的原理, 通過測定420 nm處吸光度的變化得出其酶活性[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在所有實驗中, 測量了每個實驗組中三個平行組所取樣品的各項指標(biāo), 結(jié)果以三個平行組樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)表示。使用SPSS(version 23)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析, 并利用主成分分析(PCA)將具有一定相關(guān)性的指標(biāo)重新組合成一組新的無關(guān)綜合指標(biāo), 降低所研究指標(biāo)數(shù)據(jù)的維數(shù), 根據(jù)主成分得分, 繪出實驗指標(biāo)在二維平面上的分布狀況, 由圖形直觀反映變量之間的關(guān)系[25]。

2 實驗結(jié)果

2.1 對可溶性蛋白含量的影響

如圖1所示, 30 mg·L–1CuSO4營養(yǎng)鹽溶液澆灌28 d, 5 mg·L–1PbCl2澆灌3 d, 10 mg·L–1PbCl2澆灌28 d時的秋茄葉片可溶性蛋白含量與對照組無顯著差異(>0.05),其余組可溶性蛋白含量均與對照組存在顯著性差異(<0.05)。

注: *表示與對照相比存在顯著差異(P<0.05), 橫坐標(biāo)分組對應(yīng)表1。

Figure 1 Effect of Cu, Pb stress on soluble protein content inleaves

在含3 mg·L–1CuSO4營養(yǎng)鹽溶液處理下, 前14天可溶性蛋白含量均小于對照, 且有上升趨勢, 28 d時可溶性蛋白含量顯著增加, 為對照組的2.492倍。其他組處理下的可溶性蛋白含量都表現(xiàn)出先升后降的變化。其中15 mg·L–1CuSO4處理14 d時, 可溶性蛋白含量均達(dá)到峰值, 為對照組的2.646倍。15 mg·L–1PbCl2處理7 d時, 可溶性蛋白含量均達(dá)到峰值, 為對照組的3.020倍。

而在相同處理時間下, 可溶性蛋白含量在各濃度重金屬處理3 d后與對照相比變化不大。處理7 d時可溶性蛋白含量隨CuSO4濃度升高而升高, 在PbCl2處理7 d時, 蛋白含量顯著升高且呈現(xiàn)升降升的波動趨勢。處理14 d時, 可溶性蛋白含量隨CuSO4濃度升高呈先升后降的趨勢, 隨PbCl2濃度升高呈現(xiàn)先降后升的趨勢。28 d時可溶性蛋白含量隨CuSO4濃度升高而降低, 而在PbCl2處理下, 隨濃度增加呈現(xiàn)升降升的波動趨勢。

2.2 對SOD活性的影響

如圖2所示, 實驗各組總SOD活性與對照組相比均存在顯著性差異(<0.05)。

特定濃度下, 隨著處理時間的增加, 各實驗組總SOD活性總體均呈現(xiàn)下降趨勢, 其中各濃度CuSO4和1 mg·L–1PbCl2處理14 d后, 15 mg·L–1PbCl2處理28 d后, 秋茄葉片總SOD活性略有回升, 但仍低于對照組。30 mg·L–1CuSO4處理3 d時總SOD活性達(dá)到Cu處理組的最大值, 為對照組的1.168倍。10 mg·L–1PbCl2處理3 d時總SOD活性達(dá)到Pb處理組的最大值, 為對照組的1.062倍。

在為期3 d的脅迫處理過程中, 總SOD活性隨CuSO4和PbCl2濃度增加均總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢, 且分別在30 mg·L–1CuSO4和10 mg·L–1PbCl2處理時活性達(dá)峰值。7 d處理時間后CuSO4處理組穩(wěn)定在18U·(g)–1左右; PbCl2處理組總SOD活性先升后降, 在濃度為5 mg·L–1時達(dá)峰值。14 d處理時間后, CuSO4組在脅迫濃度小于30 mg·L–1時總SOD活性穩(wěn)定在22U·(g)–1左右, 濃度為45 mg·L–1時總SOD活性略有回升; 而PbCl2組在脅迫濃度小于10 mg·L–1時總SOD活性穩(wěn)定在27U·(g)–1左右, 15 mg·L–1PbCl2處理時總SOD活性略有下降。28 d處理時間后CuSO4處理組穩(wěn)定在17U·(g)–1左右; PbCl2處理組總SOD活性先降后升。

