任恒星 ，何 環(huán)，柳方景，王美林，趙 娜，郭 鑫，陳林勇，趙 晗，元雪芳，關(guān)嘉棟，岳利嬌

(1.煤與煤層氣共采國家重點實驗室，山西 晉城 048000；2.中國礦業(yè)大學 化工學院，江蘇 徐州 221116；3.中國礦業(yè)大學 煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點實驗室，江蘇 徐州 221116)

生物成因煤層氣是煤中有機物在微生物作用下被降解產(chǎn)生有機酸、芳香烴等，然后進一步被轉(zhuǎn)化為乙酸和二氧化碳等小分子化合物并最終經(jīng)產(chǎn)甲烷菌合成甲烷的過程[1-5]。當前，利用微生物厭氧降解煤中有機物產(chǎn)甲烷是煤層氣增產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點[6-8]。煤是一種含有大量芳環(huán)化合物的混合物，有機組成較為復雜，其組分的復雜性給生物產(chǎn)氣機理研究帶來很大困難。到目前為止，煤中具體哪種有機組分能被微生物利用產(chǎn)氣還不清楚。趙同謙等[9]運用紫外和熒光光譜研究煤生物產(chǎn)氣過程中可溶性有機物的變化特征，認為芳香族物質(zhì)參與了生物產(chǎn)氣過程；邵培[10]研究了中低階煤有機地球化學特征對生物氣生成的影響，認為黃鐵礦和黏土礦物對生物氣產(chǎn)生速率影響顯著；陶明信等[11]研究淮南煤田煤中可溶有機質(zhì)的生物降解特征，認為煤中的可溶有機質(zhì)是生物成因甲烷產(chǎn)生的優(yōu)先底物。也有學者通過溶劑萃取的方法分析煤生物產(chǎn)氣的底物組成。葛曉光等[12]通過甲醇萃取研究煤有機成分與煤層水中硫酸鹽還原菌(Sulfate Reducing Bacteira,SRB)的代謝關(guān)系，認為SRB 可厭氧降解利用甲醇萃取煤中大分子有機物；A.Furmann 等[13]用水、甲醇和二氯甲烷對煙煤進行萃取，利用萃取物進行生物產(chǎn)氣研究，發(fā)現(xiàn)高鏡質(zhì)組煤的萃取物產(chǎn)氣量高于低鏡質(zhì)組煤，可能是由于鏡質(zhì)組中含N、O、S 等官能團的有機物較多，為生物降解提供了化學位點。煤中除了存在大量的非水溶性有機物，還含有少量易溶于水的極性有機物，在生物與煤相互作用過程中，水溶性有機物能夠快速均勻地分布于煤基質(zhì)中，理論上優(yōu)先被微生物利用。但是，煤中水溶性有機物極性大，不利于GC-MS 定性定量分析[14]。W.H.Orem 等[15-16]利用有機溶劑萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析，從煤層水和煤生物產(chǎn)氣發(fā)酵液中檢測到了酚和長鏈脂肪酸等多種有機物。A.Vieth 等[17]利用離子色譜法從不同煤的水萃物中檢測到了低分子量有機酸，并認為這些物質(zhì)是煤層微生物的潛在底物。盡管國內(nèi)外研究人員對煤中生物產(chǎn)氣的有機組分開展了相關(guān)工作，但整體上而言，其具體組成還有待進一步研究。近年來，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)已較為成熟，其綜合了高效液相色譜的化合物分離和電噴霧離子源四級桿飛行時間質(zhì)譜的靈敏檢測，為分析極性至弱極性的熱不穩(wěn)定化合物提供了方法[18]。

筆者以實驗室保存的產(chǎn)甲烷菌群為產(chǎn)氣微生物，義馬褐煤為產(chǎn)氣底物，利用去離子水萃取結(jié)合減壓蒸餾濃縮的方法提取褐煤中水溶性有機組分，并開展生物產(chǎn)氣實驗，綜合利用 HPLC-MS 和GC-MS 方法研究生物產(chǎn)氣前后煤中水溶性有機質(zhì)的變化規(guī)律及其對產(chǎn)甲烷的貢獻，以期為后續(xù)分析生物產(chǎn)氣的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 材料與方法

1.1 褐煤樣品與產(chǎn)甲烷菌群

褐煤樣品采自河南義馬千秋礦，去除表面氧化層后粉碎至120 目(125 μm)以下，70℃烘干后保存在充氮樣品袋中備用，記為YM。褐煤工業(yè)分析和元素分析結(jié)果見表1。

