邱凱華，李曉駒，方淑梅，梁喜龍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319）

由于真核生物的結(jié)構(gòu)基因是外顯子與內(nèi)含子相互間隔但又連續(xù)鑲嵌排列而成的斷裂基因，其轉(zhuǎn)錄生成的mRNA 前體（pre-mRNA）并不能作為轉(zhuǎn)錄的模板，必須經(jīng)過剪接加工，去除內(nèi)含子，同時(shí)將外顯子連接起來形成成熟的mRNA 才能發(fā)揮作用[1]。pre-mRNA 剪接是剪接體在組裝過程中通過發(fā)動(dòng)兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)催化完成的。剪接體是由5種核小RNA（U1snRNA、U2snRNA、U4snRNA、U5snRNA、U6snRNA）和多種蛋白質(zhì)形成的5種核小核糖核蛋白（U1snRNP、U2snRNP、U4snRNP、U5snRNP、U6snRNP）及其他輔助蛋白質(zhì)形成的超大分子復(fù)合體[2]，其組裝過程主要經(jīng)歷以下幾個(gè)階段：（1）U1snRNP 識(shí)別內(nèi)含子的5′剪接位點(diǎn)，U2AF（U2snRNP auxiliary factor）與3′端的多聚嘧啶區(qū)（polypyrimidine tract，Py tract）結(jié)合，形成復(fù)合體E；（2）U2snRNP 與分支點(diǎn)序列（branchpoint sequence，BPS）結(jié)合，形成復(fù)合體A；（3）U4/U6snRNP 與U5snRNP 以復(fù)合物形式與復(fù)合體A 相互作用，生成復(fù)合體B1；（4）U1snRNP 離開剪接體，U6snRNP 識(shí)別5′剪接位點(diǎn)，U5snRNP 松散結(jié)合到內(nèi)含子上，形成復(fù)合體B2；（5）復(fù)合體構(gòu)象重排變成具有催化活性的復(fù)合體C。轉(zhuǎn)酯反應(yīng)起始于分支點(diǎn)的2′-OH 攻擊內(nèi)含子5′端的磷酸二酯鍵，上游外顯子產(chǎn)生游離的3′-OH，其攻擊內(nèi)含子3′端的磷酸二酯鍵，與下游外顯子連接起來，同時(shí)內(nèi)含子形成套索結(jié)構(gòu)釋放[2-3]。剪接又可分為組成性剪接與選擇性剪接（也稱可變剪接）。選擇性剪接在高等真核生物中普遍存在，通過從一個(gè)基因中以不同方式去除內(nèi)含子而產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄子，可進(jìn)一步表達(dá)為不同生理功能的蛋白質(zhì)，從而增加蛋白質(zhì)的復(fù)雜性和多樣性[4-5]，也可能通過無義介導(dǎo)mRNA 降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）機(jī)制被降解，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄子的水平[6-8]。剪接與無義介導(dǎo)都在基因表達(dá)調(diào)控中起著十分重要的作用。

剪接體的形成始于內(nèi)含子識(shí)別，該過程僅需U1snRNP 和少量輔助蛋白質(zhì)即可完成，分支點(diǎn)結(jié)合蛋白（branchpoint-bridging protein，BBP）就是其中重要的分子，在U2AF 大亞基的輔助下正確識(shí)別結(jié)合于BPS 上，在幫助拉近5′剪接位點(diǎn)與3′剪接位點(diǎn)的空間距離上起到橋梁作用，是剪接體組裝之初必不可少的核心成員之一[9-12]。研究顯示，BBP 及其同源蛋白在動(dòng)物、植物、真菌中高度保守，推測(cè)其在所有形成剪接體的真核生物中存在[13]。

真菌活動(dòng)與人類生活密切相關(guān)。真菌不僅參與工業(yè)發(fā)酵、食品添加劑和飼料添加劑生產(chǎn)、異生物質(zhì)降解、纖維素向生物燃料轉(zhuǎn)化等重要過程，有些真菌還會(huì)引起人類或動(dòng)植物的疾病，為此對(duì)真菌的研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的重要內(nèi)容[14]。同時(shí)，真菌的基因組相對(duì)于其他高等真核生物更小、結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)化，并且部分真菌已經(jīng)作為模式生物成為人類探索生命科學(xué)奧秘的重要工具[13]。因此，選擇低復(fù)雜度的真菌為研究對(duì)象對(duì)于探究選擇性剪接機(jī)理具有重要意義。