注: *表示與對照相比存在顯著差異(P<0.05), 橫坐標(biāo)分組對應(yīng)表1。

Figure 2 Effect of Cu, Pb stress on the activity of T-SOD inleaves

2.3 對CAT活性的影響

如圖3所示, 實驗組CAT活性均與對照組呈顯著性差異(<0.05), 且在重金屬處理初期CAT活性相較于對照有顯著升高, 3 mg·L–1CuSO4處理3天時CAT活性達(dá)峰值, 為對照組的15.981倍。5 mg·L–1PbCl2處理3 d時CAT活性達(dá)峰值, 為對照組的6.891倍。

CuSO4實驗組中, 在特定濃度CuSO4處理下, 隨著處理時間的增加, CAT活性顯著下降。PbCl2實驗組中, 1 mg·L–1、10 mg·L–1、15 mg·L–1PbCl2處理時, 隨著處理時間的增加, CAT活性總體都呈下降趨勢; 5 mg·L–1PbCl2處理時, CAT活性在第7天顯著下降, 之后緩慢回升但仍低于3 d時CAT活性。

脅迫處理第3天時CuSO4實驗組CAT活性呈下降趨勢; PbCl2實驗組CAT活性呈先升后降趨勢, 在5 mg·L–1PbCl2處理時為峰值。第7天時CuSO4組CAT活性呈下降趨勢; PbCl2組CAT活性呈降升降的波動變化。第14天時, CuSO4實驗組CAT活性呈下降趨勢并大致穩(wěn)定在24 U·(mg)–1左右; PbCl2實驗組CAT活性呈降升降的波動變化, 且在15 mg·L–1PbCl2處理時CAT活性達(dá)到最低值5.048 U·(mg)–1, 低于對照組。第28天時, CuSO4實驗組CAT活性呈緩慢下降趨勢; PbCl2實驗組CAT活性呈先升后降趨勢, 在10 mg·L–1PbCl2處理時達(dá)峰值。

注: *表示與對照相比存在顯著差異(P<0.05), 橫坐標(biāo)分組對應(yīng)表1。

Figure 3 Effect of Cu, Pb stress on the activity of CAT inleaves

2.4 對POD活性的影響

如圖4所示, 各實驗組均與對照組POD活性存在顯著差異(<0.05), POD活性在30 mg·L–1CuSO4和10 mg·L–1PbCl2處理第28天時達(dá)到峰值, 分別為對照組的1.735倍和1.662倍。

在特定濃度重金屬處理下, 隨著處理時間的增長, 3 mg·L–1CuSO4實驗組POD活性呈先升后降的趨勢, 且在處理第7天達(dá)峰值; 15 mg·L–1CuSO4實驗組POD活性在第14天出現(xiàn)明顯下降, 其他時間點都大致維持在2000U·(mg)–1左右; 30 mg·L–1CuSO4實驗組POD活性呈先降后升趨勢, 在第28天時POD活性出現(xiàn)明顯升高; 45 mg·L–1CuSO4實驗組POD活性在第3天后明顯下降且趨于穩(wěn)定。1 mg·L–1和5 mg·L–1PbCl2實驗組POD活性隨時間增加均呈降低趨勢; 10 mg·L–1PbCl2實驗組POD活性在第7天降至最低后顯著回升; 15 mg·L–1PbCl2實驗組POD活性第7天降至最低, 14 d稍有升高, 第28天顯著升高。

