張民達，劉夢婷，李小瑩，劉秀斌，曾建國

1.湖南農(nóng)業(yè)大學 中獸藥湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學 園藝園林學院，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128

甜葉菊Steviarebaudiana又名甜草、甜菊、甜茶，是一種菊科多年生草本植物。甜葉菊含有多種功能性成分，包括糖苷類、黃酮類、綠原酸類等。甜葉菊糖苷類化合物種類最多、含量最大，具有極高的甜度，其中甜菊苷甜度為蔗糖的300倍[1]，作為甜味劑在食品、藥品、化工、釀酒等行業(yè)中廣泛使用。目前甜葉菊主要作為生產(chǎn)的甜菊糖苷的原料，而針對綠原酸等活性成分開發(fā)利用的研究較少。

綠原酸類多酚成分是由咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸，為金銀花和山銀花中抗菌、抗病毒的主要有效成分。隨著對綠原酸研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降糖等多種活性作用[2]。目前，已在甜葉菊中發(fā)現(xiàn)包含咖啡?？鼘幩?、二咖啡?？鼘幩岷腿Х弱？鼘幩嵩趦?nèi)的24種綠原酸類化合物[3]；另外，甜葉菊中還含有具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖等生物活性的槲皮苷等黃酮類成分[4]。綠原酸已經(jīng)作為一種飼料添加劑被廣泛應用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)中[5]，而異綠原酸作為飼料添加劑在代替抗生素使用、提高飼料利用率及加強生產(chǎn)性能等方面具有良好前景[6]。從甜葉菊中生產(chǎn)甜菊糖苷的同時，開發(fā)利用綠原酸和槲皮苷等活性成分，這為實現(xiàn)甜葉菊資源的綜合利用和低成本獲得綠原酸和槲皮苷的原料來源提供了新的思路。由于多指標的質(zhì)量控制模式需要對照品的種類和數(shù)量均比較大，且部分對照品價格比較昂貴且難以獲得，王智民等[7]提出了一測多評的多指標質(zhì)控模式，即在多指標質(zhì)量控制時，以樣品中對照品廉價易得的常見成分為內(nèi)標，建立該成分與其他成分間的相對校正因子(Relative Correction Factor，RCF)，再通過校正因子計算出其他成分的含量。在方法實施時，可在只有1個對照品而其余對照品不足的情況下，實現(xiàn)這些成分的同步含量測定，并已成功應用于苦參、丹參注射液、黃柏、附子、雙黃連口服液等中藥的質(zhì)量控制[8]。其中黃連藥材的一測多評法(QAMS)被收錄于2010年版《中華人民共和國藥典》[9]。付曉等[10]采用高效液相色譜法(HPLC)同時測定甜葉菊中3種綠原酸類化合物，為了更加全面地評價甜葉菊原料及提取物中綠原酸和槲皮苷等有效成分的含量，本實驗利用HPLC以綠原酸為內(nèi)標，采用斜率校正法建立其與甜葉菊中其他5種綠原酸類成分新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的相對校正因子，同時建立綠原酸與槲皮苷在相同條件下的相對校正因子。并計算各成分含量，同時采用外標法同步測定，驗證QAMS得到結(jié)果的準確性和可靠性。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)、Agilent ChemStation工作站、Waters E2695、Waters ACQUITY Arc 高效液相色譜系統(tǒng)(USA，Waters)，Empower工作站；色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱、華譜新創(chuàng)Unitary C18柱和Diamoncil C18柱(色譜柱規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm)；十萬分之一電子天平(USA，METTLER TOLEDO)。

綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201415，純度：96.20%)；新綠原酸(德思特生物，批號：DST180130-015，純度：99%)；隱綠原酸(德思特生物，批號：DST180210-035，純度：99%)；異綠原酸B(德思特生物，批號：DST180130-037，純度：99%)；異綠原酸A(中國食品藥品檢定研究院，批號：111782-201706，純度：97.3%)；異綠原酸C(德思特生物，批號：DST180210-038，純度：99%)；槲皮苷(一飛生物，批號：F316202，純度：98%)；甲醇(色譜純，德國 Merck公司)；磷酸(色譜純，美國 Tedia公司)。

