馮長華 鄭揚(yáng)云 付玲 魏芳芳

[摘要] 目的 研究在自愿咨詢檢測HIV抗體工作中，用采集末梢血制成濾紙干血片替代采集靜脈血的可行性。方法 采集200例自愿咨詢受檢者的手指末梢血及靜脈血（抗凝全血和非抗凝血）。將手指末梢血和靜脈抗凝全血分別制成濾紙干血片樣品，非抗凝血則分離出血清，并在不同條件下保存。用ELISA法和免疫印跡法檢測HIV抗體，將檢測結(jié)果進(jìn)行比較。 結(jié)果 各類濾紙干血片與靜脈血清經(jīng)ELISA法檢測，定性結(jié)果一致。與血清的測量結(jié)果相比，直徑6 mm的濾紙干血片OD值有顯著性差異（P<0.05）。直徑10 mm的濾紙干血片OD值無顯著性差異（P>0.05），濾紙干血片樣品用生理鹽水和pH7.4的PBS洗脫均可，300 μL的生理鹽水洗脫效果更好。濾紙干血片保存1周的結(jié)果穩(wěn)定。用免疫印跡法檢測，濾紙干血片與靜脈血清判讀結(jié)論一致。 結(jié)論 采集末梢血制成的濾紙干血片，以ELISA法檢測HIV抗體，結(jié)果可靠、穩(wěn)定，且操作簡便，運(yùn)輸和保存無生物危害，可替代采集靜脈血用于自愿咨詢HIV抗體檢測工作。

[關(guān)鍵詞] 濾紙干血片;艾滋病病毒抗體;自愿咨詢;酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn);免疫印跡法

[中圖分類號] R512.91? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）17-0144-04

A study of the application of dried-blood spot specimens on filter paper to voluntary consultation on HIV antibody detection

FENG Changhua? ?ZHENG Yangyun? ?FU Ling? ?WEI Fangfang

Department of AIDS and STD Prevention and Control，Nanchang Center for Disease Control and Prevention，Research Base of State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control，Nanchang? ?330038，China

[Abstract] Objective To study the feasibility of using collected peripheral blood to make dried-blood spots（DBSs）on filter paper instead of collecting venous blood in voluntary consultation on HIV antibody detection. Methods The finger peripheral blood and venous blood （anticoagulant whole blood and non-anticoagulant blood） of 200 consultation and detection volunteers were collected. Finger peripheral blood and venous anticoagulant whole blood（WB） were respectively made into dried-blood spot specimens on filter paper，while serum was disassociated from non-anticoagulant blood，and they were both stored under different conditions. The HIV antibody was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and immunoblotting test（IBT）， and the detection results were compared. Results When all kinds of DBSs on filter paper and venous serum were detected by ELISA，the qualitative results were consistent. Compared with the detection results of serum，the OD values of DBSs on filter paper with a diameter of 6 mm were significantly different（P<0.05）. There was no significant difference in the OD values of DBSs on filter paper with a diameter of 10 mm（P>0.05）. The dried-blood spot specimens on filter paper could be eluted with normal saline and PBS with pH 7.4，and the elution effect of 300 μL normal saline was better. The results of one week storage of DBSs on filter paper were stable. When IBT was used for detection，the interpretation conclusions of DBSs on filter paper and venous serum were consistent. Conclusion When ELISA is used to detect the HIV antibody in DBSs on filter paper made by collecting peripheral blood，the results are reliable and stable，the operation is simple and convenient，and the transportation and storage cause no biological hazards. It can be applied to voluntary consultation on HIV antibody detection as a substitute for collecting venous blood.

