劉宗躍，楊宏，王少倫，王佳偉

（北京工業(yè)大學(xué)水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點實驗室，北京100124）

引 言

硝化細菌大多數(shù)屬于好氧自養(yǎng)型，相比于反硝化細菌等異氧菌，其世代時間長、增殖速率慢，易受到溫度、溶解氧（DO）、pH、毒性物質(zhì)的影響[1-2]。硝化細菌的這些特性會直接影響到氨氮廢水處理出水的穩(wěn)定性。提高硝化細菌濃度來強化處理效果是一種有效途徑。通過包埋固定化技術(shù)將特定的功能菌群固定起來，能真正實現(xiàn)污水處理有效功能菌相對較高濃度的存在[3]，從而可解決活性污泥法單泥系統(tǒng)中各菌群相互制約、相互影響，導(dǎo)致各功能菌群不能充分發(fā)揮最佳生化性能的問題。同時針對不同的污水類型包埋固定化可以實現(xiàn)定性定量的投加[4]。因此，快速有效地篩選、馴化出性能優(yōu)良的硝化細菌種群是通過包埋技術(shù)實現(xiàn)生物脫氮的有效途徑。

現(xiàn)階段，國內(nèi)外有關(guān)硝化細菌中試規(guī)模的研究，常見的是采用活性污泥富集硝化污泥。冬季污水廠出水總氮濃度達標困難，被富集的硝化細菌直接接種到主流工藝后硝化能力會提高，氮的去除效率也會隨之提高[5]。但隨著后期運行時間的推移，富集的硝化細菌難以在系統(tǒng)中穩(wěn)定存在，需要不斷地補加污泥。通過富集培養(yǎng)后高效的硝化細菌作為包埋固定化的菌源，對含氮污廢水實現(xiàn)定量投加，不僅能增加硝化細菌的濃度而且能穩(wěn)定存在，并且較少地產(chǎn)生剩余污泥[6]。

本實驗通過工業(yè)級生物反應(yīng)器探究快速培養(yǎng)硝化細菌的技術(shù)途徑，為包埋固定化技術(shù)提供高效、穩(wěn)定的硝化細菌菌源。

1 材料與方法

1.1 污泥富集培養(yǎng)材料與方法

本實驗采用大型的工業(yè)級生物反應(yīng)器，通過PCL 控制實驗參數(shù)（pH、DO、溫度）進行硝化細菌富集培養(yǎng)探究。

營養(yǎng)物質(zhì)采用實驗室人工配制原液。由于反應(yīng)器有效容積過大，原藥箱配制高氨氮溶液，初始氨氮濃度為50 mg·L-1。組分組成（高濃度氨氮按倍數(shù)增加）及常量元素質(zhì)量濃度：NH4Cl 156.5 mg·L-1，NH4H2PO442.64 mg·L-1，MgSO4·7H2O 20 mg·L-1，CaCl210 mg·L-1。pH 用Na2CO3溶液調(diào)節(jié)，每1 L 水中加入100 g Na2CO3，即堿水濃度100 g Na2CO3·L-1。

微量元素組分組成：ZnSO4·7H2O 0.12 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.12 mg·L-1，CoCl2·6H2O 0.15 mg·L-1，F(xiàn)eCl3·6H2O 1.5 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.03 mg·L-1，NiCl2·6H2O 0.12 mg·L-1，Mn2SO4·H2O 0.12 mg·L-1。每1 L藥箱原水加入1 ml的微量元素。

1.2 實驗裝置、運行工況與培養(yǎng)方式

1.2.1 實驗裝置 污泥富集裝置示意圖見圖1。實驗原始污泥取自實驗室原有經(jīng)過馴化的硝化污泥（由高碑店污水廠A2O 回流活性污泥馴化），該污泥閑置20余天但仍具有硝化活性。

圖1 污泥富集裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of sludge enrichment device

