李明玥，劉金欣，王銘昕，黃秋陽，石林春*，馬莉*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 國家中醫(yī)藥管理局資源保護(hù)重點研究室 中藥資源教育部工程中心，北京 100193；2. 友搏藥業(yè)微山水蛭養(yǎng)殖基地，山東 濟(jì)寧 277600；3. 首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069

寬體金線蛭WhitmaniapigraWhitman，俗稱螞蟥，其干燥全體可作為中藥材水蛭在臨床上使用[1]。水蛭是我國傳統(tǒng)的活血化瘀藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，藥性峻猛，具有破血通經(jīng)、逐瘀消癥的功效，主治血瘀經(jīng)閉、癥瘕痞塊、中風(fēng)偏癱、跌打損傷[1]。現(xiàn)代研究表明水蛭具有改善血液流變學(xué)、抗凝血、抑制血栓形成、抗腫瘤等藥理活性[2-14]。我國以水蛭為原料的中成藥有90余種，其中脈血康膠囊、疏血通注射液、通心絡(luò)片、腦血康滴丸等中成藥被納入2019年《國家基本醫(yī)療保險、工傷保險和生育保險藥品目錄》。除脈血康膠囊等少數(shù)中成藥明確使用日本醫(yī)蛭HirudonipponicaWhitman外，多數(shù)中成藥實際以寬體金線蛭入藥。通常認(rèn)為寬體金線蛭不含水蛭素類成分，其藥用有效成分的研究一直受到關(guān)注。Zhong等[15]利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離得到分子量為8608 Da的抗凝血多肽(whitmanin)。Liu等[16]從寬體金線蛭中分離得到長度為30個氨基酸的新型抗血栓多肽(WP-30)，可選擇性抑制由凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集作用。

據(jù)世界衛(wèi)生組織全球疾病負(fù)擔(dān)報告分析，自1990年起全球因心血管疾病致死的人數(shù)顯著增長[17-19]，水蛭作為治療心血管疾病的常用中藥，其需求量逐年增加，2009—2016年進(jìn)入快速增長期，價格由2009年約400元/kg上漲至1000元/kg以上[20]。捕撈野生寬體金線蛭的收入超過了一般農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，使越來越多的人去捕撈野生寬體金線蛭。無序、過度捕撈破壞了寬體金線蛭的可持續(xù)發(fā)展，加之工農(nóng)業(yè)污染導(dǎo)致寬體金線蛭的生境被破壞，野生寬體金線蛭的資源儲量日益減少。自2008年起，由于中成藥研發(fā)和生產(chǎn)需求旺盛，水蛭藥材的用量以每年約30 t遞增[20-24]，而我國野生水蛭產(chǎn)量以每年15%～20%的速度遞減，日益枯竭的水蛭野生資源和不斷增長的生產(chǎn)需求形成了嚴(yán)重的供需矛盾，人工養(yǎng)殖將成為水蛭藥材來源的重要補(bǔ)充。然而，寬體金線蛭的人工繁育技術(shù)尚不成熟，多數(shù)養(yǎng)殖基地以野外采集的寬體金線蛭“青年苗”進(jìn)行生產(chǎn)，現(xiàn)有研究主要集中于溫度等因素對寬體金線蛭幼苗生長速度的影響[25-29]、不同采收時間和炮制方法等因素對藥材采收質(zhì)量的影響[30-34]、養(yǎng)殖基地農(nóng)藥與重金屬污染對水蛭質(zhì)量的影響[35]、高溫環(huán)境下生病螞蟥的病原分析[36]等下游環(huán)節(jié)，在寬體金線蛭種蛭篩選方面尚缺乏系統(tǒng)研究。此外，寬體金線蛭產(chǎn)繭后再入水死亡率較高，養(yǎng)殖價值低，生產(chǎn)中通常將產(chǎn)繭后的寬體金線蛭制成藥材銷售，其藥材質(zhì)量尚缺乏系統(tǒng)評價標(biāo)準(zhǔn)。

