龔瑩 ，王?；?，馬思遠(yuǎn)，林雨彬 ，刁曉平, *

1. 海南大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，海南 海口 570228；2. 海南大學(xué)南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 海口 570228；3. 海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 海南 海口 571158

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）作為一種廣泛存在于自然界中的污染物，對生物具有普遍的致癌性、致畸性及致突變性（Blumer，1976）；又因其疏水性較難被分解利用，能在環(huán)境中長時間存在積累（Ribes et al.，2003）而受到廣泛關(guān)注。地表徑流和大氣是PAHs傳輸?shù)闹饕緩剑t樹林生態(tài)系統(tǒng)處于海洋、陸地、大氣的動態(tài)交界面，使其更易積累來自三方的污染。已有研究表明紅樹林表層沉積物中 PAHs的積累量較大，眾多紅樹林超過1500 ng·g?1，香港紅樹林 PAHs濃度超過5000 ng·g?1，印度塔那溪紅樹林超過 1600 ng·g?1（Sukhdhane et al.，2015；Domínguez et al.，2010；Klekowski et al.，1994；Tam et al.，2001；Wang et al.，2015；Wu et al.，2014）。由于紅樹林環(huán)境較為特殊且復(fù)雜，在長期的自然選擇下形成了獨特而又豐富的微生物類群（龍寒等，2005）。

目前去除PAHs的方法主要有物理、化學(xué)及微生物處理方法。微生物降解PAHs具有低成本，環(huán)境安全性高等優(yōu)點，已成為PAHs污染修復(fù)的重要技術(shù)（陳錚等，2019）。研究表明可從有PAHs污染的環(huán)境中篩選得到PAHs降解菌，已有許多研究從焦化廠、碼頭等存在PAHs污染的不同環(huán)境介質(zhì)中篩得PAHs降解菌（Arias et al.，2017；李曉斌等，2010；徐虹等，2004）。此類研究多關(guān)注單一降解菌的降解特性，但由于單菌對PAHs的降解能力有限，且環(huán)境中微生物和PAHs均不是單獨存在，故研究PAHs降解菌群具有更好的應(yīng)用前景。

中國紅樹林面積共有1.5×104hm2，海南是主要的紅樹林分布區(qū)之一，面積4638 hm2，占全國紅樹林總面積的33%（陳綿俊，1996；嚴(yán)承高等，1999）。已有研究從海南東寨港等地紅樹林沉積物中檢出PAHs（Qiu et al.，2018；Zhang et al.，2018）。故本研究希望能從海南不同紅樹林分布區(qū)的沉積物中篩選PAHs的降解菌群比較PAHs的降解菌群降解特征，并闡明菌群降解率和菌群結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，為環(huán)境中PAHs污染區(qū)域修復(fù)提供理論依據(jù)。得到對PAHs降解較為高效的菌群，基于其結(jié)構(gòu)為提高PAHs污染修復(fù)效率提供一定參考。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 采樣

于2018年8—9月，從海南紅樹林分布區(qū)域(澄邁、儋州、東寨港、三亞、文昌)采集了24個樣點的紅樹林表面0—5 cm沉積物樣品。每個采樣點設(shè)置10 m×10 m的正方形樣方，采用五點采樣法進(jìn)行樣品采集，5個樣品混合均勻后置于冰盒中當(dāng)天運回實驗室進(jìn)行菌群富集實驗。采樣點如圖1所示。

1.1.2 儀器試劑

儀器：高效液相色譜（HPLC）、氮吹儀、PCR儀、凝膠成像儀、純水機。

試劑：菲（3-環(huán)）、芘（4-環(huán)）、苯并(a)芘（5-環(huán)）、乙酸乙酯（分析純）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、10%鹽度海水（由陳海水配制）、二甲基亞砜（DMSO）。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

無機鹽（MSM）培養(yǎng)基：K2HPO41 g，NaH2PO41 g，CaCl20.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，NH4NO31 g 溶于蒸餾水中并定容至1 L，調(diào)pH至7.0，滅菌待用。

營養(yǎng)（LB）培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g溶于蒸餾水中并定容至1 L，調(diào)pH至7.0，滅菌待用。

PAHs A培養(yǎng)基：在滅菌后的錐形瓶中分別加入 1 mL 菲（1 mg·mL?1）、1 mL 芘（1 mg·mL?1）及 0.5 mL 苯并(a)芘（0.5 mg·mL?1）的 DMSO 溶液，待DMSO揮干后加入50 mL MSM。