本研究對(duì)9種常見真菌——稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces tritici）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、西瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、白僵菌（Beauveria bassiana）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的BBP進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，旨在了解BBP 在這9種真菌中的基本特性及可能的生物學(xué)功能，以期為進(jìn)一步研究BBP 在pre-mRNA 剪接中的作用及其他的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 研究對(duì)象及分析方法

1.1 BBP 的基本信息獲取

利用真菌在線網(wǎng)站（http：//fungi.ensembl.org/Magnaporthe_oryzae/Info/Index），輸入“branchpointbridging protein”檢索獲取稻瘟病菌中BBP 的氨基酸序列，然后通過NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）利用同源比對(duì)獲取釀酒酵母、小麥全蝕病菌、粗糙脈孢菌、西瓜炭疽病菌、白僵菌、尖孢鐮刀菌、水稻惡苗病菌、立枯絲核菌的BBP 氨基酸序列，同源比對(duì)參數(shù)默認(rèn)。

1.2 BBP 的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)、親水性和穩(wěn)定性。

1.3 BBP 的亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽與跨膜螺旋預(yù)測(cè)

利用DeepLoc-1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）在線軟件對(duì)BBP 進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用SignalIP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和TMpred Server （https：//embnet.vital -it.ch/software/TMPRED_form.html）在線軟件進(jìn)行跨膜螺旋預(yù)測(cè)。

1.4 BBP 的二級(jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域分析

利用NPS@（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）在線軟件預(yù)測(cè)BBP 二級(jí)結(jié)構(gòu)，參數(shù)默認(rèn)；利用InterPro Scan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequencesearch）在線軟件預(yù)測(cè)BBP 結(jié)構(gòu)域，利用Dog 2.0 軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域繪圖。

1.5 BBP 的系統(tǒng)進(jìn)化分析

多序列比對(duì)后，利用MEGA 7.0.26 軟件中的Neighbor-Joining 法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，參數(shù)默認(rèn)，生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 BBP 的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用ExPASy 中的Swiss Model（https：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)并獲取信息。

1.7 BBP 的磷酸化與SUMO 化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用DISPHOS 1.3（http：//www.dabi.temple.edu/disphos/）在線軟件預(yù)測(cè)BBP 的磷酸化位點(diǎn)；利用GPS-SUMO 1.0 軟件預(yù)測(cè)BBP 的SUMO 化位點(diǎn)，各參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 BBP 的基本信息獲取

首先通過真菌數(shù)據(jù)庫(kù)獲取稻瘟病菌BBP 的蛋白ID 及氨基酸序列，然后通過NCBI 進(jìn)行同源比對(duì)，獲取釀酒酵母、小麥全蝕病菌、粗糙脈孢菌、西瓜炭疽病菌、白僵菌、尖孢鐮刀菌、水稻惡苗病菌、立枯絲核菌中BBP 的蛋白ID、蛋白長(zhǎng)度、基因座位、覆蓋度及E值（表1）。其中，稻瘟病菌BBP 的蛋白長(zhǎng)度最大，氨基酸數(shù)目為638；釀酒酵母BBP 的蛋白長(zhǎng)度最小，氨基酸數(shù)目為458。除稻瘟病菌外，白僵菌BBP 的覆蓋度最高，為96%，E值為0；釀酒酵母BBP的覆蓋度最低，立枯絲核菌次之，分別占比41%和67%，E值分別為1.00E-96 和4.00E-135。

表1 9種真菌中BBP 的信息

2.2 BBP 的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy 在線軟件分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。由表2 可知，XP_003709462.1 分子量最大，XP_009226994.1 次之，ONH80283.1 分子量最?。凰械鞍壮蕢A性；ONH80283.1 等電點(diǎn)最高，為9.56；所有蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白。

