袁鎧

摘 要 在粳稻品種日本晴群體中發(fā)現(xiàn)了1個黃葉自然突變體yl6（t），因此，對其進行調(diào)查研究。農(nóng)藝性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，yl6（t）的結實率明顯較低;葉綠素含量測定發(fā)現(xiàn)，突變體yl6（t）苗期后期葉素綠含量極顯著降低，全生育期為黃葉;超微結構觀察發(fā)現(xiàn)，葉綠體形態(tài)改變，類囊體片層結構減少;遺傳分析表明，yl6（t）黃葉表型為單隱性核基因控制，利用SSR標記將目的基因初步定位在水稻第6號染色體約56 kb區(qū)段內(nèi)，該區(qū)段未有相關基因報道，推測是1個新的控制水稻葉色的基因。

關鍵詞 水稻;黃葉突變體;遺傳分析;基因定位

水稻（Oryza sativa L.）是世界上三大糧食作物之一，中國絕大多數(shù)人口以水稻為主食。隨著人口的增加和環(huán)境的惡化，提高水稻的產(chǎn)量顯得十分重要。水稻產(chǎn)量的95%來自葉片葉綠體的光合作用，葉片是植物光合作用的主要器官。因此，研究水稻的葉色有重要的意義。

本研究對從日本晴群體中發(fā)現(xiàn)的自然突變的黃葉突變體進行了農(nóng)藝性狀考察，對其進行遺傳分析和基因初步定位，為進一步精細定位和克隆該基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃葉突變體由粳稻日本晴經(jīng)自然突變而來，暫命名為yl6（t），該突變體經(jīng)多年種植發(fā)現(xiàn)突變性狀能穩(wěn)定遺傳。其他水稻材料包括正常葉色粳稻品種日本晴和秈稻品種Kasalath。親本材料種植于揚州大學水稻試驗田，遺傳分析和定位群體種植于揚州大學農(nóng)學院酒甸實驗基地，均按照常規(guī)水肥管理。

1.2 葉綠素含量測定

于苗期、分蘗期及成熟期分別測定突變體yl6（t）和野生型日本晴的葉綠素含量。各取3株的倒2葉設定生物學重復，稱取伸展完全的鮮葉（去葉脈）0.2 g。參照Lichtenthaler等的方法[1]，用分光光度計分別測定664 nm、646 nm、470 nm波長處的吸光值D，進行葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素含量測定。

1.3 葉綠體超微結構觀察

在水稻苗期、分蘗期分別取突變體yl6（t）與野生型日本晴的葉片，在1～3 min取樣，用刀片切成2 mm×2 mm的矩形小片，經(jīng)過生物公司處理制成超薄切片，觀察突變體和野生型葉肉細胞的葉綠體形態(tài)并拍照[2]。

1.4 主要農(nóng)藝性狀調(diào)查與分析

成熟期分別隨機選取兩親本各6株，統(tǒng)計其劍葉長、劍葉寬、有效穗數(shù)、飽粒數(shù)、總粒數(shù)、結實率、主穗長、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、千粒重、株高，計算平均值，進行t測驗。

1.5 遺傳分析群體和基因定位群體構建

以正常日本晴為父本與突變體yl6（t）進行雜交得到F1，自交獲得F2，以F2為遺傳分析群體。以Kasalath為父本與突變體yl6（t）雜交F1，自交獲得F2，從F2中分離黃葉表型的單株作為基因定位群體。

1.6 突變體yl6（t）的基因定位

采用BSA法，建成黃葉突變池和正常池。利用SSR標記對兩個親本突變體yl6（t）與Kasalath進行多態(tài)性分析，利用多態(tài)性良好的標記分析親本及池間的多態(tài)性，找出與目的基因可能連鎖的標記，利用隱性黃葉群體進行驗證，確定目標基因所在染色體。

根據(jù)目標基因所在的位置，設計STS標記并挑選出多態(tài)性良好的標記，利用突變體yl6（t）與Kasalath的F2群體中的1 430株黃葉突變單株進行精細定位，DNA的提取采用CTAB法。

PCR反應過程：94 ℃，5 min預變性;95 ℃，40 s變性;51～56 ℃，40 s退火;72 ℃，40 s延伸，35個循環(huán)（潮霉素30個循環(huán)）;72 ℃，10 min;16 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 突變體yl6（t）的表型特征

