張小利，張聯(lián)眾，杜學(xué)航

（1.上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海 201401；2.甘肅省白銀市平川區(qū)疾病預(yù)防控制中心，甘肅白銀 730913）

0 引言

肺炎是指終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥，是較為常見的呼吸道系統(tǒng)疾??；臨床治療多以抗生素和抗病毒藥物為主，但是存在耐藥、抗感染等諸多等問題［1］。中醫(yī)認為，肺炎臨床證型以風(fēng)溫閉肺、痰熱奎肺、痰熱結(jié)胸及氣陰兩傷為主［2］。痰熱清注射液是由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹等組成，功能清熱、解毒、化痰，用于治療急性肺炎、急性支氣管炎屬風(fēng)溫肺熱病痰熱阻肺證者［3］。目前痰熱清注射液亦用于治療新型冠狀病毒性肺炎（COVID-19）［4］。為進一步明確痰熱清注射液的安全性，觀察其毒性反應(yīng)癥狀，本實驗就其急性及長期給藥可能產(chǎn)生的毒性反應(yīng)進行觀察，對其安全劑量范圍予以客觀評判。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠160只，雌雄各半，體質(zhì)量78.1～107.8 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，其中40只用于急毒實驗，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2012—0002。大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF級屏障設(shè)施［SYXK（滬）2014—0008］，環(huán)境溫度20～24℃，相對濕度42%～67%，換氣次數(shù)≥15次/h。人工控制照明，晝夜交替時間為12 h/12 h。所有動物實驗嚴格遵守上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的要求。

1.2 藥品與主要試劑

痰熱清注射液，上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)（棕紅色澄明液體，規(guī)格：10 mL/支，含量：0.335 g/mL（生藥量/藥液），批號：1308317），臨用時用氯化鈉注射液稀釋成所需濃度的溶液；痰熱清注射液空白對照液，上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)（無色澄明液體，規(guī)格：10 mL/支，批號：1308317-1），臨用時氯化鈉注射液稀釋成所需濃度的溶液；氯化鈉注射液，上華裕（無錫）制藥有限公司生產(chǎn)（批號：14057402）。

血液生化檢測試劑盒（日本世諾臨床診斷制品株式會社）；離子檢測試劑盒（上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司）；血液學(xué)檢測試劑盒（德國西門子醫(yī)療診斷產(chǎn)品有限公司）；凝血指標測定試劑盒（德國西門子醫(yī)療診斷產(chǎn)品有限公司）；異氟烷，河北九派制藥股份有限公司生產(chǎn)（批號：130101）。上述藥品均密封，避光，置陰涼干燥處保存；試劑均在4℃冰箱保存。

1.3 實驗儀器

BAYER ADVIA 120五分類血球儀（德國拜耳公司）；SYSMEX CA-500全自動血凝分析儀（日本希森美康株式會社）；日立7080全自動生化分析儀（日本日立株式會社）；XD683型電解質(zhì)分析儀（上海迅達公司）；羅氏朱麗亞II型尿液分析儀（德國羅氏診斷有限公司）；YZ11D檢眼鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司）；VIP-5全封閉組織脫水機（日本櫻花檢驗儀器株式會社）；HistoStar石蠟包埋機（賽默飛世爾公司）；HM340E輪轉(zhuǎn)式組織切片機（德國美康公司）；OLYMPUSBH-2光學(xué)顯微鏡、BX51型系統(tǒng)顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；BSA2201-CW精密天平（德國賽多利斯公司）；AR2130電子天平（美國奧豪斯公司）。

2 方法

2.1 急性毒性（急毒）實驗

取檢疫合格的Wistar大鼠40只，按體質(zhì)量分層隨機分為2組，即對照組及給藥組，每組20只，雌雄各半。給藥組大鼠按最大給藥容量（20 mL/kg）尾靜脈注射痰熱清原液，對照組給予等容量痰熱清注射液空白對照液，給藥1次，恢復(fù)14 d。觀察大鼠的一般體征、行為運動和死亡等情況，給藥后4 h內(nèi)嚴密觀察。15 d時解剖觀察心、肝、脾、肺和腎等主要臟器的顏色、形狀和大小，如有異常則采集進行組織病理學(xué)檢查。