2.3 BBP 的亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽與跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用DeepLoc-1.0 在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，9種真菌的BBP 皆存在于細(xì)胞核中；利用SignalIP 4.1 在線軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，9種真菌的BBP 均不存在信號(hào)肽；利用TMHMM Server v.2.0 和TMpred Server 兩個(gè)在線軟件對(duì)蛋白跨膜螺旋進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，結(jié)果顯示，9種真菌的BBP 跨膜區(qū)域?yàn)榱悖瑹o跨膜蛋白，即所研究蛋白不屬于膜蛋白或分泌蛋白。

表2 9種真菌中BBP 的理化性質(zhì)

2.4 BBP 的二級(jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域分析

利用NPS@ 在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見表3。由表3 可知，無規(guī)則卷曲占比最大，α 螺旋次之，β 折疊和β 轉(zhuǎn)角占比較小。α 螺旋和β 折疊為蛋白質(zhì)最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)形式，其中，立枯絲核菌CCO28600.1 的α 螺旋占比最大，為23.41%；釀酒酵母ONH80283.1 占比最小，為15.33%，但是ONH80283.1 的β 折疊占比最高達(dá)9.05%，比β 折疊占比最小的小麥全蝕病菌XP_009226994.1 高5.08%。

表3 9種真菌中BBP 的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 單位：%

結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)構(gòu)成三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本單元，具有一定的生物學(xué)功能。為了進(jìn)一步明確BBP 的結(jié)構(gòu)及功能，利用InterPro Scan 在線軟件預(yù)測(cè)9種真菌中BBP 的結(jié)構(gòu)域，然后利用Dog 2.0 軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域繪圖。由圖1 可知，本研究中的蛋白質(zhì)均具有3 個(gè)相同的結(jié)構(gòu)域（SF1-HH、KH_dom、Znf_CCHC），除釀酒酵母ONH80283.1 各結(jié)構(gòu)域在肽鏈中的位置與其他蛋白差異較大外，其他各蛋白結(jié)構(gòu)域分布相似。由此推測(cè)，ONH80283.1 在高級(jí)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能上可能會(huì)與其他8種真菌中的BBP 有所差異。

2.5 BBP 的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了明確9種真菌中BBP 的進(jìn)化關(guān)系，本研究利用MEGA 7.0.26 軟件對(duì)這9種真菌的BBP 進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)分析并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖2 可知，9種真菌BBP 的進(jìn)化樹分支置信度為55～100，數(shù)值較高，表明該進(jìn)化樹可信，其中，XP_003709462.1 和 XP_009226994.1、RKK80992.1和KLO90296.1 遺傳距離相近，說明兩兩之間同源性較高，親緣關(guān)系較近；ONH80283.1 與CCO28600.1分別獨(dú)立構(gòu)成一個(gè)分支，表明這二者與其他蛋白的同源性較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能經(jīng)歷了不同的分子進(jìn)化過程。

2.6 BBP 的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)功能與其高級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，為了進(jìn)一步明確9種真菌中BBP 的生物學(xué)功能，本研究利用ExPASy中的Swiss Model 在線軟件對(duì)BBP 進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)獲取3D 結(jié)構(gòu)圖以及相關(guān)信息。由表4 可知，XP_008603189.1 和CCO28600.1 模板為4wan.1.A，其余7種真菌中BBP 模板均為4wal.1.A，其中，ONH80283.1與模板的一致性最高，達(dá)97.66%，建模質(zhì)量評(píng)分最高為0.23，建模質(zhì)量評(píng)分表示為0～1 之間的數(shù)字，數(shù)字越大可靠性越高，由此可知，該模型具有較高參考價(jià)值。由圖3可知，XP_003709462.1、XP_009226994.1、XP_961266.1、TDZ21617.1、XP_008603189.1、RKK80992.1以及KLO90296.1 的3D 結(jié)構(gòu)非常相似，推測(cè)BBP 在這7種真菌中高度結(jié)構(gòu)保守，功能相似；ONH80283.1 分子量最小，結(jié)構(gòu)相對(duì)較簡(jiǎn)單，而CCO28600.1 以四聚體形式存在，推測(cè)其可能以四聚體形式發(fā)揮功能，這與系統(tǒng)進(jìn)化分析中ONH80283.1 與CCO28600.1 獨(dú)立構(gòu)成分支的結(jié)果具有一致性。