通過觀察種植在揚州的野生型日本晴和突變體yl6（t）可以明顯發(fā)現(xiàn)，與野生型日本晴相比，突變體yl6（t）在苗期后期表現(xiàn)為淡黃葉，生長期間不轉(zhuǎn)綠，成熟期時植株葉色已明顯黃于野生型。突變體株高較矮，分蘗較少。

突變體yl6（t）與野生型日本晴相比，農(nóng)藝性狀也有所改變，具體見表1。兩者二次枝梗數(shù)、主穗長有顯著差異，株高、千粒質(zhì)量達到了極顯著差異，其他農(nóng)藝性狀差異不顯著。

2.2 突變體yl6（t）的葉綠素含量測定

用紫外線分光光度計分別測量了突變體yl6（t）和野生型日本晴葉片各時期的葉綠素含量。發(fā)現(xiàn)突變體yl6（t）苗期和分蘗期葉綠素含量均低于野生型日本晴。隨著葉片的生長，突變體葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量都極顯著下降，而胡蘿卜素含量顯著下降，這說明突變體yl6（t）葉片變黃有可能是葉綠素含量減少導致的。

2.3 突變體yl6（t）的葉綠體超微結構分析

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：，與野生型日本晴相比，突變體yl6（t）的葉綠體形狀不規(guī)則，內(nèi)部含有嗜餓性板層小體，類囊體數(shù)量減少，說明葉綠體發(fā)育不正常。這些說明，突變體yl6（t）與野生型日本晴相比，不僅葉綠素含量有差異，葉綠體的發(fā)育情況也受到了影響，這些可能與葉色變異有關。

2.4 突變體yl6（t）的遺傳分析與基因定位

以突變體yl6（t）為母本，與正常葉色日本晴雜交，F(xiàn)1代自交獲得F2，在F2代中，苗期后期發(fā)生葉色的性狀分離。隨機調(diào)查500株，考察突變株和正常株數(shù)量，其中突變株數(shù)量為109株，正常株數(shù)量為391株，X2=2.56<3.84=X20.05，該結果符合孟德爾單基因分離比3∶1，證明黃葉突變體yl6（t）受一對隱性核基因控制。

利用480個SSR標記對兩個親本進行多態(tài)性分析，利用多態(tài)性較好的標記檢測混池的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)標記RM5851有明顯的多態(tài)性，位于6號染色體上，接著利用RM5851對隱性單株群體進行群體驗證，跑膠發(fā)現(xiàn)突變體的帶型與大部分隱性單株的帶型相同，經(jīng)過計算發(fā)現(xiàn)這個標記與目的基因的交換率約為10%，初步確定該黃葉基因位于第6號染色體上。為了進一步定位該黃葉基因，在標記RM5851附近發(fā)展了十幾個標記，最后挑選出多態(tài)性良好的IDL標記：標記ID1279、ID1413、ID1505、ID1732。因為還有一批黃葉隱性單株群體，為了嘗試進一步縮小定位區(qū)間，于是接著利用480株黃葉突變單株進行分析，將該基因定位于標記ID1279與ID1732之間，接著繼續(xù)利用950株單株進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，該基因與標記ID1437共分離，且在標記ID1432與標記ID1505分別有12個和15個交換單株，標記ID1413有18個交換單株，標記ID1610有37株交換單株，標記ID1499有13個交換單株，通過交換株個數(shù)的變化情況，表明該基因存在于標記ID1432與標記ID1499之間，物理距離約為56 kb。

3 結論與討論

本研究中所采用的材料為自然突變而來的黃葉突變體，突變方式較為安全，經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn)：突變體yl6（t）的農(nóng)藝性狀發(fā)生了變化，葉綠素含量與野生型相比明顯降低，葉綠體產(chǎn)生了變異、結構發(fā)生了改變。因此該黃葉突變體葉色發(fā)生變異可能是由于葉綠素含量變化和葉綠體發(fā)育異常共同引起的。

本研究將yl6（t）基因定位到水稻6號染色體56 kb區(qū)段內(nèi)，該區(qū)段中未見有關黃葉基因的有關報道，因此推測yl6（t）是一個新的黃葉基因，對該基因進一步研究將有利于闡明水稻葉色變異的分子機制。

參考文獻：

[1] Lichtenthaler HK.Chlorophylls and carotenoids： Pigments of photosynthetic biomembranes[J].Methods in enzymology，1987，148C：350-382.

[2] 邱義蘭，李紅，彭克勤，等.水稻“斑馬葉”突變體B411葉綠體超微結構的觀察[J].作物學報，2010，36（1）：184-190.

（責任編輯：趙中正）