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        水稻黃葉突變體yl6(t)的遺傳分析和基因定位探究

        2020-08-19 13:00:03袁鎧
        南方農(nóng)業(yè)·中旬 2020年6期
        關鍵詞:水稻

        袁鎧

        摘 要 在粳稻品種日本晴群體中發(fā)現(xiàn)了1個黃葉自然突變體yl6(t),因此,對其進行調查研究。農(nóng)藝性狀調查發(fā)現(xiàn),與野生型相比,yl6(t)的結實率明顯較低;葉綠素含量測定發(fā)現(xiàn),突變體yl6(t)苗期后期葉素綠含量極顯著降低,全生育期為黃葉;超微結構觀察發(fā)現(xiàn),葉綠體形態(tài)改變,類囊體片層結構減少;遺傳分析表明,yl6(t)黃葉表型為單隱性核基因控制,利用SSR標記將目的基因初步定位在水稻第6號染色體約56 kb區(qū)段內,該區(qū)段未有相關基因報道,推測是1個新的控制水稻葉色的基因。

        關鍵詞 水稻;黃葉突變體;遺傳分析;基因定位

        水稻(Oryza sativa L.)是世界上三大糧食作物之一,中國絕大多數(shù)人口以水稻為主食。隨著人口的增加和環(huán)境的惡化,提高水稻的產(chǎn)量顯得十分重要。水稻產(chǎn)量的95%來自葉片葉綠體的光合作用,葉片是植物光合作用的主要器官。因此,研究水稻的葉色有重要的意義。

        本研究對從日本晴群體中發(fā)現(xiàn)的自然突變的黃葉突變體進行了農(nóng)藝性狀考察,對其進行遺傳分析和基因初步定位,為進一步精細定位和克隆該基因奠定基礎。

        1 材料與方法

        1.1 供試材料

        黃葉突變體由粳稻日本晴經(jīng)自然突變而來,暫命名為yl6(t),該突變體經(jīng)多年種植發(fā)現(xiàn)突變性狀能穩(wěn)定遺傳。其他水稻材料包括正常葉色粳稻品種日本晴和秈稻品種Kasalath。親本材料種植于揚州大學水稻試驗田,遺傳分析和定位群體種植于揚州大學農(nóng)學院酒甸實驗基地,均按照常規(guī)水肥管理。

        1.2 葉綠素含量測定

        于苗期、分蘗期及成熟期分別測定突變體yl6(t)和野生型日本晴的葉綠素含量。各取3株的倒2葉設定生物學重復,稱取伸展完全的鮮葉(去葉脈)0.2 g。參照Lichtenthaler等的方法[1],用分光光度計分別測定664 nm、646 nm、470 nm波長處的吸光值D,進行葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素含量測定。

        1.3 葉綠體超微結構觀察

        在水稻苗期、分蘗期分別取突變體yl6(t)與野生型日本晴的葉片,在1~3 min取樣,用刀片切成2 mm×2 mm的矩形小片,經(jīng)過生物公司處理制成超薄切片,觀察突變體和野生型葉肉細胞的葉綠體形態(tài)并拍照[2]。

        1.4 主要農(nóng)藝性狀調查與分析

        成熟期分別隨機選取兩親本各6株,統(tǒng)計其劍葉長、劍葉寬、有效穗數(shù)、飽粒數(shù)、總粒數(shù)、結實率、主穗長、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、千粒重、株高,計算平均值,進行t測驗。

        1.5 遺傳分析群體和基因定位群體構建

        以正常日本晴為父本與突變體yl6(t)進行雜交得到F1,自交獲得F2,以F2為遺傳分析群體。以Kasalath為父本與突變體yl6(t)雜交F1,自交獲得F2,從F2中分離黃葉表型的單株作為基因定位群體。

        1.6 突變體yl6(t)的基因定位

        采用BSA法,建成黃葉突變池和正常池。利用SSR標記對兩個親本突變體yl6(t)與Kasalath進行多態(tài)性分析,利用多態(tài)性良好的標記分析親本及池間的多態(tài)性,找出與目的基因可能連鎖的標記,利用隱性黃葉群體進行驗證,確定目標基因所在染色體。

        根據(jù)目標基因所在的位置,設計STS標記并挑選出多態(tài)性良好的標記,利用突變體yl6(t)與Kasalath的F2群體中的1 430株黃葉突變單株進行精細定位,DNA的提取采用CTAB法。

        PCR反應過程:94 ℃,5 min預變性;95 ℃,40 s變性;51~56 ℃,40 s退火;72 ℃,40 s延伸,35個循環(huán)(潮霉素30個循環(huán));72 ℃,10 min;16 ℃保存。