表1 義馬褐煤工業(yè)分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analysis of Yima lignite

煤的萃取過程如下：取褐煤(YM)30 g 于燒杯中，加入450 mL 去離子水，70℃萃取48 h 后用普通定性濾紙過濾[19]，將濾液減壓蒸餾濃縮30 倍，得到水溶物W1。將濾渣于70℃烘干至恒重，得到水萃余煤記為W2。褐煤的萃取率計算公式如下：

式中：p為萃取率，%；mYM為萃取前褐煤質(zhì)量，g；mW2為萃余物質(zhì)量，g。

采用實驗室前期保存的產(chǎn)甲烷菌群作為菌源[20]，接種時每毫升菌源的總菌數(shù)為1.7×107個。產(chǎn)甲烷菌群培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為：2.9 g K2HPO4，1.5 g KH2PO4，1.8 g NH4Cl，0.4 g MgCl2，0.2 g 酵母萃取物，0.5 g L-半胱氨酸鹽酸鹽，去離子水1 000 mL。

1.2 褐煤生物產(chǎn)氣實驗

生物產(chǎn)氣實驗分4 組，每組設(shè)3 組平行樣，組別設(shè)置見表2。取250 mL 厭氧瓶作為反應(yīng)容器，加入培養(yǎng)基120 mL，分別以水溶物(W1)、萃余煤(W2)和原煤(YM)作為底物，并以去離子水做空白對照。底物添加完成后封口滅菌，然后冷卻至室溫，每瓶接種5 mL 菌液，接種完成后放入30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)進行生物產(chǎn)氣實驗，實驗啟動當天記作0 d，產(chǎn)氣實驗周期為45 d。各組的每克煤產(chǎn)甲烷量計算公式為：

式中：QE為實驗組產(chǎn)氣量，mL；φE為實驗組甲烷體積分數(shù)，%；Q0為對照組產(chǎn)氣量，mL；φ0為對照組甲烷體積分數(shù)，%；m為實驗組換算原煤添加量，g；q為每克煤產(chǎn)甲烷量，mmol/g；22.4 為氣體摩爾體積常數(shù)，mL/mmol。

采用GC-MS(Agilent，7890)分析生物產(chǎn)氣過程中的氣體成分，色譜柱為Carbonplot(60 m×320 μm×1.5 μm)，TCD 檢測器，氣密針進樣，進樣量0.5 mL。進樣口溫度150℃，柱溫箱溫度30℃，檢測器溫度200℃。

表2 生物產(chǎn)氣實驗設(shè)置Table 2 Experimental setup for biogas production

1.3 水溶性有機物的HPLC-MS 分析

水溶性有機物的HPLC-MS 分析步驟如下：①分別取W0、W1、W2、YM 實驗組第0 天和第45 天的發(fā)酵液各10 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾收集；②用HPLC-QTOF(液相色譜儀Agilent 1290，配備電噴霧離子源6530 QTOF)進行液體有機組分分析，色譜柱為安捷倫Zorbax C8(1.8 μm×4.6 mm×50 mm)，流動相為甲醇和0.1%甲酸，流速0.5 mL/min，柱溫25℃，進樣量10 μL。質(zhì)譜采集模式為正離子模式，F(xiàn)ragmentor 電壓130 V，毛細管電壓3 500 V，質(zhì)荷比掃描范圍50～450。③采用Agilent MassHunter工作站分別對各樣品總離子流色譜圖進行化合物分子特征提取，用Agilent Mass Profiler Professional軟件對生成的化合物進行空白扣除、篩選，選擇在3 組平行樣中同時出現(xiàn)的化合物用于分析。

1.4 甲醇萃取物的GC-MS 分析

為了考察生物作用后煤中極性有機物的生成情況，基于甲醇沸點低、易揮發(fā)特性，根據(jù)相似相溶原理，選取甲醇對褐煤進行萃取，便于萃取物樣品的GC-MS 分析。GC-MS 分析步驟如下：①使用定性濾紙過濾收集W2 組產(chǎn)氣實驗后煤樣，用150 mL去離子水清洗煤樣3 次后，在70℃烘干至恒質(zhì)量。②分別取1 g 實驗前后的W2 組煤樣，加入15 mL甲醇，65℃浸泡萃取72 h。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將甲醇萃取液濃縮至2 mL。③采用GC-MS(Agilent7890A/5795C)進行組分分析，色譜柱為VF-WAXms(30 m×250 μm×0.25 μm)，后運行溫度為280℃，保持5 min，不分流進樣，進樣口溫度為250℃，進樣量0.8 μL，吹掃速率15 mL/min，吹掃時間0.2 min，載氣為高純度的氦氣，柱流速1.0 mL/min，初始溫度60℃，保持2 min，以10 ℃/min 的速率升溫至250℃，保持20 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)氣量分析

