杜寶中，王昊陽，樊花，余中，劉廣鈞

西安理工大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)系，陜西 西安 710054

中藥以其純天然性、毒副作用低、標(biāo)本皆治等特點，數(shù)千年來為中華民族的健康和繁衍做出了巨大貢獻(xiàn)，被譽(yù)為中華民族的寶貴文化遺產(chǎn);但因中藥組成的復(fù)雜性及藥效的多組分協(xié)同效應(yīng)，導(dǎo)致其質(zhì)量的一致性和臨床療效的穩(wěn)定性受到較大影響，從而成為制約中藥的現(xiàn)代化進(jìn)程和“鋪軌”國際市場關(guān)鍵所在。因此，如何根據(jù)中藥的特點，對其化學(xué)成分及含量、作用機(jī)制進(jìn)行研究，形成具有中醫(yī)藥特點的現(xiàn)代質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，已成為實現(xiàn)中藥標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化和國際化的一項重要課題。

目前，中藥的鑒別和質(zhì)量控制的方法主要有：1)色譜法[1-2]，研究和應(yīng)用最廣泛的方法，氣相色譜法僅適用于分離、鑒別和分析其中揮發(fā)性成分，而高效液相色譜僅用于真溶液體系，需要復(fù)雜的前處理，使得藥物有效信息丟失，兩者均不能體現(xiàn)中藥的完整信息；2)波譜法[3-4]，紫外吸收光譜主要用于中藥中所含的不飽和組分，紅外光譜與拉曼光譜也只能給出中藥的部分結(jié)構(gòu)或所含官能團(tuán)的信息，即圖譜難以全面反映中藥的特性和協(xié)同作用，核磁共振被認(rèn)為是研究中藥有效成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的重要方法之一，但其制樣手續(xù)繁雜、測試成本高，同樣也僅為部分結(jié)構(gòu)信息；3)DNA分子標(biāo)記技術(shù)[5-6]，該法可靠性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，具有專屬性，但操作要求苛刻、儀器設(shè)備昂貴，還需引物篩選、標(biāo)記、序列測定等，難以推廣普及。上述方法的應(yīng)用范圍各有不可忽視的局限性，因此探索簡便、快速、高效的指紋圖譜新方法，以適應(yīng)對中藥材的鑒別與質(zhì)量控制，無疑是擺在分析工作者面前富有挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一。

基于指紋圖譜技術(shù)建立的中藥質(zhì)量控制體系應(yīng)從其整體作用不同于化學(xué)藥的特點出發(fā)，實現(xiàn)對多組分構(gòu)成的復(fù)雜體系的中藥全成分的有效分析，才能真正達(dá)到中藥的鑒別及質(zhì)量控制，確保用藥安全、療效穩(wěn)定[7]。

利用電化學(xué)方法與振蕩體系，獲取能顯示中藥特性的振蕩圖譜，并由圖譜反映的信息鑒別中藥種類和確定化學(xué)成分的量。方法靈敏、選擇性高、簡便可靠，已引起了高度重視[8-9]。本研究基于B-Z化學(xué)振蕩反應(yīng)原理，構(gòu)建了KBrO3-Ce(SO4)2-H2SO4-檸檬酸振蕩體系，通過對空白體系穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的考察與組成優(yōu)化，用于27種中藥的電化學(xué)指紋圖譜的檢測，以及黃芪、枸杞子、白術(shù)道地性的鑒別，中藥形態(tài)和不同部位差異的區(qū)分等。結(jié)果表明，圖譜特異性顯著，信息豐富，可用于中藥的質(zhì)量評價，道地性、真?zhèn)蔚蔫b別及定量分析；同時也是對于色譜和波譜指紋圖譜技術(shù)的補(bǔ)充與拓展。

1 材料與方法

1.1 材料

CHI660b電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，17型雙液接飽和甘汞電極、213型鉑電極(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，150 mL反應(yīng)器(天津玻璃儀器廠)。