圖1 采樣點Fig. 1 Sampling sites

PAHs B培養(yǎng)基：將菲、芘、苯并(a)芘三類PAHs混合液（溶劑為DMSO）加至50 mL MSM培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中的菲、芘、苯并(a)芘的終濃度分別為 20、20、5 mg·L?1。

PAHs C培養(yǎng)基：PAHs平板篩選培養(yǎng)基，于MSM平板培養(yǎng)基上涂布PAHs A培養(yǎng)基使用的3種PAHs DMSO 溶液，菲（100 μL）、芘（100 μL）、苯并(a)芘（50 μL），揮盡DMSO待用。

1.2 降解菌群富集及其降解率測定

1.2.1 菌群富集

取沉積物樣品5 g，置于45 mL滅菌海水（鹽度10%）中振蕩30 min，后靜置5 min，取5 mL上清至45 mL PAHs A培養(yǎng)基中，每個采樣點設(shè)3個重復(fù)。在30 ℃，130 r·min?1轉(zhuǎn)速下進(jìn)行避光培養(yǎng)，培養(yǎng)至14 d后，取5 mL富集液轉(zhuǎn)接至PAHs A培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接4代，得到混合菌群。

1.2.2 PAHs的提取及分析

取 4 mL 第 4 代的菌液 6000 r·min?1離心 6 min獲得菌體，用500 μL MSM懸浮菌液后加入培養(yǎng)基中，以不接種菌液的PAHs B培養(yǎng)基為空白對照，以菌群富集的相同條件培養(yǎng)14 d后，用50 mL乙酸乙酯振蕩2 min萃取殘留的PAHs。萃取液過濾（0.22 μm濾膜）取1 mL，氮吹干后用乙腈（色譜純）定容至1 mL，待HPLC測定。

分析儀器為HPLC（Agilent 1260），菲、芘、苯并(a)芘分別使用250、239、295 nm波長檢測，進(jìn)樣量為5 μL，流動相為超純水：乙腈（40：60），流速為 1 mL·min?1。

1.3 菌株分離鑒定

將富集得到的混合菌群用PAHs C培養(yǎng)基培養(yǎng)1代后同種培養(yǎng)基劃線分離一代，再用LB平板劃線分離純化得到單一菌落，鏡檢菌體，再提取得到的單菌落DNA，以27F 5′-AGAGTTTGATCATGGC TCAG-3′， 1492R 5′-TAGGGTTACCTTGTTACG ACTT-3′為引物PCR，將PCR產(chǎn)物送樣測序（天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司）。測序結(jié)果在NCBI上blast比對分析，挑選出同源序列，選擇相似性較高的序列，并利用Mega軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 不同樣點混菌的降解率

通過對各個采樣點混合菌群降解率的測定，發(fā)現(xiàn)本研究區(qū)域中所有菌群對3種PAHs的平均降解效率以菲（79%）最高，其次是芘（77%），最低為苯并(a)芘（23%），結(jié)果如表1所示。其中，菌群對菲的降解率以Q15最高：95%，Q23最低：14%；菌群對芘的降解率以Q12最高：94%，Q23最低：35%；而菌群對苯并(a)芘的降解率則是 Q9最高：50%，Q19最低僅2%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)菲和芘的降解率沒有顯著性差異（P>0.05），而苯并(a)芘的降解率顯著低于菲和芘的降解率（P<0.05）。

表1 混合菌群降解率Table 1 The degradation rates of PAHs by microflora

2.2 混合菌群的群落結(jié)構(gòu)分析

采用分離培養(yǎng)的方法得到的菌群組成如表2所示。其中菲降解率最高的Q15菌群篩得貪噬菌1株，劍菌1株；菲降解率最低的Q23菌群篩得假單胞菌2株，伯克氏菌3株。芘降解率最高的Q12菌群篩得伯克氏菌1株，鞘脂單胞菌1株；芘降解率最低的Q23菌群篩得假單胞菌2株，伯克氏菌3株。對苯并(a)芘的降解率較高共篩得5個菌群，其中對苯并(a)芘降解率最高的為Q9菌群（49.7%），篩得申氏桿菌2株；其次是Q16菌群（48.7%），篩得鞘氨醇桿菌1株，申氏桿菌1株，食酸菌1株，螺旋菌1株；Q3（45.7%）篩得假單胞菌3株；Q15菌群（39.3%）篩得貪噬菌1株，劍菌1株；Q4菌群（33.7%）篩得鞘脂單胞菌1株，申氏桿菌1株，貪噬菌2株。