2.2 3個月長期毒性（長毒）實驗

取檢疫合格的Wistar大鼠120只，按體質(zhì)量分層隨機分為4組，每組30只，雌雄各半，即痰熱清注射液低劑量（1∶7稀釋，給藥容量20 mL/kg，相當于2.50 mL/kg痰熱清注射液原液）組、中劑量（1∶4稀釋，給藥容量20 mL/kg，相當于4.00 mL/kg痰熱清注射液原液）組、高劑量（1∶2稀釋，給藥容量20 mL/kg，相當于6.67 mL/kg痰熱清注射液原液）及對照（1∶4稀釋，給藥容量20 mL/kg，相當于4.00 mL/kg空白對照原液）組。采用尾靜脈注射給藥方式，連續(xù)給藥13周，停藥恢復(fù)4周。于給藥第13周和17周（恢復(fù)4周），每組分別取20只、10只大鼠進行解剖，雌雄各半，進行血液學(xué)、血凝、血清生化及組織病理學(xué)檢測。

2.2.1 一般癥狀

給藥期和停藥后恢復(fù)期，每天觀察1次外觀、體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、皮毛、糞、尿等，每周稱體質(zhì)量和攝食量1次，發(fā)現(xiàn)死亡或瀕死動物及時尸檢。

2.2.2 血液學(xué)檢測

白細胞計數(shù)（WBC）、紅細胞計數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞容積（HCT）、平均紅細胞容積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計數(shù)（PLT）、網(wǎng)織紅細胞百分率（RETIC）、中性粒細胞百分率（NEUT%）、淋巴細胞百分率（LYMPH%）、單核細胞百分率（MONO%）、嗜酸細胞百分率（EOS%）、嗜堿細胞百分率（BASO%）。胸骨取骨髓涂片，甲醛固定。

2.2.3 血液生化檢測

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT，連續(xù)監(jiān)測法）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST，連續(xù)監(jiān)測法）、總蛋白（TP，雙縮脲法）、白蛋白（ALB，溴甲酚緑法）、總膽紅素（TBIL，釩酸氧化法）、直接膽紅素（DBIL）、堿性磷酸酶（ALP，連續(xù)監(jiān)測法）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT，速率法）、血糖（GLU，葡萄糖脫氫酶法）、尿素氮（BUN，紫外法）、肌酐（CREAT，酶法）、總膽固醇（CHOLT，酶法）、甘油三脂（TG，酶法）、肌酸激酶（CK，酶反應(yīng)動力學(xué)法），鈉、鉀、氯離子。

2.2.4 凝血指標檢測

凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）、纖維蛋白酶原（FIB）。

2.2.5 系統(tǒng)尸檢和病理組織學(xué)檢查

取各組大鼠腦、垂體、脊髓（頸、胸、腰段）、胸腺、甲狀腺、唾液腺、食管、胃、大腸和小腸、肝、脾、腎上腺、腎、淋巴結(jié)（食管淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié))、胰腺、氣管、肺、心、主動脈、膀胱、坐骨神經(jīng)、胸骨，雄性動物睪丸、附睪、前列腺或雌性動物乳腺、子宮、卵巢及尸檢時肉眼發(fā)現(xiàn)的可疑臟器，放入10%福爾馬林固定，HE染色。高劑量組和對照組的器官和組織進行組織病理學(xué)檢查，如果高劑量組出現(xiàn)組織病理學(xué)變化時，那么低劑量組也應(yīng)進行組織病理學(xué)檢查以確定劑量-反應(yīng)關(guān)系。其中取材后需稱定質(zhì)量的器官：腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪或子宮、卵巢。計算主要臟器臟器系數(shù)、臟腦比值（g/100 g體質(zhì)量）。

2.3 統(tǒng)計方法

本試驗所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0軟件統(tǒng)計，所有計量數(shù)據(jù)的結(jié)果均使用平均值±標準偏差（x±s）表示。計量資料比較采用方差分析，若方差齊，則進行單因素方差分析（ANOVA）；若有顯著性差別（P≤0.05），則各劑量組與對照組間做Dunnet檢驗；若方差不齊，則進行非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis檢驗）；若K-W檢驗有統(tǒng)計學(xué)差異（P≤0.05），則各劑量組與對照組間做Mann-Whitney U檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 急性毒性（急毒）實驗