2.7 BBP 的磷酸化與SUMO 化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

磷酸化和SUMO 化是蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾內(nèi)容，在蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能上具有重要作用。本研究通過DISPHOS 1.3 在線軟件與GPS-SUMO 1.0 軟件分別預(yù)測(cè)了BBP 的磷酸化位點(diǎn)和SUMO 化位點(diǎn)。由表5 可知，RKK80992.1 與KLO90296.1 同為鐮刀菌屬，二者的Ser、Thr 和Tyr 3種氨基酸磷酸化位點(diǎn)占比極其相近；TDZ21617.1、XP_008603189.1、RKK80992.1 和KLO90296.1 具有1 個(gè)SUMO 化位點(diǎn)，XP_003709462.1、ONH80283.1、XP_009226994.1和XP_961266.1 均具有2 個(gè)SUMO 化位點(diǎn)或SUMO互作基序，而CCO28600.1 具有4 個(gè)SUMO 化位點(diǎn)或SUMO 互作基序。

表4 9種真菌中BBP 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)比對(duì)分析與質(zhì)量評(píng)價(jià)

3 討論與結(jié)論

基于剪接過程對(duì)于基因表達(dá)和蛋白質(zhì)多樣性的重要影響，剪接位點(diǎn)識(shí)別輔助因子的研究成為基因表達(dá)調(diào)控的重要內(nèi)容之一。已有大量研究表明，BBP在人（Homo sapiens）[15]、小家鼠（Mus musculus）[16-17]、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[18]、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster） 和秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）[19]細(xì)胞的可變剪接中起著至關(guān)重要的作用。近年來也有學(xué)者針對(duì)BBP 的分子功能在植物中展開研究，例如JANG 等[20]研究表明，在擬南芥中BBP 是部分pre-mRNA 選擇性剪接過程必不可少的參與者，缺少BBP 會(huì)導(dǎo)致擬南芥發(fā)育異常；YIN 等[21]在桃的花色研究中表明，BBP 作為一種重要的蛋白質(zhì)參與了pre-mRNA 的選擇性剪接，這種選擇性剪接導(dǎo)致紅色桃花中花青素合酶（ANS）活性明顯升高。在真菌中，對(duì)BBP 的功能研究主要圍繞釀酒酵母展開，研究表明，BBP 除了在剪接過程中發(fā)揮必要功能，還參與pre-mRNA 的核滯留[22-23]。RODGERS 等[24]從釀酒酵母細(xì)胞裂解物中分離出BBP進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有一部分BBP 分子能與RNA 底物互相作用，從而推測(cè)BBP 可能具有新的調(diào)節(jié)功能，進(jìn)一步驗(yàn)證了BBP 可能在選擇性剪接之外發(fā)揮功能。然而在其他真菌中對(duì)BBP 的功能研究鮮有報(bào)道。

表5 9種真菌中BBP 的磷酸化位點(diǎn)與SUMO 化位點(diǎn)

本研究對(duì)包括釀酒酵母在內(nèi)的9種常見真菌中的BBP 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，與其他真菌BBP 二級(jí)結(jié)構(gòu)相比，釀酒酵母ONH80283.1 的α螺旋占比最小，β 轉(zhuǎn)角占比最高，且結(jié)構(gòu)域整體靠近N 端，直接導(dǎo)致其三級(jí)結(jié)構(gòu)與其他真菌形成明顯差異。值得注意的是，立枯絲核菌CCO28600.1 的三級(jí)結(jié)構(gòu)以四聚體的形式存在，且含有4 處SUMO 化位點(diǎn)。這些都與系統(tǒng)進(jìn)化分析中，ONH80283.1 和CCO28600.1 各自獨(dú)立構(gòu)成分支相符。由此推測(cè)，釀酒酵母和立枯絲核菌中的BBP 發(fā)揮的功能并不完全相同或在發(fā)揮功能的方式上有所不同。此外，RKK80992.1 與KLO90296.1 同為鐮刀菌屬，這兩種真菌中BBP 的理化性質(zhì)極其相似，二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域及三級(jí)結(jié)構(gòu)差異極小，系統(tǒng)進(jìn)化分析中其親緣關(guān)系最近，且二者Ser、Thr、Tyr 3種氨基酸磷酸化位點(diǎn)占比相近，同有一處SUMO 化位點(diǎn)，由此可見，BBP在同屬真菌中進(jìn)化高度保守。