甜葉菊樣品由山東省諸城市浩天藥業(yè)有限公司提供，由湖南農(nóng)業(yè)大學曾建國教授鑒定為甜葉菊正品，粉碎，過40目篩。

2 方法與結(jié)果

2.1 QAMS的建立

2.1.1色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇(A)-0.1% 磷酸水(B)，梯度洗脫(0～1 min，10%～25%A；1～5 min，25%～25%A；5～12 min，25%～35%A；12～13 min，35%～45%A；13～30 min，45%～45%A)；體積流量1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，檢測波長：0～23 min，330 nm，23～30 min，350 nm，柱溫25 ℃。樣品圖譜和混合對照品圖譜見圖1。

注：A.甜葉菊樣品；B.對照品；1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.異綠原酸B；5.異綠原酸A；6.異綠原酸C；7.槲皮苷。圖1 甜葉菊樣品及對照品的HPLC圖

2.1.2供試品溶液的制備 取甜葉菊樣品，精確稱取0.5 g于50 mL容量瓶中，70%甲醇溶解，搖勻并定容，超聲2 h后用70%甲醇溶液補齊液面至刻度線，過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.1.3對照品混合對照品溶液的制備 精確稱取綠原酸0.009 66 g、新綠原酸0.001 76 g、隱綠原酸0.001 60 g、異綠原酸B 0.002 11 g、異綠原酸A 0.008 13 g、異綠原酸C 0.005 36 g、槲皮苷0.002 96 g于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，搖勻并定容，過0.45 μm濾膜，即得對照品混合對照品溶液。

2.1.4線性系列溶液的制備 取混合對照品溶液，采用逐級稀釋法分別稀釋2、5、10、20、40、60、100倍，共獲得7個不同濃度的混合對照品溶液。

2.1.5線性及檢測限與定量限 分別精密吸取線性系列溶液上機檢測，以峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

取線性系列溶液濃度最低者，不斷稀釋，取1 mL置于液相小瓶中，按2.1.1方法上機檢測，分別取S/N為10、3作為各個物質(zhì)的定量限及檢測限。見表1。

2.1.6相對校正因子 各個物質(zhì)相對校正因子為其標準曲線斜率與內(nèi)標綠原酸的斜率之比，計算得到新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，槲皮苷的相對校正因子分別為1.08、1.12、1.17、1.33、1.27、0.63。

2.1.7準確度試驗 精密稱取0.25 g樣品9份于50 mL容量瓶中，按高(150%)、中(100%)、低(50%) 3個濃度各3份加入7個對照品適量，70%甲醇溶解并定容，按照2.1.2項方法提取。按2.1.1項方法進樣，計算平均加樣回收率。得到綠原酸，新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮苷的不同添加水平的平均回收率分別為102.74%、102.51%、103.23%、101.68%、98.11%、96.61%、99.87%。RSD分別為：6.98%、6.95%、2.93%、5.20%、6.18%、5.76%、5.09%。

2.1.8重復性試驗 取樣品6份，照2.1.2項下方法平行制備，進樣分析。以標準曲線法計算7個化合物的含量，其RSD分別為1.05%、0.98%、1.23%、1.00%、0.99%、1.00%、1.11%。表明重復性良好。

2.1.9日內(nèi)日間精密度 精密移取高、中、低3個濃度混合對照品溶液重復進樣6次，測定各成分的峰面積。計算得到綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮苷低濃度的RSD分別為0.1%、0.1%、0.2%、0.2%、0.0%、0.1%、1.1%；中濃度的RSD分別為0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.0%、1.1%、1.1%；高濃度的RSD分別為1.3%、1.3%、1.3%、1.2%、1.3%、1.2%、1.5%；精密吸收中濃度混合對照品溶液，每天進樣3次，連續(xù)3 d，記錄峰面積。計算得到綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮苷的RSD分別為2.0%、2.0%、2.3%、1.9%、2.1%、2.0%、2.1%。表明日內(nèi)日間精密度良好。