陳皮(四川)、五加皮(陜西)、西洋參(陜西)、川貝母(四川)、丹參(陜西)、川芎(四川)、杜仲(甘肅)、茯苓(河南)、葛根(廣西)、黃柏(四川)、肉桂(云南)、桑葉(陜西)、山楂(山東)等中藥材為市售，并經(jīng)陜西省食品藥品檢驗研究院中藥室主任羅定強(qiáng)高級工程師鑒定為正品。硫酸高鈰、檸檬酸、氯化鉀、硝酸鉀、溴酸鉀、硫酸均為分析純，所有溶液用二次蒸餾水配制。

1.2 操作方法

以鉑電極為工作電極，雙液接飽和甘汞電極為參比電極?？刂扑囟?37±1)℃，分別向反應(yīng)器中加入1.00 g干燥的中藥粉末(粒徑<0.15 mm)、45 mL H2SO4溶液，攪拌下浸出15 min，再依次加入硫酸高鈰、檸檬酸，待基線穩(wěn)定，最后加入5 mL KBrO3溶液，同時采集數(shù)據(jù)，記錄E-t振蕩曲線至電位振蕩消失。即獲得中藥非線性電化學(xué)指紋圖譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 電化學(xué)指紋圖譜

根據(jù)化學(xué)振蕩原理，酸性條件下，BrO3-為氧化劑，檸檬酸為振蕩底物，硫酸高鈰為催化劑[10]，而反應(yīng)中生成具有自催化作用的HBrO2，其存在與否將直接導(dǎo)致BrO3-的還原產(chǎn)物Br-的形成和Ce4+→Ce3+的進(jìn)行；當(dāng)Br-累積與Ce4+消耗至臨界值時，將導(dǎo)致振蕩反應(yīng)發(fā)生，表現(xiàn)為體系的氧化還原電位值隨時間呈周期性變化[11]。隨著有機(jī)底物檸檬酸的耗散，振蕩最終停止。電化學(xué)指紋圖譜中指紋峰的含義區(qū)別于色譜峰，色譜峰僅代表經(jīng)色譜柱分離樣品后，單一組分隨保留時間的檢測結(jié)果，且不涉及任何化學(xué)反應(yīng)，而振蕩波形的指紋峰則代表振蕩組分與底物反應(yīng)隨時間的非線性變化，在振蕩圖譜中，1個指紋峰代表振蕩反應(yīng)的1個周期。因此，電化學(xué)指紋圖譜可提供完整的定性及定量化學(xué)信息。

中藥為多組分復(fù)雜體系，其藥效為多種活性或非活性成分協(xié)同作用或“生克作用”。如以中藥為振蕩底物，固定振蕩體系各組分濃度，由于每種中藥參與振蕩反應(yīng)的物質(zhì)不同，對振蕩體系的擾動方式和程度亦不相同(表現(xiàn)為對振蕩反應(yīng)的抑制或增強(qiáng))。因此，利用這一規(guī)律可得到每種中藥的特征振蕩圖譜，從而實現(xiàn)對中藥的真?zhèn)舞b別及質(zhì)量評價。

2.2 空白體系穩(wěn)定性

中藥電化學(xué)指紋圖譜是其對空白振蕩體系的擾動而形成，疊加于空白振蕩圖譜之上。因此空白振蕩體系的穩(wěn)定性是獲取準(zhǔn)確結(jié)果的前提。本研究以誘導(dǎo)期(t0)、振蕩期(td)、最大振幅(Amax)、振蕩周期(T)、最高電位(Emax)、起始電位(Emin)、平衡電位(Ea)為考察指標(biāo)，平行測定3次，其振蕩圖譜和參數(shù)分別見圖1和表1。表1中7組參數(shù)RSD≤1.63%，因此空白振蕩體系具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

圖1 空白體系的振蕩圖譜

2.3 振蕩體系與測試條件

基于振蕩圖譜的7個特征參數(shù)，以振蕩波形特征顯著、信息完整、誘導(dǎo)期較短，振蕩期適中為依據(jù)，分別探討了體系各組分濃度、溫度、攪拌速率及中藥加入量對振蕩圖譜特征性的影響。經(jīng)優(yōu)化確定振蕩體系組成為：0.04 mol·L-1KBrO3、0.01 mol·L-1Ce(SO4)2、0.55 mol·L-1H2SO4、0.01 mol·L-1檸檬酸；檢測條件：溫度(37±1)℃，攪拌速率100 r·min-1，浸出時間15 min，中藥加入量1.0 g·(50 mL)-1。獲得穩(wěn)定、重現(xiàn)的電化學(xué)指紋圖譜。