微山湖是寬體金線蛭的主產(chǎn)區(qū)之一，歷史上其產(chǎn)量曾占全國總產(chǎn)量的60%以上。本研究以微山湖地區(qū)的寬體金線蛭野生種群為研究對象進(jìn)行群體考察，嘗試建立寬體金線蛭種蛭篩選原則，并對產(chǎn)繭后藥材進(jìn)行質(zhì)量評價，為寬體金線蛭人工養(yǎng)殖種蛭篩選提供科學(xué)依據(jù)，同時也為春產(chǎn)水蛭藥材的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 樣品

實驗用寬體金線蛭為2018年4月在山東省棗莊市微山湖地區(qū)漁民捕撈所得，共計1193條，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所石林春副研究員鑒定為真蛭亞綱(Euhirudinea Lukin)無吻蛭目(Arhynchobdellida Blanchard)黃蛭科(Haemopidae Sawyer)金線蛭屬(WhitmaniaBlanchard)寬體金線蛭WhitmaniapigraWhitman。所有水蛭養(yǎng)在裝有防逃設(shè)施的塑料容器內(nèi)，每隔2 d換1次水，養(yǎng)殖用水為經(jīng)充分曝氣24 h以上的自來水。

1.2 儀器和試藥

移液槍(德國Eppendorf公司)；TD20002電子天平(天津天馬儀器廠)；精密電子天平PL203(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Sartorius PB-10pH計(德國賽多利斯公司)；LUX-24數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京陸希科技有限公司)；3K15型離心機(jī)(德國Sigma公司)；超純水儀(美國Millipore公司)。

三羥甲基氨基甲烷(AMRESCO，批號：2201C465)；凝血酶(SigmaT4648,批號：SLBV3604),牛纖維蛋白原(SolarbioF8050，批號：523C021)；水為超純水；其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 群體特征考察與試驗分組

使用電子天平對1193條寬體金線蛭依次稱量體質(zhì)量，根據(jù)其生殖環(huán)帶顏色的深度和寬度判斷是否完成受精，從而考察微山湖地區(qū)寬體金線蛭的群體分布特點，根據(jù)群體特征考察結(jié)果將寬體金線蛭分為10 g(8～12 g)、15 g(13～17 g)、20 g(18～22 g)3個試驗組，每組不少于30只。

2.2 繁殖池

為了便于計數(shù)、防止不同試驗組間寬體金線蛭逃竄，繁殖池使用60目的尼龍網(wǎng)制成上端開口的長方形網(wǎng)兜(見圖1)，網(wǎng)兜中裝入適量土壤，在網(wǎng)兜外部堆積適量土壤以達(dá)到保溫保濕作用，產(chǎn)繭期間除適量澆水以保持適宜土壤濕度外，不作過多干擾，使其自然產(chǎn)繭。同時，為減少頻繁檢查對種蛭產(chǎn)繭的擾動，設(shè)置1個參照組以實時查看卵繭的成熟度，結(jié)合寬體金線蛭胚胎發(fā)育時相，選擇適宜的挖繭時機(jī)。

圖1 寬體金線蛭的繁殖池

2.3 繁殖性能考察指標(biāo)

2.3.1產(chǎn)繭數(shù) 當(dāng)參照組中60%的卵繭都處于發(fā)育中晚期時，挖出每個試驗組繁殖池中的卵繭，獨立計數(shù)，統(tǒng)計卵繭的總數(shù)目，以每個寬體金線蛭平均產(chǎn)得的卵繭數(shù)目作為該試驗組的產(chǎn)繭數(shù)。

2.3.2繭體積 從每個試驗組中隨機(jī)挑選50%的卵繭，使用游標(biāo)卡尺測量卵繭的長和寬，并計算平均值。

2.3.3出苗數(shù) 從每個試驗組中隨機(jī)挑選20個處于發(fā)育晚期的卵繭，在卵繭的較尖一端小心開口，用蒸餾水將寬體金線蛭的幼苗從卵繭中沖刷至培養(yǎng)皿中，獨立計數(shù)，計算平均值。