義馬褐煤的水溶物(W1)、水萃余煤(W2)和原煤(YM)的生物產(chǎn)氣結(jié)果為：W2 和YM 的產(chǎn)甲烷量基本相等，分別為0.45 mmol/g 和0.46 mmol/g，而W1 的CH4產(chǎn)量為0.15 mmol/g。若將YM 和W2 產(chǎn)甲烷量的差作為YM 中水溶性有機物的產(chǎn)甲烷量，則YM 中水溶性有機物產(chǎn)甲烷量為0.01 mmol/g，遠低于水溶物(W1)的產(chǎn)甲烷量 0.15 mmol/g。A.Furmann 等[13]研究發(fā)現(xiàn)煙煤在室溫條件下用水萃取24 h 得到的萃取物經(jīng)生物作用不能產(chǎn)生甲烷，且水萃物中未檢測到有機物，認為在該萃取條件下水并不是從煤中萃取有機物的有效溶劑。而本研究中萃取溫度為70℃，從W1 產(chǎn)氣效果來看，該溫度下使用水作為萃取劑可以將煤中水溶性物質(zhì)萃取出來并被產(chǎn)甲烷菌群利用產(chǎn)生甲烷。另外，本研究中生物產(chǎn)氣實驗所用的培養(yǎng)溫度為30℃，與A.Furmann等[13]使用的萃取溫度相近，從W2 和YM 組產(chǎn)氣結(jié)果可以判斷，在30℃條件下YM 中水溶性有機物同樣很難釋放到發(fā)酵液中，因此，YM 和W2 產(chǎn)甲烷量基本相等，這也充分說明30℃條件下YM 中水溶性有機物對產(chǎn)氣幾乎沒有貢獻，而70℃萃取物中也基本包含了YM 的大量水溶性化合物。

2.2 義馬褐煤水溶性有機物的化學組成

義馬褐煤的W1、W2 和YM 生物產(chǎn)氣前后發(fā)酵液質(zhì)譜如圖1 所示。生物產(chǎn)氣前，W1 組發(fā)酵液中檢測到190 種化合物，化合物種類和豐度遠超W2組及YM 組，其種類上基本包含了W2 和YM 組的化合物，表明實驗所用萃取方法能有效提取義馬原煤中的水溶性有機物。W2 組和YM 組在化合物種類上基本相同，總共檢測到41 種化合物，其種類僅占W1 中檢測到的化合物的21%左右。生物產(chǎn)氣后，在W1 組實驗前發(fā)酵液檢測到的190 種化合物中，有139 種化合物在發(fā)酵液中消失，這些化合物應(yīng)該是微生物降解利用的底物。同時，在W1 組發(fā)酵液中新檢測到23 種化合物，這些化合物應(yīng)為水溶性有機物降解后形成的產(chǎn)物。YM 組和W2 組實驗前發(fā)酵液中檢測到的41 種化合物在實驗后的豐度變化與W1 組基本相同。YM 組和W2 組實驗后的發(fā)酵液中共新檢測到7 種化合物，其中3 種化合物為W2 組、YM 組、W1 組所共有，剩余4 種為W1 組實驗后的發(fā)酵液中未檢測到的化合物，這4 種化合物應(yīng)為煤中非水溶性有機物降解后的產(chǎn)物。結(jié)合氣體產(chǎn)量數(shù)據(jù)綜合分析，W1 組中含有豐富的水溶性有機物，且產(chǎn)氣實驗表明這些物質(zhì)能被生物利用并產(chǎn)生甲烷。在W2 組煤中水溶性有機物被大部分去除的情況下，其產(chǎn)甲烷代謝過程主要利用非水溶性有機物，而根據(jù)W2 組和YM 組代謝產(chǎn)物和氣體產(chǎn)量相似性，雖然YM 組煤中含有豐富水溶性有機物，但非水溶有機物仍然是甲烷的主要來源。