2.4 圖譜重現(xiàn)性

中藥指紋圖譜的特征之一，即重現(xiàn)性，也是其是否具有通用性和實用性的衡量標(biāo)準(zhǔn)。在確定的振蕩器及檢測條件下，獲取陳皮的電化學(xué)指紋圖譜，測定3次，考察其重現(xiàn)性，結(jié)果見表2。

如表2所示，陳皮電化學(xué)指紋圖譜7個參數(shù)的RSD≤2.61%，說明在相同測試條件下，同一中藥的振蕩圖譜具有較好的重現(xiàn)性。

2.5 圖譜特異性

在確定的振蕩體系和測試條件下，分別以黃芪、陳皮、白芍等27種中藥為振蕩底物，獲得形狀迥異的振蕩特征圖譜，見圖2。

圖2的振蕩圖譜波形各異，表現(xiàn)出因不同種類的中藥其化學(xué)成分不同而具有的個性特征，即特征參數(shù)存在顯著差異。因此，利用振蕩圖譜對中藥進(jìn)行真?zhèn)伪孀R和質(zhì)量評價是一種科學(xué)、有效的新方法。此法與色譜指紋圖譜相比，樣品無需預(yù)處理、操作簡單、檢測時間短，并且能夠給出中藥的群集信息，是一種有效的中藥鑒別手段和質(zhì)量評價方法。

2.6 藥材道地性鑒別

道地藥材系指質(zhì)優(yōu)效佳，源于中醫(yī)藥臨床實踐，與自然條件和生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)，是中藥學(xué)中控制藥材質(zhì)量的一項獨具特色的綜合判別標(biāo)準(zhǔn)。目前，主要以經(jīng)驗判斷或基源(DNA指紋圖譜)檢測等方法[7]，前者缺乏科學(xué)性，而后者檢測手續(xù)繁雜、條件苛刻、成本高。為此，筆者以本研究所建立的振蕩體系對不同產(chǎn)地的白術(shù)、枸杞子和黃芪進(jìn)行了檢測，獲得電化學(xué)指紋圖譜見圖3～4。

如圖3和圖4所示，不同源的同種中藥材的電化學(xué)指紋圖譜形狀相似，說明這些中藥對振蕩反應(yīng)機(jī)理產(chǎn)生影響的化學(xué)成分相同，但Amax、Emin、T等有明顯差異。

表1 空白體系電化學(xué)指紋圖譜的穩(wěn)定性

表2 陳皮電化學(xué)指紋圖譜的重現(xiàn)性

圖2 不同中藥的電化學(xué)指紋圖譜

圖3 不同產(chǎn)地中藥的電化學(xué)指紋圖譜

圖4 不同產(chǎn)地黃芪的電化學(xué)指紋圖譜

這些差異表明，盡管同種藥材所含活性成分的種類大致相同，但由于其生長的自然環(huán)境、耕種方式及采收季節(jié)等不同，導(dǎo)致不同地域的同種中藥活性成分含量存有差異，即定量信息之間存在明顯差異，從而對振蕩體系的擾動程度不同。因此，圖譜的特征參數(shù)存在差異。依此可見，電化學(xué)指紋圖譜用于中藥道地性的鑒別，科學(xué)、簡便、直觀。

2.7 中藥的質(zhì)量評價

中藥振蕩圖譜的波形及內(nèi)涵的特征參數(shù)，不僅與中藥所含化學(xué)成分的種類有關(guān)，還受到其含量多少的影響。在應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)對不同源的同種中藥進(jìn)行質(zhì)量評價時，要求其定性和定量信息之間均存在明顯差異。實驗測定了不同加入量黃芪的電化學(xué)指紋圖譜，在一定的檢測用量范圍內(nèi)，考察定量信息與總活性成分含量的關(guān)系[12]。實驗發(fā)現(xiàn)，其td與m呈良好的線性關(guān)系(td=-2695m+7844，r=0.987)，線性范圍1.0～1.5 g。