表2 不同PAHs降解菌群的群落組成Table 2 The composition of degradation bacteria

本研究從富集到的 24個菌群中共分離得到了81株P(guān)AHs降解菌，通過對16S rDNA測序結(jié)果進(jìn)行blast對比，確認(rèn)篩得的81株菌屬于23個屬60個種，除兩株為厚壁菌門外，其余為變形菌門。菌群Q16有1株菌DAC9的序列與最相近的，可能是潛在的新菌。所有篩得降解菌的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。系統(tǒng)發(fā)育樹主要可分為 5簇，其中申氏桿菌屬（Shinella）、劍菌屬（Ensifer）、雙頭菌屬（Labrys）、鞘脂單胞菌屬（Sphingopyxis）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingobium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、固氮螺旋菌屬（Azospirillum）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、螺旋菌屬（Spirosoma）、假黃色單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）為一簇。假黃色單胞菌屬DC2單成一簇。伯克氏菌屬（Burkholderia）、潘多拉菌屬（Pandoraea）、青枯菌屬（Ralstonia）為一簇。貪噬菌屬（Variovorax）、假食酸菌屬（Pseudacidovorax）、食酸菌屬（Acidovorax）、嗜脂環(huán)物菌屬（Alicycliphilus）、Diaphorobacter屬為一簇?？ㄋ固靥m尼菌屬（Castellaniella）、噬染料桿菌屬（Pigmentiphaga）、無色桿菌屬（Achromobacter）為一簇。

3 討論

迄今為止，已有研究報道從不同環(huán)境介質(zhì)中篩選得到多種對PAHs有降解能力的微生物，現(xiàn)已篩選得到70多個屬，200多株對PAHs有利用能力的微生物，包括微藻、真菌、細(xì)菌等，其中真菌和細(xì)菌占多數(shù)（Arias et al.，2017）。且很多PAHs降解菌是從紅樹林沉積物中篩得的，如：福建九龍江河口紅樹林（駱苑蓉等，2005）、香港米埔紅樹林（殷波等，2005）、珠海淇澳島紅樹林（李玫等，2011）、廣州番禺蓮花山紅樹林（李玫等，2012）等，篩得黃桿菌、假單胞菌、弧菌、紅球菌、鞘氨醇單胞菌等PAHs降解菌。從大西洋洋中脊表層沉積物中篩得由鹽單胞菌屬、食烷菌屬、海旋菌、Tistrella屬組成的PAHs混合物（萘、菲、芘）降解菌群（崔志松等，2009）。從廣州石化廠篩得的由假單胞菌屬和潘多拉菌屬組成的菌群 GP3對芘有較強降解能力（陳曉鵬等，2008）。從油污土壤中篩得由桿菌屬、鹽單胞屬、泛菌屬、假單胞菌屬菌組成的降解菌群分別對 25 mg·L?1的菲和芘在 15 d時降解75.3%和52.0%，略低于本研究Q15、Q16等菌群（宋立超等，2012）。本研究在海南紅樹林沉積物中篩得PAHs降解菌種類與上述研究存在一定差異，可能是由于篩選環(huán)境、微生物類群、篩選底物、篩選濃度等多種因素的差異共同導(dǎo)致。本研究篩得雙頭菌屬雖王守志等人用混合 PAHs（菲、熒蒽、芘）及 Ma et al.（2010）和 Wang et al.（2012）用混合PAHs（菲、芘、苯并(a)芘）篩選所得菌群中含有雙頭菌屬，但未對其本身降解特性進(jìn)行研究，而本研究篩得螺旋菌屬及卡斯特蘭尼氏菌屬的細(xì)菌對PAHs的降解特性少有報道，其他所得菌屬中已有研究的如表3所示。基于傳統(tǒng)培養(yǎng)分離得到的菌是菌群中優(yōu)勢菌屬（Huang et al.，2008），有研究指出的降解菌有一定的降解偏好（李曉明等，2012），結(jié)合表1、表2的結(jié)果，菌群Q11僅篩得伯克氏菌3株，Q19僅篩得貪噬菌2株，Q21僅篩得1株鞘脂單胞菌，推測伯克氏菌屬、貪噬菌屬和鞘脂單胞菌屬偏好降解中 3-、4-環(huán) PAHs（菲和芘），說明菌群中優(yōu)勢菌屬的降解偏好一定程度上影響了菌群降解能力。菌群Q9僅篩得申氏桿菌2株，其苯并(a)芘降解率最高（49.7%），Q4、Q16對苯并(a)芘降解率接近Q9，這兩個菌群中均篩得申氏桿菌，故說明申氏桿菌對于苯并(a)芘的降解可能有重要作用。