CuSO4實驗組在脅迫處理第3天時的POD活性在1700—2000 U·(mg)–1范圍內(nèi)平穩(wěn)波動; 第7天POD活性呈下降趨勢; 第14天POD活性在15 mg·L–1CuSO4處理時降到最低, 后平緩回升; 第28天時POD活性隨CuSO4濃度增加呈先升后降趨勢, 在30 mg·L–1CuSO4處理時達(dá)峰值。PbCl2實驗組在脅迫第3天時POD活性隨PbCl2濃度增大先降后升, 5 mg·L–1PbCl2處理時活性最低; 第7天則為先升后降, 5 mg·L–1PbCl2處理時活性最高; 第14天時POD活性為先升后降, 10 mg·L–1PbCl2處理時活性最高; 第28天時POD活性為先升后降, 10 mg·L–1PbCl2處理時活性最高, 且較5 mg·L–1處理時有大幅升高。

注: *表示與對照相比存在顯著差異(P<0.05), 橫坐標(biāo)分組對應(yīng)表1。

Figure 4 Effect of Cu, Pb stress on the activity of POD inleaves

2.5 生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

利用SPSS進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析和主成分分析(PCA)以直觀體現(xiàn)各變量之間的相互關(guān)系。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明(表2), 可溶性蛋白含量與三種酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系, 而SOD、POD和CAT活性則表現(xiàn)為顯著正相關(guān)關(guān)系。在PCA分析圖中可知(圖5), T-SOD、POD、CAT與可溶性蛋白呈負(fù)相關(guān)關(guān)系, 且POD和CAT距離相近, 二者關(guān)系密切。

表2 重金屬脅迫下秋茄葉片中各生理生化指標(biāo)間的相關(guān)性分析

3 討論

重金屬對植物的毒性作用主要是由于重金屬過量引起的氧化應(yīng)激反應(yīng), 導(dǎo)致脂質(zhì)和生物大分子的過氧化, 破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)。SOD、CAT和POD構(gòu)成了一個完整的抗氧化鏈, 形成活性氧清除酶系, 在有效抵御重金屬脅迫方面發(fā)揮著重要作用。在此體系內(nèi), SOD催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng), 生成H2O2和O2, 是植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)和活性氧自由基清除系統(tǒng)的第一道防線。之后H2O2則被CAT和POD催化生成H2O, 進(jìn)一步抵御ROS對植物體產(chǎn)生的傷害[17–18]。

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是未與細(xì)胞膜結(jié)合的參與各種代謝的酶類, 可溶性蛋白質(zhì)含量是一個重要的生理生化指標(biāo), 其含量越高則說明該部位的生理代謝活動越劇烈, 因此可作為植物體總代謝情況的一個重要參考[27]。通過橫向比較特定重金屬濃度、不同脅迫時間的處理結(jié)果, 可發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白含量在初始脅迫階段基本降低, 且處于波動狀態(tài)。隨處理時間增加可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 這與植物在脅迫下的響應(yīng)特性一致[26]。通過在相同脅迫時間下、不同重金屬濃度處理結(jié)果的縱向比較可知, 在脅迫初期, 可溶性蛋白含量在空白對照范圍內(nèi)波動, 對脅迫的響應(yīng)機(jī)制沒有迅速激活。脅迫7 d后, 可溶性蛋白含量隨不同重金屬濃度的增加而增加。14 d后, 蛋白質(zhì)含量下降, 這也與植物對脅迫的反應(yīng)一致。當(dāng)脅迫發(fā)生時, 植物會采取措施提高抗逆性, 以適應(yīng)不利環(huán)境的影響, 但當(dāng)脅迫超過一定限度時, 植物的防御措施會相應(yīng)減弱, 這與白骨壤()、蠟燭果()和雜交狼尾草(×)的相關(guān)研究一致[28–30]。

各指標(biāo)存在顯著差異(P<0.05)

Figure 5 PCA Analysis of physiological indices in the leaves ofunder heavy metal stress.