1.2.2 運行工況 反應(yīng)器總?cè)莘e為3000 L，有效容積控制在2500 L。培養(yǎng)分三個階段進行，各階段工況參數(shù)見表1。

表1 各階段運行工況Table 1 Operation conditions of each stage

1.2.3 培養(yǎng)方式 整個培養(yǎng)過程采用氨氮流加-間歇式運行[7]，分為反應(yīng)、沉淀、排水、進水。反應(yīng)階段氨氮流加進藥、堿箱自動加堿。為了控制反應(yīng)器有效體積2500 L 左右和FNA(游離亞硝酸鹽)不至于抑制AOB（氨氧化細菌）、NOB（亞硝酸鹽氧化細菌），需要定期排水，排水周期根據(jù)不同氨氧化效率下產(chǎn)生FNA 值進行調(diào)整。排水過程中通過加清水再排水程序?qū)ξ勰噙M行清洗。適當排除部分污泥以淘洗非目標菌群而篩選AOB 菌群，以及適當控制AOB污泥齡[7]。

（1）反應(yīng)：氨氮流加、PCL 自控柜控制計量泵自動加堿、溶解氧通過閥門控制氣量。

（2）沉淀：沉淀時間30 min（為保證硝化污泥充分沉淀，防止硝化細菌被排出）。

（3）排水：將沉淀上清液經(jīng)高位排水管排出反應(yīng)器，容積排至500 L左右。排水時間30 min。

（4）進水：排水完成后將水加至沒過探頭（pH、DO、溫度），此時反應(yīng)器體積為1500 L，溫度通過發(fā)酵罐的加熱水套水浴加熱到25℃后開始運行。

1.3 分析項目及檢測方法

采用Illumina HiSeq2500PE250高通量測序平臺對樣品進行測序。包括DNA 提取與PCR 擴增，DNA文庫定量、測序和生物多樣性分析[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 硝化細菌富集結(jié)果分析

圖2中進水氨氮濃度為藥箱平均每小時進入反應(yīng)器中的氨氮濃度（經(jīng)過體積折算）。由圖2可以看出，在A階段初期硝態(tài)氮生成比例較高，亞硝態(tài)氮積累率較低。隨著后期培養(yǎng)時間的增加，亞硝態(tài)氮生成比例逐漸變高。在B階段硝態(tài)氮生成量開始出現(xiàn)下降，亞硝態(tài)氮生成量隨著進水氨氮濃度的升高而逐漸升高，在B 階段末期亞硝態(tài)氮積累率處于一個較高的水平上。C 階段處于規(guī)律排泥階段，硝態(tài)氮生成量處于一個較穩(wěn)定的狀態(tài)。從整個培養(yǎng)時期來看，運行階段的出水氨氮控制在30 mg·L-1以下，進水負荷的濃度根據(jù)氨氧化效率的變化而改變。硝態(tài)氮生成量呈現(xiàn)一個先增加后下降趨勢，亞硝態(tài)氮生成量不斷上升。推測原因：隨著氨氧化效率的升高，反應(yīng)器體系里亞硝態(tài)氮的積累量逐漸增多，反應(yīng)周期結(jié)束排水時平均亞硝態(tài)氮濃度達1500 mg·L-1，對應(yīng)FNA 為0.031[10]，該濃度下FNA 已經(jīng)對NOB 產(chǎn)生抑制作用。B 階段末期通過排泥，可以有效控制AOB與NOB之間污泥齡的差異。

圖2 各階段進出水NH4+-N和NO2--N、NO3--N生成量變化曲線Fig.2 Change curve of NH4+-N,NO2--N and NO3--N production in the inflow and outflow water of each stage