大鼠在給予痰熱清注射液或痰熱清注射液空白對照液后30 min內(nèi)，兩組大鼠均可見活動減少。在隨后的觀察期內(nèi)，兩組大鼠均未見異常反應(yīng)，大鼠活動、精神狀況良好，大、小便如常。試驗結(jié)束時動物進行大體解剖，肉眼觀察心臟、肺臟、腎臟、肝臟、脾臟、胃腸道等內(nèi)臟，兩組大鼠均無異常，未發(fā)現(xiàn)有出血點、水腫等情況。15 d內(nèi)各組大鼠無一死亡。

3.2 3個月長期毒性（長毒）實驗

3.2.1 一般癥狀

大鼠給藥3個月及恢復(fù)期內(nèi)，無大鼠死亡。高劑量組1只雄性大鼠（動物編號：4006）在給藥第56日觀察到右后肢踝關(guān)節(jié)以下部分水腫，持續(xù)6 d后恢復(fù)；對照組1只雄性大鼠（動物編號：1010）在給藥第49日觀察到雙側(cè)后肢踝關(guān)節(jié)以下部分水腫，持續(xù)9 d后恢復(fù)；其余對照組和各給藥組大鼠精神狀態(tài)良好，行為活動、呼吸正常，唾液腺、淚腺等腺體未見有異常分泌，皮毛光滑，糞便和尿液也未見異常。

3.2.2 體質(zhì)量和食耗量

給藥3個月及恢復(fù)期末，各給藥組體重與對照組比較均無顯著性差異（P>0.05）。與同期對照組比較，雄性高劑量組在第6周攝食量顯著偏低（P<0.05），下降約2.9%；雌性中劑量組分別在第6，10，13周攝食量顯著低于對照組（P<0.05），分別下降約11.2%，7.5%，10.8%；高劑量組分別在第3，6，10，12，13周攝食量顯著或極顯著低于對照組（P<0.05），分別下降約8.2%，15.0%，7.0%，6.7%，10.3%；其余大鼠攝食量均無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果如圖1—2所示。

圖1 大鼠尾靜脈注射痰熱清注射液3個月大鼠體質(zhì)量的經(jīng)時變化

圖2 大鼠尾靜脈注射痰熱清注射液3個月大鼠食耗量的經(jīng)時變化

表1 大鼠尾靜脈注射痰熱清注射液3個月對長毒實驗大鼠血液學(xué)指標的影響(±s)

表1 大鼠尾靜脈注射痰熱清注射液3個月對長毒實驗大鼠血液學(xué)指標的影響(±s)

注：1.3個月給藥期末n=10，恢復(fù)期末n=5；2.與對照組比較*P<0.05。

試驗周期組別恢復(fù)期末3個月給藥期末對照組低劑量組中劑量組高劑量組對照組低劑量組中劑量組高劑量組雌鼠Baso%0.1±0.1 0.1±0.1 0.1±0.1 0.1±0.1 0.1±0.0 0.1±0.1 0.1±0.0 0.1±0.0雄鼠Baso%0.2±0.1 0.1±0.1 0.1±0.1*0.1±0.0 0.0±0.0 0.1±0.0*0.0±0.1 0.0±0.0

3.2.3 眼科檢查

給藥3個月及恢復(fù)期末各組動物眼科檢查未見與藥物相關(guān)改變。

3.2.4 血液學(xué)指標

給藥3個月，與對照組相比，雄性大鼠Baso%中劑量組偏低（P<0.05），其余劑量組各項血液學(xué)檢測指標，均無顯著性差異（P>0.05）；雌性大鼠各劑量組各項血液學(xué)檢測指標，均無顯著性差異（P>0.05）?；謴?fù)期末，與對照組相比，雄性大鼠Baso%低劑量組偏高（P<0.05），其余劑量組各項血液學(xué)檢測指標，均無顯著性差異（P>0.05）；雌性大鼠各劑量組各項血液學(xué)檢測指標，均無顯著性差異（P>0.05）。變化指標如表1所示。