分別測試1.0 g內(nèi)蒙古、甘肅、陜西黃芪的電化學(xué)指紋圖譜(見圖4)，根據(jù)黃芪指紋圖譜td與m的關(guān)系，若以內(nèi)蒙黃芪總活性成分為1，則陜西和甘肅黃芪的總活性成分分別為0.962 8、0.860 3。即總活性成分含量：內(nèi)蒙古>陜西>甘肅，符合黃芪道地以“北芪最佳”的說法。在臨床應(yīng)用中，3個產(chǎn)地的黃芪達(dá)到同一療效的用藥當(dāng)量關(guān)系為：

內(nèi)蒙古(1.000 g)=陜西(1.039 g)=甘肅(1.162 g)

2.8 不同部位中藥振蕩圖譜

中藥不同部位的化學(xué)成分及其含量存有差異，因此其各自的功效和藥用價值不同。如全當(dāng)歸既能補(bǔ)血、又可活血，當(dāng)歸尾則為破血，而當(dāng)歸身偏補(bǔ)血和養(yǎng)血之功效。迄今，對同一中藥不同部位的振蕩圖譜鑒別尚未見到相關(guān)的報道。為此，分別測試了全當(dāng)歸、當(dāng)歸尾和當(dāng)歸身的電化學(xué)指紋圖譜，見圖5。

圖5 當(dāng)歸不同部位電化學(xué)指紋圖譜

由圖5可以看出，不同部位的當(dāng)歸其指紋譜圖存在明顯差異，說明不同部位的當(dāng)歸含有的有效成分和含量存在差別，對振蕩體系的擾動作用不同。因此，此法對同種中藥的不同部位可進(jìn)行有效區(qū)分與評價，亦可為全藥材資源的綜合利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

2.9 中藥復(fù)方的指紋圖譜

中藥復(fù)方是指由2味或2味以上藥味的藥效相似或相近的中藥配伍，即所謂“相生”，是中醫(yī)方劑的主體組成部分。如茯苓的功效為利水滲濕、益脾和胃、寧心安神等，黃芪具有補(bǔ)氣生津、保肝、利尿等功效，故兩者可配伍使用；當(dāng)歸與川芎均具有活血行氣、調(diào)經(jīng)止痛的作用，可配伍使用。為此，檢測了2種復(fù)方中藥的電化學(xué)指紋圖譜(見圖6～7)。

圖6 黃芪+茯苓的電化學(xué)指紋圖譜

圖7 當(dāng)歸+川芎的電化學(xué)指紋圖譜

圖6～7顯示，復(fù)方中藥的指紋圖譜與單味中藥的圖譜存在明顯差異，具有其特征性。這可能是由于復(fù)配后活性成分的協(xié)同作用對有機(jī)底物的擾動作用與單味中藥的活性成分存有差異，即對振蕩體系的擾動發(fā)生了改變。此為鑒別同藥效不同組方提供了一種可行的手段。

2.10 不同形態(tài)中藥指紋圖譜

中藥通常以水劑、散劑、丸劑等形態(tài)服用，實踐表明，中藥的形態(tài)與治療之間有著密切關(guān)聯(lián)。故選擇正確的形態(tài)服用，能充分發(fā)揮中藥的藥性及其臨床療效。為此，實驗對不同劑型陳皮的電化學(xué)指紋圖譜進(jìn)行對比分析(見圖8)。

圖8 不同形態(tài)陳皮的電化學(xué)指紋圖譜

由圖8可以看出，同種藥材因所含活性成分相同而具有相似的指紋圖譜，但形態(tài)不同其圖譜間又存在明顯差異，對比空白振蕩體系可知，陳皮為抑制作用。圖8中陳皮汁的振幅Amax最小，抑制作用最強(qiáng)，振蕩期td長，藥效持續(xù)，即熬制使得中藥有效成分充分溶出。驗證了傳統(tǒng)服用中藥的正確性。