        2 結果與分析

        2.1 突變體yl6(t)的表型特征

        通過觀察種植在揚州的野生型日本晴和突變體yl6(t)可以明顯發(fā)現(xiàn),與野生型日本晴相比,突變體yl6(t)在苗期后期表現(xiàn)為淡黃葉,生長期間不轉綠,成熟期時植株葉色已明顯黃于野生型。突變體株高較矮,分蘗較少。

        突變體yl6(t)與野生型日本晴相比,農(nóng)藝性狀也有所改變,具體見表1。兩者二次枝梗數(shù)、主穗長有顯著差異,株高、千粒質量達到了極顯著差異,其他農(nóng)藝性狀差異不顯著。

        2.2 突變體yl6(t)的葉綠素含量測定

        用紫外線分光光度計分別測量了突變體yl6(t)和野生型日本晴葉片各時期的葉綠素含量。發(fā)現(xiàn)突變體yl6(t)苗期和分蘗期葉綠素含量均低于野生型日本晴。隨著葉片的生長,突變體葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量都極顯著下降,而胡蘿卜素含量顯著下降,這說明突變體yl6(t)葉片變黃有可能是葉綠素含量減少導致的。

        2.3 突變體yl6(t)的葉綠體超微結構分析

        透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn):,與野生型日本晴相比,突變體yl6(t)的葉綠體形狀不規(guī)則,內部含有嗜餓性板層小體,類囊體數(shù)量減少,說明葉綠體發(fā)育不正常。這些說明,突變體yl6(t)與野生型日本晴相比,不僅葉綠素含量有差異,葉綠體的發(fā)育情況也受到了影響,這些可能與葉色變異有關。

        2.4 突變體yl6(t)的遺傳分析與基因定位

        以突變體yl6(t)為母本,與正常葉色日本晴雜交,F(xiàn)1代自交獲得F2,在F2代中,苗期后期發(fā)生葉色的性狀分離。隨機調查500株,考察突變株和正常株數(shù)量,其中突變株數(shù)量為109株,正常株數(shù)量為391株,X2=2.56<3.84=X20.05,該結果符合孟德爾單基因分離比3∶1,證明黃葉突變體yl6(t)受一對隱性核基因控制。

        利用480個SSR標記對兩個親本進行多態(tài)性分析,利用多態(tài)性較好的標記檢測混池的多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)標記RM5851有明顯的多態(tài)性,位于6號染色體上,接著利用RM5851對隱性單株群體進行群體驗證,跑膠發(fā)現(xiàn)突變體的帶型與大部分隱性單株的帶型相同,經(jīng)過計算發(fā)現(xiàn)這個標記與目的基因的交換率約為10%,初步確定該黃葉基因位于第6號染色體上。為了進一步定位該黃葉基因,在標記RM5851附近發(fā)展了十幾個標記,最后挑選出多態(tài)性良好的IDL標記:標記ID1279、ID1413、ID1505、ID1732。因為還有一批黃葉隱性單株群體,為了嘗試進一步縮小定位區(qū)間,于是接著利用480株黃葉突變單株進行分析,將該基因定位于標記ID1279與ID1732之間,接著繼續(xù)利用950株單株進行分析,結果發(fā)現(xiàn),該基因與標記ID1437共分離,且在標記ID1432與標記ID1505分別有12個和15個交換單株,標記ID1413有18個交換單株,標記ID1610有37株交換單株,標記ID1499有13個交換單株,通過交換株個數(shù)的變化情況,表明該基因存在于標記ID1432與標記ID1499之間,物理距離約為56 kb。

        3 結論與討論

        本研究中所采用的材料為自然突變而來的黃葉突變體,突變方式較為安全,經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn):突變體yl6(t)的農(nóng)藝性狀發(fā)生了變化,葉綠素含量與野生型相比明顯降低,葉綠體產(chǎn)生了變異、結構發(fā)生了改變。因此該黃葉突變體葉色發(fā)生變異可能是由于葉綠素含量變化和葉綠體發(fā)育異常共同引起的。

        本研究將yl6(t)基因定位到水稻6號染色體56 kb區(qū)段內,該區(qū)段中未見有關黃葉基因的有關報道,因此推測yl6(t)是一個新的黃葉基因,對該基因進一步研究將有利于闡明水稻葉色變異的分子機制。

        參考文獻:

        [1] Lichtenthaler HK.Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes[J].Methods in enzymology,1987,148C:350-382.

        [2] 邱義蘭,李紅,彭克勤,等.水稻“斑馬葉”突變體B411葉綠體超微結構的觀察[J].作物學報,2010,36(1):184-190.

        (責任編輯:趙中正)

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