3.2.5 血液生化指標

給藥3個月，雄性大鼠各劑量組各項指標與對照組相比無顯著性差異（P>0.05）；雌性大鼠中、高劑量組的BUN偏分別升高約22.6%，16.7%，與對照組比較有顯著性差異（P<0.05，P<0.01），而CREA則未見明顯變化；其余各劑量組各指標，與對照組比較無顯著性差異（P>0.05）?；謴?fù)期末，雄性大鼠高劑量組的Na+，Cl-偏高，分別偏高約1.2%，0.8%，與對照組比較有顯著性差異（P<0.05，P<0.01）；其余各劑量組各指標，與對照組比較無顯著性差異（P>0.05）；雌性大鼠各劑量組各指標，與對照組比較無顯著性差異（P>0.05）。變化指標如表2所示。

3.2.6 凝血指標

給藥3個月及恢復(fù)期末，各給藥組各項凝血指標與對照組比較未見明顯差異（P>0.05）。

3.2.7 臟器質(zhì)量、臟器系數(shù)及臟腦系數(shù)

給藥3個月，雄性低、中劑量組腎臟臟腦比與對照組比較偏高，有顯著性差異（P<0.05）；雌性低劑量組脾臟臟體比與對照組比較偏高，有極顯著性差異（P<0.01）；其余各給藥組的臟器絕對值、臟體比及臟腦比與對照組比較均無明顯差異。恢復(fù)期末，雄性低、中劑量組腎臟臟體比與對照組比較偏高，有極顯著性差異（P<0.01或P<0.05）；其余各給藥組的臟器絕對值、臟體比及臟腦比與對照組比較均無明顯差異。

3.2.9 大體解剖及組織病理學(xué)檢查

給藥3個月及恢復(fù)期末進行大體解剖檢查，主要臟器組織及胸腔、腹腔未檢出肉眼可見病變。給藥3個月及恢復(fù)期末組織病理學(xué)檢查，各劑量給藥組的部分動物腎小管上皮細胞內(nèi)可見輕度或輕微的黃褐色色素沉著，而同期的對照組動物未見同樣變化，結(jié)果如圖3所示。其余個別臟器組織病理改變無明顯劑量效應(yīng)關(guān)系，判斷為非藥物因素引起。各組動物腎小管上皮細胞內(nèi)色素沉著的程度及發(fā)生率，如表3所示。

4 討論

4.1 急性毒性(急毒)實驗

痰熱清注射液的人臨床常用量一般為20 mL原液，重癥患者一次可用40 mL，按每人60 kg計算，則劑量約為0.33或0.67 mL/kg/d。大鼠按痰熱清注射液原液和最大給藥容量（20 mL/kg）尾靜脈注射，約相當于人臨床常用單日劑量（mL/kg）的61倍，重癥患者的30倍。本次試驗15 d內(nèi)無一大鼠死亡，給藥后30 min內(nèi)，給藥組和對照組大鼠均可見運動低下，考慮此反應(yīng)可能緣于大容量靜脈注射引起，與供試品本身無關(guān)。

表2 大鼠尾靜脈注射痰熱清注射液3個月對長毒實驗大鼠血液生化指標的影響(±s)

表2 大鼠尾靜脈注射痰熱清注射液3個月對長毒實驗大鼠血液生化指標的影響(±s)

注：1.3個月給藥期末n=10，恢復(fù)期末n=5；2.與對照組比較*P<0.05，**P<0.05。

試驗周期恢復(fù)期末組別雌鼠雄鼠3個月給藥期末對照組恢復(fù)期末中劑量組高劑量組對照組恢復(fù)期末中劑量組高劑量組BUN 8.4±1.1 8.7±1.1 10.3±1.6**9.8±1.4*8.4±1.0 9.1±1.5 10.2±2.0 9.9±0.6 Na+141.7±0.7 141.7±1.2 141.8±0.8 141.8±1.3 141.4±0.8 141.6±1.0 141.5±0.8 141.9±1.0 Cl-107.4±0.4 107.4±0.7 107.9±0.7 107.8±1.0 107.8±1.4 108.0±1.1 108.1±0.9 108.0±0.9 BUN 7.7±0.6 7.8±1.1 7.5±1.0 7.4±0.6 7.3±0.9 7.9±0.6 7.7±0.7 8.0±0.9 Na+142.7±0.6 142.4±1.0 142.2±0.7 142.0±0.8 141.3±0.9 141.4±0.4 141.8±0.7 143.0±0.8**Cl-106.9±0.3 106.6±0.8 106.9±0.4 106.7±0.5 107.5±0.8 107.6±0.4 107.8±0.4 108.4±0.3*