[Key words] Dried-blood spots on filter paper; HIV antibody; Voluntary consultation; Enzyme- linked immunosorbent assay; Immunoblotting test

截至2018年9月30日，全國報告現(xiàn)存活艾滋病病毒（HIV）感染者/AIDS患者849 602例，報告死亡262 442例[1]。估計現(xiàn)存活感染人數(shù)為125萬[2]。還有40余萬人尚未被檢測發(fā)現(xiàn)。而報告的感染者中，絕大多數(shù)是患病后通過臨床就診，進(jìn)行常規(guī)檢查時發(fā)現(xiàn)的，提示通過主動檢測（如自愿咨詢檢測）途徑發(fā)現(xiàn)的感染者數(shù)量少。究其原因，有受檢者心存顧慮的因素。目前，HIV抗體檢測的常規(guī)樣品為靜脈采集的血清/血漿，需在醫(yī)療機(jī)構(gòu)由專業(yè)人員操作。而很多人對個人信息非常敏感，忌拋頭露面，如要到醫(yī)療機(jī)構(gòu)等公共場所去現(xiàn)場采樣，可能需承擔(dān)很大的精神壓力，因而主動檢測的意愿降低，進(jìn)而影響艾滋病的發(fā)現(xiàn)與治療。因此，需要建立一種便捷的樣品采集方式（如居家采樣），以促進(jìn)主動檢測。濾紙干血片是一種較理想的載體，將手指末梢血滴入濾紙，制成濾紙干血片（Dried blood spot，DBS）[3]，無傳染性，可通過快遞投送等方式送至實(shí)驗(yàn)室檢測。本研究對南昌市疾病預(yù)防控制中心采集的濾紙干血片，在不同條件下保存和洗脫處理，與同期靜脈血清的HIV抗體結(jié)果相比較，探索在自愿咨詢檢測工作中，用采集末梢血制成濾紙干血片替代采集靜脈血的可行性，并研究影響濾紙干血片檢測結(jié)果的各種因素，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3～12月在南昌市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行自愿咨詢HIV抗體檢測的受檢者200例（其中含隨訪已確證為艾滋病感染者112例）。受檢者中，男女比4：1，年齡17～79歲，平均（35.0±14.1）歲，40歲以下年齡占比80%。在自愿咨詢檢測人群中，按婚姻狀況，未婚比例占73%;按學(xué)歷，大專以上學(xué)歷比例占61%。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑? 使用無痛采血針采集手指末梢血，使用真空采血管采集靜脈血分別裝入5 mL非抗凝管。濾紙是英國Whatman公司生產(chǎn)的3號定性濾性，已劃出直徑為10 mm的圓圈。ELISA試劑是北京金豪公司生產(chǎn)的HIV（1+2）型抗體試劑，批號：2017111007，有效期：20181111。酶標(biāo)儀（DNM-9602G）和洗板機(jī)（DNX-96）為北京普朗新技術(shù)有限公司產(chǎn)品。免疫印跡法試劑為MP公司生產(chǎn)HIV（1+2）型抗體試劑，試劑批號為AE7045，有效期至20190501。全自動免疫印跡儀為瑞士Tecan公司產(chǎn)品。

1.2.2 樣品采集和保存? 采集每一位檢測對象的手指末梢血和靜脈血非抗凝血。手指末梢血直接滴在濾紙上的圓圈中央，讓其浸透并填滿整個圓圈。在室溫下干燥4 h制成濾紙干血片，分別用密封袋密閉包裝。靜脈非抗凝血分離出血清。濾紙干血片與血清置于同等條件。每人份濾紙干血片及血清樣品均分成6～9份，在室溫和2℃～8℃環(huán)境下分別保存3 d和7 d，用于研究不同條件對濾紙干血片檢測結(jié)果的影響。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 洗脫濾紙干血片? 同一人份濾紙干血片分別用直徑6 mm和10 mm的打孔器取樣后，置入試管中，加入洗脫液。洗脫液分別為生理鹽水和磷酸鹽緩沖液（pH值為7.4的PBS）。洗脫期間置于2℃～8℃冷藏保存。

1.3.2 ELISA法檢測? 檢測項(xiàng)目為HIV抗體。按不同時間、不同溫度下保存的濾紙片，用不同種類、不同量的洗脫液處理后，將洗液全部加入酶標(biāo)板孔，其余程序按照試劑說明書操作。同等條件下保存的血清按照試劑說明書操作。使用酶標(biāo)儀雙波長（測量波長450 nm，參考波長620 nm）測量各孔OD值。