通過橫向比較特定的重金屬濃度、不同的脅迫時間的處理結(jié)果, 可發(fā)現(xiàn)SOD活性在初期沒有明顯提升且在空白對照范圍內(nèi)波動。7 d后, 各濃度SOD活性均呈下降趨勢。這與前人對秋茄()和木欖()抗氧化酶類應(yīng)對重金屬脅迫的響應(yīng)結(jié)果相一致[26]。通過縱向比較不同的重金屬濃度在相同的處理時間下SOD的活性變化, 可推測實驗用秋茄幼苗SOD對實驗用濃度的重金屬脅迫較為敏感, 各濃度均抑制了秋茄SOD活性。研究發(fā)現(xiàn), 在低濃度Cu污染下, 車軸草()幼苗SOD活性略有提高, 隨著Cu濃度的增加, 活性氧清除系統(tǒng)被破壞, 保護(hù)酶系統(tǒng)失衡, SOD活性明顯降低[31], 與本實驗結(jié)果類似。在重金屬脅迫下植物SOD活性變化主要有兩種情況: 一種是SOD活性隨重金屬濃度的增加而增加; 另一種是SOD活性隨重金屬脅迫濃度的增加先升后降[27]。本實驗結(jié)果基本符合第二種情況。

通過特定重金屬濃度、不同脅迫時間處理結(jié)果的橫向比較, 在最初的脅迫階段植株CAT活性明顯受到促進(jìn), 隨脅迫時間的增長促進(jìn)作用減弱。在已有的研究中也出現(xiàn)類似趨勢, 在特定濃度的重金屬處理中, 大蒜(L)CAT活性隨時間的延長而降低[32]。通過相同脅迫時間、不同重金屬濃度處理的縱向比較, 可得知相同脅迫時間內(nèi), CAT活性隨Cu濃度增長而減弱, 在脅迫28 d時CAT活性隨Cu濃度增長平緩波動, 但仍高于對照。而在Pb處理的縱向比較中, CAT活性隨各時間段內(nèi)金屬濃度的增加處于波動狀態(tài), 但各時間段內(nèi)最高濃度脅迫CAT活性仍低于最低濃度脅迫時的活性, 基本符合隨重金屬脅迫濃度增加活性逐漸受到抑制的特征[26][32]。CAT活性在是嚴(yán)重的各種脅迫處理初期均有一定程度的增加, 可能是低濃度的重金屬脅迫刺激了CAT酶系統(tǒng), 使其抗性增強(qiáng)。但隨著脅迫程度的增強(qiáng), 植物體內(nèi)產(chǎn)生了過量的過氧化物, 超過CAT的能力范圍, 無法及時被清除, 進(jìn)而損害植物體, 導(dǎo)致CAT活性隨之減弱。這種類似的變化趨勢在Ni脅迫下的大羽蘚()實驗中也有發(fā)現(xiàn)[33]。

通過不同重金屬脅迫時間處理的橫向比較, 在3 mg·L–1Cu脅迫階段植株P(guān)OD活性隨時間推移先升后降, Cu濃度增加后POD活性隨時間推移先降后升, 30 mg·L–1組Cu的促進(jìn)作用尤為明顯。在1 mg·L–1和5 mg·L–1Pb脅迫階段植株P(guān)OD活性隨時間推移而降低, Pb濃度增加后POD活性隨時間推移也表現(xiàn)出先降后升趨勢, 10 mg·L–1Pb的促進(jìn)作用較為明顯。通過相同脅迫時間、不同重金屬濃度處理的縱向比較, 可推測, 15 mg·L–1和30 mg·L–1的Cu脅迫在實驗長時間脅迫后促進(jìn)POD活性, 低濃度和高濃度Cu脅迫抑制其活性, 已有研究中Cu在特定濃度下(0, 0.5 mg·L–1)進(jìn)行為期90 d的脅迫, 秋茄根系POD持續(xù)升高, 葉片和根系的SOD、CAT活性呈先升后降趨勢, 與本研究的變化趨勢相似[34]。Pb在長時間脅迫后, 隨濃度的增加, 對POD的促進(jìn)作用減弱。另有學(xué)者研究了Cd脅迫對桐花幼苗葉片POD活性的影響, 結(jié)果表明, Cd濃度大于0.5 μg·L–1時, POD活性減弱, 其變化規(guī)律與本實驗中長時間脅迫下, POD活性隨重金屬濃度升高表現(xiàn)出先升后降的規(guī)律相似[35]。