W1 產(chǎn)氣前后發(fā)酵液的底物和產(chǎn)物分子量分布如圖2 所示。從圖中可以看出，底物分子量主要分布于200～300 Da，且分子量大于300 Da 的化合物較多；而產(chǎn)物的分子量主要分布在150～200 Da，且不含分子量大于300 Da 的化合物，說明經(jīng)生物產(chǎn)氣后分子量減小。在數(shù)量上，底物化合物的數(shù)量顯著大于產(chǎn)物化合物數(shù)量，說明經(jīng)生物作用后化合物數(shù)量明顯減少。對W1 組、W2 組和YM 組的產(chǎn)物做分子式推測，誤差小于3 mDa 的計算結(jié)果見表3?？梢钥闯?，這些化合物大多為含氧和氮化合物。結(jié)合元素分析數(shù)據(jù)，原煤中含氮量為1.39%，含氧量為16.44%。較高的雜原子含量為微生物降解提供了潛在位點[21]，生成了含氮和氧的產(chǎn)物。除化合物7—11外，其他化合物含8～13 個碳原子，且不飽和度大于6，而苯的不飽和度為4，表明分子結(jié)構(gòu)中存在1 個以上的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，但具體的分子結(jié)構(gòu)還需進一步鑒定。

圖1 實驗前后發(fā)酵液質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of fermentation broth before and after experiment

圖2 W1 組底物與產(chǎn)物的分子量分布Fig.2 Molecular weight distribution of substrates and products of W1 group

表3 萃取物組、萃余物組和原煤組產(chǎn)物分子式計算結(jié)果Table 3 The molecular formula calculation results for products of extract group,residue group and raw coal group

2.3 義馬褐煤甲醇萃取物的化學組成

義馬褐煤水萃余煤(W2)經(jīng)甲醇萃取后的 GCMS 結(jié)果如圖3 所示。W2 組實驗前后煤樣的甲醇萃取物中均檢測到了種類豐富酯類、烴類等非水溶性化合物，但是這些化合物實驗前后的豐度無顯著變化，說明這類物質(zhì)很難被微生物降解利用。值得注意的是，在實驗后甲醇萃取物中出現(xiàn)了實驗前煤樣甲醇萃取物中未檢測到的甲酰胺、乙酰胺、亞硫酸二甲酯三種化合物，并且在W2 組實驗后的發(fā)酵液中3 種物質(zhì)的分子離子峰也不存在。這3 種化合物較其他酯類、烴類化合物水溶性高，且都含有雜原子。李文軍等[22]研究了甲醇萃取對大雁褐煤孔隙結(jié)構(gòu)的影響，認為甲醇能萃取游離或鑲嵌于煤的大分子結(jié)構(gòu)中的化合物。因此，推測這些物質(zhì)可能是由微生物分解煤中非水溶性化合物后所產(chǎn)生，雖然這些化合物是水溶性的，但由于其游離或鑲嵌于煤大分子結(jié)構(gòu)中，其并未釋放到培養(yǎng)液中，需要在甲醇萃取作用下才能釋放出來。

3 結(jié)論

a.70℃條件下，利用去離子水萃取結(jié)合減壓蒸餾濃縮的方法能有效提取義馬褐煤中的水溶性有機質(zhì)，這些有機質(zhì)能被微生物利用并產(chǎn)生甲烷，甲烷產(chǎn)量為0.15 mmol/g。

圖3 W2 組實驗前后煤樣甲醇萃取組分GC-MS 分析Fig.3 GC-MS analysis of methanol extracts of W2 group before and after experiment

b.義馬褐煤的水萃取物中共檢測到190 種有機化合物，其分子量主要集中在200～300 Da。經(jīng)生物產(chǎn)氣后水溶物中化合物的分子量降至150～200 Da，化合物數(shù)量顯著減少，分子量顯著降低，形成的產(chǎn)物多為含苯環(huán)和雜原子的化合物。

c.水溶性有機物從褐煤釋放到水中是一個緩慢的過程，在微生物降解煤產(chǎn)甲烷相互過程中，非水溶性有機物是甲烷產(chǎn)生的重要來源。產(chǎn)甲烷微生物能降解利用煤中非水溶性有機物并產(chǎn)生部分水溶性有機物，如甲酰胺、乙酰胺、亞硫酸二甲酯。

d.研究證實，高溫條件下褐煤中水溶性有機質(zhì)具有產(chǎn)氣潛力，如果能通過某些溫和的方法促進煤中水溶性有機物的釋放進而被微生物轉(zhuǎn)化成甲烷，將能夠促進煤的生物產(chǎn)氣過程。

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