1.3.3 免疫印跡法檢測? 將部分ELISA法檢測后的樣品（同一人份的末梢血濾紙干血片和血清），用全自動免疫印跡儀進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。兩者實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，以配對t檢驗(yàn)對樣品OD值進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同規(guī)格的濾紙干血片經(jīng)不同洗脫液處理的結(jié)果與血清比較

121人份樣品（每人份樣品包括靜脈血清、直徑6 mm和10 mm的末梢血濾紙干血片），濾紙干血片分別用生理鹽水和pH7.4的PBS洗脫，ELISA法檢測結(jié)果分別與同期靜脈血清結(jié)果進(jìn)行比較。直徑6 mm的濾紙干血片用兩種洗脫液洗脫，結(jié)果與靜脈血清相比均有顯著性差異（P<0.05），直徑10 mm的濾紙干血片無顯著性差異（P>0.05）。見表1。

2.2 不同用量洗脫液處理后的濾紙干血片結(jié)果與靜脈血清比較

56人份直徑10 mm的末梢血濾紙干血片，分別用100 μL、200 μL、300 μL、400 μL的生理鹽水洗脫，ELISA法檢測結(jié)果分別與同期靜脈血清結(jié)果相比較，均無顯著性差異（P>0.05），用300 μL生理鹽水洗脫的結(jié)果更接近血清。見表2。

2.3 不同洗脫時間的濾紙干血片結(jié)果與靜脈血清比較

50人份直徑10 mm的末梢血濾紙干血片，分別用300 μL的生理鹽水洗脫24 h和48 h，ELISA法檢測結(jié)果分別與同期靜脈血清結(jié)果比較，均與血清結(jié)果無顯著性差異（P>0.05），48 h洗脫效果更好。見表3。

2.4 不同保存條件的濾紙干血片結(jié)果與靜脈血清比較

50人份直徑10 mm的末梢血濾紙干血片，室溫（15℃～30℃）和冷藏（2℃～8℃）條件下分別保存3 d和7 d，用300 μL生理鹽水洗脫48 h，ELISA法檢測結(jié)果分別與3 d內(nèi)的血清結(jié)果進(jìn)行比較，均與血清結(jié)果無顯著性差異（P>0.05）。見表4。

2.5 最佳條件下定性結(jié)果的比較

用ELISA法分次檢測共200人份樣品（每人份均包括常規(guī)采集的靜脈血清及常溫保存3 d的末梢血濾紙干血片，其中末梢血濾紙干血片用300 μL生理鹽水洗脫48 h）。兩種類型樣品定性結(jié)果均一致。檢出HIV抗體呈有反應(yīng)（陽性）144例，無反應(yīng)（陰性）56例。

2.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)定性結(jié)果的比較

取經(jīng)ELISA法檢測的樣品27人份（其中有反應(yīng)22人份，無反應(yīng)5人份。同一人份樣品包括直徑10 mm末梢血濾紙干血片和血清，濾紙干血片用生理鹽水洗脫48 h），用免疫印跡法進(jìn)一步檢測，檢出20人份為HIV-1抗體陽性，2人份為HIV抗體不確定，5人份為HIV抗體陰性。同一人份濾紙干血片和血清的定性檢測結(jié)論相同，部分濾紙干血片樣品與血清的條帶判讀略有差異，但主要條帶（env條帶和p24條帶）符合率100%。

3 討論

濾紙干血片樣品與血清樣品相比，稀釋3～6倍，OD值有所下降，但不會影響結(jié)果[4-6]，其結(jié)果受血片大小、保存時間和環(huán)境、洗脫液類型、洗脫時間等因素影響[7]。本研究中濾紙干血片的最佳條件是直徑10 mm，用生理鹽水過夜洗脫。而6 mm的濾紙片測量OD值與血清相比存在顯著性差異，主要原因是部分弱陽性樣品OD值差異較大，但均不影響定性結(jié)果。建議檢測無反應(yīng)結(jié)果應(yīng)充分考慮檢測窗口期，并適時的進(jìn)行復(fù)檢。本實(shí)驗(yàn)中，用PBS和生理鹽水洗脫均可達(dá)到較好的結(jié)果[4]，但生理鹽水洗脫效果更好，與楊曉莉等[5]研究結(jié)果一致。