圖3 大鼠尾靜脈注射痰熱清注射液3個月對腎小管上皮細胞內(nèi)黃褐色色素沉著的影響

表3 大鼠尾靜脈注射痰熱清注射液3個月對長毒實驗?zāi)I小管上皮細胞內(nèi)色素沉著的程度及發(fā)生率的影響

4.2 3個月長期毒性（長毒）實驗

預(yù)試發(fā)現(xiàn)，大鼠尾靜脈注射1∶1稀釋的痰熱清注射液原液對血管刺激較大，而1∶2稀釋適合長期給藥。于是高劑量按可操作的最大給藥濃度（1∶2稀釋）和靜脈注射最大給藥容量（20 mL/kg），相當于原液6.67 mL/kg給藥，約為人臨床單日劑量（mL/kg）的20倍，重癥患者的10.0倍；中劑量組1∶4稀釋，相當于給予原液4.00 mL/kg，約為人臨床單日劑量的12倍，重癥患者的6.0倍；低劑量1∶7稀釋，相當于給予原液2.50 mL/kg，約為人臨床單日劑量（mL/kg）的7.6倍，重癥患者的3.7倍，略高于大鼠藥效學(xué)研究的起效劑量（2.00 mL原液/kg）。痰熱清注射液中含有10%的輔料丙二醇，所以對照組給予與中劑量組等量的痰熱清注射液空白對照，即4.00 mL空白對照原液/kg。

給藥期間高劑量組個別動物出現(xiàn)水腫，考慮到對照組亦出現(xiàn)水腫，分析認為高劑量組出現(xiàn)的水腫與受試藥物作用無關(guān)。血液學(xué)指標Baso%的改變無量效關(guān)系且絕對值變化較小，故不認為與受試藥物相關(guān)。恢復(fù)期雄性大鼠高劑量組的Na+，Cl-偏高，但均在本中心背景數(shù)據(jù)范圍之內(nèi)，分析認為無毒理學(xué)意義。雖然個別器官出現(xiàn)臟器系數(shù)或臟腦系數(shù)的改變，但上述變化無明顯劑量關(guān)系，且組織病理學(xué)檢查未見明顯異常，綜合分析認為無毒理學(xué)意義。

雄性大鼠高劑量組在第6周攝食量顯著低于對照組，雌性大鼠中、高劑量組的攝食量在部分周次，尤其從高劑量組從第10周開始顯著低于對照組，分析認為高濃度大劑量靜脈注射痰熱清對大鼠攝食量有一定的抑制作用。

出現(xiàn)于給藥期末各劑量給藥組，部分動物腎小管上皮細胞內(nèi)的黃褐色色素沉著具有一定的劑量相關(guān)性，且對照組動物未見同樣變化，考慮與供試品有關(guān)。根據(jù)這些色素的形態(tài)學(xué)特征綜合分析認為，這種色素沉著可能系供試品的某種代謝產(chǎn)物在排泄過程中被腎小管重吸收所致，而非供試品的毒性作用。因其程度輕微，未對腎功能產(chǎn)生明顯影響?；謴?fù)期末，雖然各劑量給藥組仍有部分動物腎小管上皮細胞內(nèi)存在這種黃褐色色素，但其程度及發(fā)生率明顯下降（給藥3個月：高劑量組19+，1±，中劑量組4+，8±；恢復(fù)期：高劑量組0+，9±，中劑量0+，4±，詳見表3）。說明停藥4周后腎小管上皮細胞內(nèi)的色素沉著可以得到很大程度的恢復(fù)。

結(jié)合給藥各劑量組動物個體數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析，包括BUN、CREA、臟器指數(shù)、腎小管上皮細胞內(nèi)的黃褐色色素沉著等，發(fā)現(xiàn)以上幾項變化在動物個體中并無明顯的相關(guān)性，所以分析此現(xiàn)象認為無明顯毒理學(xué)意義。

綜上，大鼠急毒的安全劑量為：20 mL痰熱清原液/kg；大鼠長毒的安全劑量為：6.67 mL原液/kg。但對于長期高劑量給藥，建議就食耗量作進一步觀察。