在圖3 中可以看出在A 階段末第24 天，污泥濃度為3000 mg·L-1左右時，污泥增長速率最快，與其相對應(yīng)的氨氧化速率也呈現(xiàn)較快的增長。進入B、C階段后污泥增長速度較A 階段開始減緩，而B 階段末期第60 天開始取泥。在開始取泥后的幾天發(fā)現(xiàn)氨氧化速率有較高的增長，說明適度排泥可以實現(xiàn)AOB的進一步篩選。在第130天污泥濃度重新降低至2820 mg·L-1。觀察其污泥濃度又呈現(xiàn)較高速率的增長，可以驗證在A 階段末期（第24 天）為污泥快速增長期。當反應(yīng)器中污泥濃度較高時，由于其基數(shù)大，單位時間產(chǎn)生新鮮污泥的量就越多，但用藥量也就越多。綜合考慮污泥增速和培養(yǎng)成本，選擇污泥濃度為3000～4000 mg·L-1作為最佳細菌增長控制濃度。其穩(wěn)定運行階段每天產(chǎn)出干泥量為0.3 kg·(m3·d)-1，濕泥（含水率85%）為2 kg·(m3·d)-1。

圖3 氨氧化速率及污泥濃度增長曲線Fig.3 Ammonia oxidation efficiency and sludge concentration growth curve

對0～60 d 污泥濃度（取對數(shù)值）與培養(yǎng)時間作圖發(fā)現(xiàn)其近似符合單種群增長的“S”形曲線。硝化細菌最大增殖速率與自養(yǎng)型細菌增殖動力學(xué)有關(guān)。由于影響菌群增長的因素眾多,而且它們對增長過程的影響也不同步,所以菌群細胞特征為一隨時間而變化的多元函數(shù), 是一個不斷變化的動態(tài)體系，由于菌群組成的異質(zhì)性,動力學(xué)過程的分析也遠較化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)復(fù)雜[11-14]。logistic 方程、Monod 方程以及Michaelis-Menten 方程都可用于描述“S”形增長過程[15]，其中μmax（最大比增長速率）是最關(guān)鍵的一個參數(shù)。它比半飽和常數(shù)KNH對于廢水的濃度更敏感,而且它能決定防止出現(xiàn)硝化菌流失的最短污泥停留時間[16-17]。溫度、溶解氧、起始污泥濃度、體系中氨氮濃度以及有機物均會對自養(yǎng)細菌最大增長速率產(chǎn)生重要影響[18]。

由圖4 可知，A 階段較B、C 階段比氨氧化速率和亞硝態(tài)氮積累率增速較快。說明從啟動初期到結(jié)束24 d 內(nèi)，原始污泥經(jīng)歷了快速篩選過程，硝化污泥在整個污泥系統(tǒng)中快速占據(jù)了主導(dǎo)地位。而B階段隨著污泥濃度的增高，經(jīng)過繼續(xù)培養(yǎng)比氨氧化速率和亞硝態(tài)氮積累率增長速度放緩。C 階段經(jīng)過不斷的取泥過程，比氨氧化速率和亞硝態(tài)氮積累率呈現(xiàn)緩慢增長并穩(wěn)定下來。通過對比B、C 階段的培養(yǎng)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，150 d 較60 d 的比氨氧化速率、亞硝態(tài)氮積累率同比增長率分別為9.5%、2.2%。而通過下文高通量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)兩者高通量中AOB 占比分別為27%和52%，同比增長率為92%。說明隨著培養(yǎng)時間的延長，污泥濃度的增加及規(guī)律的排泥雖然使得AOB 在生物群落中占比大大增加，但在氨氧化速率和亞硝態(tài)氮積累率上并沒有得到快速響應(yīng)。因此通過較短的時間對原始污泥進行馴化，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)硝化細菌在生物群落中快速占據(jù)一定的比例，且培養(yǎng)經(jīng)濟性最佳。

圖4 比氨氧化速率和亞硝態(tài)氮積累率變化曲線Fig.4 Change curve of specific ammonia oxidation efficiency and nitrite nitrogen accumulation rate