對重金屬脅迫對任豆(Chun)種子幼苗抗氧化酶活性變化的研究結(jié)果表明: 在低濃度的重金屬脅迫下, 植株的SOD、POD和CAT活性均有不同程度升高,而在高濃度的重金屬脅迫時, 各酶活性則逐漸降低, 酶活性變化趨勢基本與秋茄實驗中的規(guī)律相符合[36]。本實驗中兩種重金屬脅迫對可溶性蛋白含量均有一定的促進(jìn)作用, 但隨脅迫濃度和時間的增長, 蛋白含量均有不同程度的減少, 且可溶性蛋白更耐受Cu脅迫。兩種重金屬脅迫對SOD活性均有不同程度的抑制作用, 且經(jīng)高濃度長時間重金屬脅迫后, 高濃度Pb脅迫組表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐性。兩種重金屬初期脅迫對CAT活性均有不同程度的促進(jìn)作用, 且Cu脅迫的促進(jìn)作用強(qiáng)于Pb, 后隨脅迫強(qiáng)度的增加, CAT活性均表現(xiàn)出不同程度的下降。POD活性在低濃度重金屬脅迫時(Cu: 3 mg·L–1, Pb: 1 mg·L–1, 5 mg·L–1), 隨脅迫時間的增加均呈降低趨勢, 當(dāng)Cu濃度升高至30 mg·L–1, Pb濃度升高至10 mg·L–1和15 mg·L–1時, POD活性隨脅迫時間的增加呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢, 且在脅迫28 d后活性仍大于對照組, 說明在此脅迫強(qiáng)度下POD活性受到促進(jìn)。當(dāng)Cu脅迫濃度升高至45 mg·L–1時, POD活性隨脅迫時間的增加而降低, 說明相對高濃度的Cu脅迫開始抑制POD的活性。

通過Pearson相關(guān)性分析和PCA分析表明, 可溶性蛋白含量與SOD、POD、CAT三種酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系, 相關(guān)系數(shù)分別為-0.401, -0.722, -0.521; 而SOD、POD和CAT活性則表現(xiàn)為顯著正相關(guān)關(guān)系, SOD與POD的相關(guān)系數(shù)為0.359, SOD與CAT的相關(guān)系數(shù)為0.384, POD與CAT的相關(guān)系數(shù)為0.485, 且在PCA分析圖中可進(jìn)一步得知, POD和CAT距離較近, 表現(xiàn)為密切相關(guān), 可推測, 在重金屬脅迫下兩種酶可能產(chǎn)生協(xié)同作用加速促進(jìn)H2O2分解成H2O和O2, 抵抗重金屬脅迫對植物體造成的破壞。

4 結(jié)論

在實驗濃度的Cu、Pb為期28 d的脅迫下秋茄的酶系統(tǒng)沒有完全被破壞。秋茄幼苗可溶性蛋白對兩種重金屬的耐受性為Cu>Pb?？寡趸到y(tǒng)在重金屬耐受和解毒方面發(fā)揮重要作用。在重金屬脅迫早期, 為了保護(hù)植物免受氧化脅迫, 各種抗氧化酶活性有不同程度的提高, 其中CAT的響應(yīng)最強(qiáng)烈。隨著重金屬脅迫強(qiáng)度的增加, 防御體系逐漸被破壞, 可溶性蛋白含量、SOD、CAT和POD活性均表現(xiàn)出不同程度的降低。此外, 基于實驗數(shù)據(jù)和前人研究, 對可溶性蛋白和三種抗氧化酶類進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析和PCA主成分分析。結(jié)果表明: 可溶性蛋白含量與SOD、POD、CAT三種酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系, 相關(guān)系數(shù)分別為–0.401, –0.722, –0.521; 而SOD、POD和CAT活性則表現(xiàn)為顯著正相關(guān)關(guān)系, SOD與POD的相關(guān)系數(shù)為0.359, SOD與CAT的相關(guān)系數(shù)為0.384, POD與CAT的相關(guān)系數(shù)為0.485。可推測, 在重金屬脅迫下POD和CAT可能產(chǎn)生協(xié)同作用, 共同促進(jìn)SOD催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)所生成的H2O2分解成H2O和O2, 三種酶的協(xié)同作用形成較完整的抗氧化鏈,以抵抗重金屬脅迫對氧化系統(tǒng)的損傷。本研究大致了解了兩種常見重金屬對秋茄幼苗初期脅迫的生理影響, 有待進(jìn)一步進(jìn)行分子水平的相應(yīng)研究。