圖2 所得降解菌進(jìn)化樹Fig. 2 Neighbor-Joining phylogenetic tree of PAHs-degrading bacteria and their closest NCBI (BLAST) relatives based on 16S rRNA gene sequences

芽孢桿菌是已知的能降解苯并(a)芘的菌屬之一（Cerniglia，1992），假單胞菌屬降解菌多降解低環(huán)PAHs，對高環(huán)PAHs也有一定降解能力（Chebbi et al.，2017；Zhao et al.，2009），與 MS（鞘氨醇桿菌）相似度達(dá) 99%的菌株Sphingobium barthaii可降解菲、熒蒽、苯并[a]蒽等高分子量PAHs（Saraf et al.，2019），結(jié)合表3和圖2發(fā)現(xiàn)降解偏好相似的菌屬可聚做一簇。菌群Q1、Q2 3種PHAs降解率相似，Q1篩得假單胞菌 2株，假黃色單胞菌 1株，雙頭菌1株；Q2篩得假單胞菌3株，假黃色單胞菌1株，假食酸菌1株。Q1、Q2兩個菌群篩得菌屬相似及篩得的假單胞菌聚為一簇，表明群落結(jié)構(gòu)相似的菌群其降解能力相似，進(jìn)化距離相近的菌可能具有相近的功能。菌群 Q5、Q18均篩得潘多拉菌，且兩個菌群對菲和芘的降解率相近，推測潘多拉菌屬偏好于降解菲和芘。僅菌群Q23由假單胞菌屬和伯克氏菌屬組成，對3種PAHs降解率均低，說明這兩個菌屬對PAHs的降解可能存在相互抑制的作用。菌群Q7、Q12、Q22均篩得嗜脂環(huán)物菌，但Q12對菲、芘的降解率高于其余兩個菌群，因此鞘脂單胞菌屬和嗜脂環(huán)物菌屬可能相互促進(jìn)對菲、芘的降解?；诰篞15、Q12的降解結(jié)果，推測貪噬菌屬和劍菌屬共同存在時利于菲的降解，伯克氏菌屬與鞘脂單胞菌屬共同存在時利于芘的降解。由李曉明等（2012）在 2012年的研究可知降解菌單獨存在時一般只適合低分子量PAHs的降解，但在菌群中則可能能降解更多分子量 PAHs，故雖Q5、Q6、Q8、Q11等菌群中沒有篩得能直接利用高分子量PAHs的菌屬但對苯并(a)芘也有一定利用能力。

表3 已報道的PAHs降解菌屬及降解能力Table 3 PAHs degradation strains and the microbial transformation ability

4 結(jié)論

在對PAHs的研究中，認(rèn)為低環(huán)的PAHs更易被微生物利用，在本研究中所篩菌群的降解率再次驗證此規(guī)律。海南紅樹林沉積物中存在多種 PAHs降解菌，其中雙頭菌屬、螺旋菌屬及卡斯特蘭尼氏菌屬對PAHs的降解特性少有報道，DAC9與最相近的菌株（Spirosoma terrae）相似度僅為97%，可能是潛在的新菌。菌群Q15菲降解率最高達(dá)95.3%，菌群Q12芘降解率最高為94%，Q9苯并芘降解率最高為49.7%。貪噬菌屬和劍菌屬共同存在時可能利于菲的降解，伯克氏菌屬與鞘脂單胞菌屬共同存在時可能利于芘的降解，鞘脂單胞菌屬和嗜脂環(huán)物菌屬可能能相互促進(jìn)對菲、芘的降解，潘多拉菌屬可能能抑制寡養(yǎng)單胞菌對苯并(a)芘的降解能力，申氏桿菌對于苯并(a)芘的降解可能有重要作用，假單胞菌屬和伯克氏菌屬可能存在相互抑制作用，這些推測需實驗進(jìn)一步驗證。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)的局限性，菌群中其他可能對PAHs降解有重要作用的菌未分離得到，且菌群中菌間相互作用尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。