2.4 產(chǎn)繭后水蛭藥材質(zhì)量質(zhì)量評價

依照《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)對上述3個試驗組產(chǎn)繭前后的水蛭藥材分別進(jìn)行性狀觀察和抗凝血酶活性測定。

精密稱定寬體金線蛭待測樣品粉末(過三號篩)1 g，精密加入0.9%氯化鈉溶液5 mL，充分?jǐn)嚢瑁?0 min，并時時振搖，5000 r·min-1(離心半徑7.6 cm) 離心15 min，精密量取上清液100 μL于2 mL離心管中，加入含0.5%牛纖維蛋白原的Tris-HCl緩沖液(現(xiàn)用現(xiàn)配)200 μL，混合均勻，置于37 ℃水浴溫浸5 min，滴加凝血酶(10 U·mL-1，每4 min滴加1次，每次2 μL，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積，計算各樣品對應(yīng)的抗凝血酶活性。

3 結(jié)果

3.1 微山湖地區(qū)寬體金線蛭野生種群特征考察

共采集寬體金線蛭1193條，其體質(zhì)量的平均值為(11.17±5.51)g，中位數(shù)為9.68 g，第一和第三四分位數(shù)分別為7.26和13.58，體質(zhì)量總體偏小。體質(zhì)量<6 g的寬體金線蛭有151條，占比12.66%；體質(zhì)量≥10 g的寬體金線蛭有567條，占比47.53%；體質(zhì)量≥15 g的寬體金線蛭有233條，占比19.53%。寬體金線蛭的生殖環(huán)帶位于24～42環(huán)，完成受精后的生殖環(huán)帶呈現(xiàn)金黃色(見圖2A)，生殖環(huán)帶的顏色、深度和寬度隨寬體金線蛭體質(zhì)量的增加而加深和變寬，體質(zhì)量<6 g的寬體金線蛭多數(shù)生殖環(huán)帶不明顯，體質(zhì)量≥10 g的寬體金線蛭均能觀察到較明顯的生殖環(huán)帶，體質(zhì)量≥15 g寬體金線蛭的生殖環(huán)帶顏色顯著加深和變寬，觸之可迅速蜷縮成球，并呈現(xiàn)較強(qiáng)的彈性(見圖2 B～C)。

注：A.具有生殖環(huán)帶的寬體金線蛭；B.受到刺激蜷縮成球(腹部)；C.受到刺激蜷縮成球(背部)。圖2 寬體金線蛭的形態(tài)特征

寬體金線蛭生殖環(huán)帶的成熟度與體質(zhì)量關(guān)系密切，本研究根據(jù)群體特征將其分成3個試驗組：10 g組(8～12)g、15 g組(13～17) g、20 g組(18～22)g，在群體中的數(shù)目分別為395、148、114條。

3.2 體質(zhì)量對寬體金線蛭繁殖性能的影響

生殖環(huán)帶發(fā)育成熟的寬體金線蛭入土約1周后即可產(chǎn)繭，卵繭的發(fā)育周期約為3～4周，卵繭的成熟度使用自制的LED燈箱進(jìn)行檢測，大致分為早、中、晚3個時期(見圖3A～C)，早期卵繭呈粉紅色，繭液在LED燈下清亮透明，中期卵繭呈棕黃色，在LED燈下可觀察團(tuán)狀胚胎陰影，后期卵繭變空，肉眼可觀察到黑褐色寬體金線蛭幼體。3個時期分別對應(yīng)發(fā)育時相的囊胚期、體節(jié)期和孵化期。囊胚期(見圖3 D)在卵裂作用下細(xì)胞數(shù)快速增加，前期體積無明顯變化，后期經(jīng)原腸運動，卵黃細(xì)胞被完全包被在胚胎內(nèi)部，形成卵黃合胞體層；在體節(jié)期(見圖3 E)完成體節(jié)分化、神經(jīng)管形成、前后吸盤和其他器官原基開始出現(xiàn)；孵化期(見圖3 F)完成器官的最終發(fā)育，并孵化為可以自由游動的寬體金線蛭幼體[37-39]。