2.2 耐用性

2.2.1柱溫和流速耐用性 在相同條件下，分別考察不同流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)和不同柱溫(20、25、30 ℃)對7個物質(zhì)相對保留時間的影響，結(jié)果顯示不同流速和柱溫對相對保留時間的影響較大(RSD>5.0%)，檢測過程中應當對柱溫和流速嚴格控制以確保結(jié)果的準確。

2.2.2相對校正因子的耐用性 本實驗分別選用Agilent 1260、Waters E2695和Waters ACQUITY Arc 3套高效液相色譜系統(tǒng)與3種不同色譜柱考察色譜系統(tǒng)對相對校正因子的影響。結(jié)果顯示不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對RCF的影響較小(RSD<4.0%，重復性良好，見表2)。

表1 6種綠原酸類成分及槲皮苷的線性及檢測限與定量限

表2 一測多評法不同色譜系統(tǒng)與色譜柱條件下6種綠原酸成分相對校正因子的耐用性

2.3 與外標法的比較

分別采用QAMS與外標法對15批甜葉菊樣品進行檢測，平行測定3次。結(jié)果顯示：1)外標法與QAMS結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義；2)不同批次樣品中7個物質(zhì)的總量差異較大，各成分比例也存在較大差別。

3 討論

3.1 建立對槲皮苷的含量測定方法

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，甜葉菊中含有大量黃酮類活性成分槲皮苷。在利用綠原酸建立新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的相對校正因子的同時，也對槲皮苷的相對校正因子進行了測定，并對其進行方法學考察，結(jié)果顯示此方法可以用來測定甜葉菊中槲皮苷的含量。

3.2 檢測波長的選擇

對綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮苷進行全波長掃描發(fā)現(xiàn)：綠原酸，新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C具有相近的最大吸收波長，均在330 nm附近，故選擇330 nm作為綠原酸類多酚的檢測波長。而槲皮苷的最大吸收波長在350 nm處。選擇350 nm作為檢測波長。

表3 15批甜葉菊樣品QAMS與外標法的比較結(jié)果 %

3.3 色譜峰的定位

色譜峰的定位是通過相對保留時間來評價的。本研究考察發(fā)現(xiàn)柱溫和流速改變對各成分相對保留時間的影響較大，不利于色譜峰的定位。但各成分的出峰順序不受影響。在QAMS中，可以通過各成分的出峰順序，計算待測組分與內(nèi)參的保留時間差值。同時參考各成分的紫外吸收特征，基本可以確定各目標峰的位置。

3.4 質(zhì)量評價

目前對甜葉菊原料的利用主要集中在甜菊糖苷的開發(fā)利用上，針對綠原酸等活性成分開發(fā)利用的研究較少。可以從甜葉菊中開發(fā)利用綠原酸和槲皮苷等活性成分，從而實現(xiàn)甜葉菊資源的綜合利用。由于不同甜葉菊中各成分比例具有較大差異，其中任意一種成分的含量都不能正確反映甜葉菊的質(zhì)量。本實驗以綠原酸為內(nèi)標，采用QAMS對甜葉菊葉片原料中6種成分進行含量測定，并對其進行了方法學考察，結(jié)果證明此方法在準確度、線性范圍、重復性、日內(nèi)日間精密度等都符合要求。考察了不同色譜儀、不同色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果表明相對校正因子不受上述色譜條件的影響；同時也在此條件下對槲皮苷的含量進行了控制。采用外標法和QAMS對15批甜葉菊葉片原料進行含量測定，結(jié)果無顯著性差異，證明所建立的相對校正因子定量分析方法可行，故可采用以綠原酸對照品為內(nèi)標的QAMS測定甜葉菊葉片原料中綠原酸類6種活性成分的含量以評價甜葉菊原料的質(zhì)量。