2.11 振蕩反應(yīng)機(jī)理

振蕩反應(yīng)通常分為能量積累、能量平衡、能量消耗3個階段，而溫度對各階段產(chǎn)生的影響不同。結(jié)果表明，反應(yīng)速率隨著溫度的升高而加快，使得誘導(dǎo)期和振蕩期明顯縮短。由ln(1/t0)～T-1和ln(1/t)～T-1關(guān)系及Arrhenius式，可求得誘導(dǎo)期和振蕩期反應(yīng)的活化能分別為58.2、67.7 J·mol-1，表明兩者反應(yīng)機(jī)理不同。即振蕩反應(yīng)包含誘導(dǎo)反應(yīng)和振蕩反應(yīng)2個歷程，誘導(dǎo)反應(yīng)為振蕩反應(yīng)積蓄能量，以使體系具有能夠發(fā)生振蕩反應(yīng)的氧化還原電勢(φ氧化/φ還原>1.0 V，相較于飽和甘汞電極)，兩者存在因果關(guān)系。

中藥的有效成分主要包含有多糖、皂苷、黃酮、生物堿、有機(jī)酸及微量元素等，化學(xué)成分十分復(fù)雜，少則數(shù)種，多者可達(dá)近百種。因此，本研究僅以參類藥材中常見的人參皂苷Rh2為例，推測其與振蕩體系的反應(yīng)機(jī)理。

人參皂苷Rh2含有多個醇羥基、1個葡萄糖環(huán)和1個雙鍵，具有一定的還原性，且羥基可與酸發(fā)生酯化反應(yīng)；在體系的催化作用下，可將醇羥基氧化成羰基[13]。根據(jù)B-Z振蕩理論推測機(jī)理如下：

過程1)：Br-離子被氧化為HOBr

過程2)：BrO3-被還原為HOBr2

過程3)：Br-和Ce3+的再生

為了驗證振蕩機(jī)理和中藥對振蕩參數(shù)的擾動，利用Br-選擇性電極在線監(jiān)測空白和加藥后振蕩器中c(Br-)的變化(見圖9～10)。圖9顯示，在空白振蕩體系中，c(Br-)的變化呈典型的B-Z化學(xué)振蕩特征，表明c(Br-)是振蕩反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵因素，控制著反應(yīng)的進(jìn)程和振蕩的循環(huán)過程。圖10表明，中藥的化學(xué)成分(人參皂苷Rh2)與Ce(SO4)2等發(fā)生反應(yīng)，改變了振蕩組分的濃度，導(dǎo)致振蕩圖譜特征參數(shù)發(fā)生變化。在振蕩停止后空白體系c(Br-)逐漸升高，加藥體系則逐漸減小，推測是由于加入中藥發(fā)生化學(xué)反應(yīng)所致。

圖9 空白振蕩體系的Br-振蕩圖譜

圖10 加藥振蕩體系的Br-振蕩圖譜

另外，采用循環(huán)伏安法測定了人參在該振蕩器中的循環(huán)伏安圖。結(jié)果表明，隨著人參加入量的增加，氧化峰電流值逐漸減小(見圖11)，且與氧化峰電流呈良好的線性關(guān)系，r=0.991，說明人參中化學(xué)成分(人參皂苷Rh2)參與體系的振蕩反應(yīng)，改變了振蕩器組分的濃度，由此也佐證了2.7所得td～m關(guān)系的正確性。

圖11 不同加藥量的循環(huán)伏安圖

3 結(jié)論

非線性電化學(xué)指紋圖譜既體現(xiàn)了中藥“君臣佐使、升降浮沉”的群集信息，又反映了不同中藥之間“相生相克”的協(xié)同效應(yīng)，亦體現(xiàn)了以“整體性”和“模糊性”為顯著特證評價中藥材質(zhì)量的要求。因此，可廣泛用于中藥的真?zhèn)巫R別、道地性鑒定以及質(zhì)量的定性定量評價。

本研究建立KBrO3-Ce(SO4)2-H2SO4-檸檬酸振蕩體系及其最佳測試條件：0.04 mol·L-1KBrO3、0.01 mol·L-1Ce(SO4)2、0.55 mol·L-1H2SO4、0.01 mol·L-1檸檬酸，溫度(37±1)℃、攪拌速率100 r·min-1、浸出時間 15 min、中藥加入量1.0 g·(50 mL)-1。圖譜穩(wěn)定重現(xiàn)、直觀明了、特異性顯著；方法簡便、快速、靈敏、有效，無需預(yù)處理試樣，具有推廣價值。