有研究結(jié)果顯示，用免疫印跡法檢測濾紙干血片的HIV抗體與血清判讀結(jié)論相同[4，8]。但部分樣品會有個別條帶的缺失。因人們對艾滋病結(jié)果高度敏感，建議ELISA法檢測有反應(yīng)的樣品，通知受檢者盡量到防控機(jī)構(gòu)接受專門的確證檢測及咨詢關(guān)懷服務(wù)。

濾紙干血片結(jié)果較為穩(wěn)定，在密封的條件下，可在室溫或37℃放置長達(dá)30 d，在4℃保存90 d，在-20℃可貯存90 d以上，結(jié)果較為穩(wěn)定[9，10]。但儲存條件潮濕、溫度高、時間長會導(dǎo)致濾紙干血片的OD值下降[11，12]。本研究中，濾紙干血片在室溫下保存時間最長為1周，充分考慮了從采樣到送達(dá)實(shí)驗(yàn)室所需的時間，其結(jié)果與文獻(xiàn)相符。

目前，國內(nèi)開展HIV抗體咨詢檢測主要有兩個途徑：一是基于各級醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)室資源的檢測，二是基于自我檢測。前者需借助專業(yè)人員和專門設(shè)施現(xiàn)場采樣，受檢者需要直面隱私泄露、社會歧視等社會問題，易產(chǎn)生極大的心理壓力而影響檢測意愿[13，14]。后者可能會因?qū)I(yè)知識的缺乏以及自購試劑的差異，導(dǎo)致對檢測結(jié)果的誤導(dǎo)，也不利于防治部門掌握疫情動態(tài)和及時對感染者進(jìn)行關(guān)懷與治療。如受檢者自采送血，樣品送至相關(guān)專業(yè)部門進(jìn)行檢測，則可兩者兼顧。本研究中，采樣同時以口頭詢問的方式對受檢者進(jìn)行調(diào)查。調(diào)查顯示，82%的人更傾向于采集手指末梢血，18%的人兩者均可。采集末梢血可用無痛采血針，操作簡單，無技術(shù)和人員資質(zhì)要求?？稍诰蛹?、小診所、偏遠(yuǎn)地區(qū)及進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的社會場所進(jìn)行取樣，不受環(huán)境條件的限制，亦可減少外出調(diào)查工作人員的配比。還可用于嬰幼兒、吸毒等采集靜脈血較為困難的人群。同時，本研究中上門進(jìn)行自愿咨詢的受檢者絕大多數(shù)為40歲以下的中青年，提示40歲以上的人群尤其是老年人主動到醫(yī)療機(jī)構(gòu)接受咨詢檢測服務(wù)的概率較小，濾紙干血片的居家采集為之提供了一種新的檢測途徑。

濾紙干血片經(jīng)干燥后，即不再具有生物活性，大大減少了對環(huán)境和人員的生物危害。運(yùn)輸時不需冷鏈設(shè)備，不用三級包裝設(shè)施[13，15]，經(jīng)干燥的濾紙片亦可作為無污染樣本直接運(yùn)輸[3]。故在自愿咨詢檢測HIV抗體工作中，受檢者采樣并將濾紙干血片干燥后，注意用密封袋封裝好，可以采用快遞方法寄送，方便快捷，也免去拋頭露面的心理負(fù)擔(dān)，可以促進(jìn)更多的需求者主動檢測，及時了解自身的感染狀況，進(jìn)一步促進(jìn)行為方式的改變。單位和部門之間，亦可將需運(yùn)送的靜脈血（全血或血清）制作成濾紙干血片運(yùn)送，無需專人專車，節(jié)約了工作資源。

綜上所述，采集末梢血制作成的濾紙干血片的方式，可替代傳統(tǒng)的采集靜脈血用于ELISA法檢測HIV抗體，促進(jìn)了自愿咨詢檢測HIV抗體等工作的發(fā)展?；诹己玫姆€(wěn)定性，其亦可應(yīng)用于HIV核酸等檢測。

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（收稿日期：2019-11-21）