本研究在卵繭發(fā)育的晚期進(jìn)行挖繭作業(yè)。3個試驗組的產(chǎn)繭數(shù)差異明顯，分別為3.7、4.5、5.9個，20 g組的產(chǎn)繭數(shù)是10 g組的1.59倍。繭體積雖然隨寬體金線蛭體質(zhì)量的增加而變大，但差異并不明顯，繭的長度為19.11～21.10 mm，繭的寬度為14.19～16.30 mm(見圖4)。從出苗數(shù)來看，各試驗組內(nèi)卵繭的個體間均存在一定的差異，在箱形圖上均呈現(xiàn)較寬的分布區(qū)間，20 g組單個繭平均出苗37.3條，是10 g組的1.45倍(見圖5)。

注：A.早期發(fā)育階段的卵繭；B.中期發(fā)育階段的卵繭；C.晚期發(fā)育階段的卵繭；D.囊胚期；E.體節(jié)期；F.孵化期。圖3 不同發(fā)育階段的卵繭和不同發(fā)育時相的寬體金線蛭

圖4 不同體質(zhì)量組寬體金線蛭卵繭體積

圖5 不同體質(zhì)量組寬體金線蛭卵繭出苗數(shù)

3.3 寬體金線蛭產(chǎn)繭后藥材的質(zhì)量評價

3個試驗組的寬體金線蛭在產(chǎn)繭后體質(zhì)量損失率接近，處于54%～59%，18～22 g試驗組的體質(zhì)量平均值由20.59 g減少到8.71 g，各試驗組的存活率存在較顯著差異，20 g組的存活率是10 g組的1.44倍(見表1)。寬體金線蛭產(chǎn)繭后體質(zhì)明顯變差，吊干后藥材的質(zhì)量變輕，寬度變窄，厚度僅為產(chǎn)繭前藥材厚度的48.98%～71.79%，但藥材的長度變化并不明顯(見表2)。背部顏色變化不明顯，但腹部顏色由棕黃色變?yōu)楹谧厣?見圖6)。藥材的腥味略有下降，斷面顏色變深，較產(chǎn)繭前難折斷，脆度下降。采用凝血酶滴定法測定各組藥材的抗凝血酶活性后發(fā)現(xiàn)，各組每l g藥材含抗凝血酶活性為3～5 U(見表3)，產(chǎn)繭前后抗凝血酶活性變化不大(結(jié)果詳見表3)，均符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

表1 不同體質(zhì)量分組的寬體金線蛭產(chǎn)繭前后的變化

注：A.10 g組(產(chǎn)繭前)；B.15 g組(產(chǎn)繭前)；C.20 g組(產(chǎn)繭前)；D.10 g組(產(chǎn)繭后)；E.15 g組(產(chǎn)繭后)；F.20 g組(產(chǎn)繭后)。圖6 產(chǎn)繭前后藥材性狀比較