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Effects of Cu2+and Pb2+stresses on soluble protein content and activities of antioxidant enzymes inseedlings

WANG Fangzhou1,2, WANG Youshao1,2,3,*

1. State Key Laboratory of Tropical Oceanography, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China 2. University of China Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3. Daya Bay Marine Biology Research Station, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518121, China

Mangrove seedlings ofwere cultured in sands for one month. The effects on leaves were studied under different concentration of the heavy metal stress(Cu2+: 0, 3, 15, 30, 45 mg·L?1, Pb2+: 0, 1, 5, 10, 15 mg·L?1) and the different experimental times (0, 3, 7, 14, 28 days). The physiological indicators included soluble protein, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD). Under experimental conditions, the efffects of the two heavy metals on parameters were consistent. At the same heavy metal concentration, the results showed as follows: (1) the soluble protein content basically increased first, and then decreased with the increase of the experimental time; (2) the SOD activity showed a decreasing trend, and CAT activity was significantly promoted at first, and then the promotion effect was weakened; (3) the changes of the POD activity were not consistent. At the same treatment time, the soluble protein content decreased with the increase of Cu2+concentration, and fluctuated with the increase of Pb2+concentration. The SOD activity decreased at all concentrations, the CAT activity showed a decreasing trend, the POD activity increased first, and then decreased. The Pearson analysis and PCA analysis showed that soluble protein content had significantly negative correlation with the activity of the SOD, POD, CAT. The correlation coefficients were -0.401, -0.722, -0.521; while SOD, POD and CAT activity had significantly positive correlation. The correlation coefficients between SOD and POD was 0.359,the correlation coefficients between SOD and CAT was 0.384, and the correlation coefficients between CAT and POD was 0.485.This result indicated that these three antioxidant enzymes formed an antioxidant chain to resist the stress of heavy metals.

; Custress;Pd stress; SOD; POD; CAT

10.14108/j.cnki.1008-8873.2020.04.002

王芳洲, 王友紹. Cu2+、Pb2+脅迫對秋茄幼苗可溶性蛋白和抗氧化酶活性的影響[J]. 生態(tài)科學(xué), 2020, 39(4): 10–18.

WANG Fangzhou, WANG Youshao. Effects of Cu2+and Pb2+stresses on soluble protein content and activities of antioxidant enzymes inseedlings[J]. Ecological Science, 2020, 39(4): 10–18.

Q945.78

A

1008-8873(2020)04-010-09

2019-03-29;

2020-01-25

國家自然科學(xué)基金重點項目(U190120017和41876126), 國家重點研發(fā)計劃(國科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專項)(2017FY100700),中國科學(xué)院國際伙伴計劃項目(133244KYSB20180012), 中國科學(xué)院A類戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(XDA13010500、XDA13010503和XDA23050200)

王芳洲(1993—), 女, 山東臨沂人, 碩士, 主要從事紅樹林生態(tài)學(xué)研究

王友紹, 男, 二級教授, 主要從事海洋生態(tài)環(huán)境與生物資源研究, E-mail: yswang@scsio.ac.cn