表2 產(chǎn)繭對寬體金線蛭藥材性狀的影響

表3 產(chǎn)繭對寬體金線蛭抗凝血酶活性的影響

4 討論

4.1 寬體金線蛭的種群特點與種蛭篩選原則

種蛭篩選是寬體金線蛭養(yǎng)殖的重要環(huán)節(jié)，本研究表明水蛭的產(chǎn)繭數(shù)、出苗數(shù)等主要繁殖性能指標(biāo)隨寬體金線蛭體質(zhì)量的增加而顯著提高，20 g組可獲得的幼蛭數(shù)目為同等種蛭數(shù)目10 g組可獲得的幼蛭數(shù)的231.43%，種蛭的死亡率也更低，相差約4.1倍。使用體質(zhì)量大的水蛭進(jìn)行繁殖將獲得更多的幼蛭，損失的水蛭也較少，史紅專等[28]推薦人工養(yǎng)殖時應(yīng)選擇體質(zhì)量在20 g左右的寬體金線蛭作為種蛭。但是，體質(zhì)量≥20 g的寬體金線蛭僅占野生種群的9.05%，若以整個種群進(jìn)行計算，10、15、20 g組可分別獲得3.8、2.1、2.5萬條幼蛭。因此，僅使用≥20 g的寬體金線蛭進(jìn)行繁殖并不現(xiàn)實、也不經(jīng)濟(jì)，可以使用≥20 g的寬體金線蛭構(gòu)建良種選育群體[40]，建議以15 g及以上的寬體金線蛭進(jìn)行繁殖生產(chǎn)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)微山湖地區(qū)野生寬體金線蛭的體質(zhì)量普遍較小，有超過30%的寬體金線蛭體質(zhì)量<8 g，這表明微山湖地區(qū)野生寬體金線蛭的種群有退化趨勢，成年水蛭、特別是體質(zhì)量較大的多年生寬體金線蛭數(shù)量較少，這與微山湖地區(qū)過度捕撈及生態(tài)環(huán)境惡化有關(guān)，有研究指出微山湖地區(qū)的重金屬污染已達(dá)到重度污染水平[41]，有機(jī)氯農(nóng)藥污染水平也高于國內(nèi)其他地區(qū)湖泊[42]，相關(guān)部門應(yīng)在微山湖地區(qū)“退漁還湖”背景下加強(qiáng)對寬體金線蛭捕撈的科學(xué)指導(dǎo)，春秋“捕大放小”、夏季禁止捕撈。對微山湖地區(qū)寬體金線蛭進(jìn)行群體考察，不僅能為制定合理的寬體金線蛭種蛭篩選原則提供科學(xué)依據(jù)，從而提高人工養(yǎng)殖的效率，同時也能反映微山湖地區(qū)寬體金線蛭的種群特點，為相關(guān)部門加強(qiáng)對寬體金線蛭捕撈的科學(xué)指導(dǎo)提供參考意見。

4.2 產(chǎn)繭對水蛭藥材質(zhì)量的影響

由于越冬技術(shù)不成熟，生產(chǎn)中常以野外捕撈的寬體金線蛭進(jìn)行繁殖育苗，通常不進(jìn)行分揀直接入土繁殖，產(chǎn)繭后多數(shù)寬體金線蛭觸之不能很快成球，直接死亡率約30%，入水后死亡率可達(dá)70%以上，因此多數(shù)養(yǎng)殖戶將產(chǎn)繭后的水蛭直接加工成藥材進(jìn)行銷售。此時，藥材的厚度明顯變薄，僅為產(chǎn)繭前藥材厚度的50%或更低，脆度降低，這可能與寬體金線蛭產(chǎn)繭過程中消耗能量過多導(dǎo)致體質(zhì)變差，吊干時寬體金線蛭肌肉彈性降低有關(guān)。產(chǎn)繭前后藥材的抗凝血酶活性變化不大，均為3～5 U·g-1，但低于歐興長等[43]測定的寬體金線蛭藥材抗凝血酶活性，與單宇等[3]以及丁月珠等[44]的研究接近。吳曼郡等[45]的研究表明寬體金線蛭的抗凝血酶活性與其吸食密切相關(guān)，吸食后第5天達(dá)到最高值14.67 U·g-1，第11天降低到6.50 U·g-1。寬體金線蛭的冬眠時間約為3～4個月，冬眠期間頭部和尾部彎曲呈“彎月”狀，不食不動，呼吸代謝和消化代謝非常微弱[46-47]，春季為寬體金線蛭抗凝血酶活性的低谷期。同時，《名醫(yī)別錄》[48]記載，水蛭“五月、六月采”，相當(dāng)于公歷的6、7月份，《中國藥典》也規(guī)定水蛭的采收時間為夏、秋兩季。此外，春季是寬體金線蛭的繁殖期，大肆捕撈野生寬體金線蛭會對其生存造成毀滅性破壞，不利于寬體金線蛭野生資源的可持續(xù)發(fā)展。因此，不建議春季進(jìn)行野生水蛭藥材采收，產(chǎn)繭后所獲得的藥材也不建議作為臨床飲片使用。