2.2 高通量測序結(jié)果分析

2.2.1 菌群聚類及多樣性分析 L0～L3 為系統(tǒng)運行時第0 d、60 d、150 d、180 d 的污泥樣。四組樣品的16S rRNA基因文庫高通量測序，污泥起始樣（L0）與富集培養(yǎng)后的污泥樣（L1、L2、L3）Alpha 多樣性指標結(jié)果見表2。

表2 Alpha多樣性指標計算結(jié)果Table 2 Calculation results of Alpha diversity index

經(jīng)歷一段時間的培養(yǎng)篩選，從ACE 指數(shù)下降可以看出污泥系統(tǒng)中微生物種群的豐度大幅度下降。Shannon 指數(shù)由最初的3.44 降至2.54，Simpson 指數(shù)由最初的0.12 上升至0.30，說明經(jīng)過定性篩選適應(yīng)環(huán)境的硝化細菌大量增殖，菌群的多樣性和均勻性在降低。功能菌群在系統(tǒng)中逐步占據(jù)主導(dǎo)地位并且穩(wěn)定下來。Wittebolle 等[19]指出微生物種群的均勻性越高，該系統(tǒng)在應(yīng)對環(huán)境沖擊時的功能穩(wěn)定性越好。但因包埋固定化技術(shù)可以實現(xiàn)對菌群的良好保護，因此即使在功能菌群占比高、整體菌群均勻性低的情況下仍能應(yīng)對復(fù)雜水質(zhì)及沖擊負荷。而且能夠充分發(fā)揮優(yōu)勢功能菌群的作用，維持系統(tǒng)穩(wěn)定性[20]。

2.2.2 硝化功能菌群變化分析 圖5～圖8 分別對應(yīng)L0～L3 屬層次污泥樣本豐度餅圖。L0 樣品中未分類菌種占比高達80.11%，推測原因可能是污泥經(jīng)過一個較長時間放置長期處于缺氧厭氧狀態(tài)使得其中的雜菌滋生。 具有硝化作用的菌屬Nitrosomonas 僅占7.75%，NOB 未檢出。其他菌屬多以反硝化功能的兼性厭氧菌、芽單孢桿菌屬和其他雜菌構(gòu)成。經(jīng)歷A、B 兩個階段的培養(yǎng)L1 樣本高通量顯示，亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)已變成反應(yīng)器體系中第一大優(yōu)勢菌種占比27.7%，硝化桿菌（Nitrobacter）占比2.67%。

圖5 原始污泥的種群分布Fig.5 Population distribution of original sludge

圖6 60 d的種群分布Fig.6 Population distribution in 60 days

圖7 150 d的種群分布Fig.7 Population distribution in 150 days

圖8 180 d的種群分布Fig.8 Population distribution in 180 days

C 的階段末期和后期運行對應(yīng)的L2、L3 樣本顯示，亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas(AOB)占比分別是52.33%、56.59%。硝化桿菌屬Nitrobacter（NOB）占比分別是1.15%、0.67%。通過繼續(xù)培養(yǎng)并不斷產(chǎn)泥過程，發(fā)現(xiàn)AOB 不僅能占據(jù)主導(dǎo)地位并且占比逐步變高。分析有以下原因：（1）后期pH 維持著較高的水平8.0以上（普遍認為AOB比NOB適宜生長pH條件較高，適宜AOB生長的pH范圍為7.0～8.5，NOB為6.0～7.5[21-22]）。（2）隨著后期污泥濃度增大，氨氧化速率變高，雖然排水周期縮短，但水中亞硝酸鹽濃度積累過高，F(xiàn)NA 對NOB 逐漸產(chǎn)生了抑制（游離亞硝酸完全抑制NOB 和AOB 生長的濃度分別為0.02 mg·L-1和0.4 mg·L-1[23-25]，反應(yīng)器排水時平均亞硝酸鹽濃度1500 mg·L-1，此時FNA=0.031 大于0.02[26]）。（3）排泥的過程就是AOB 篩選的過程。由于氨氧化細菌（AOB）較硝化細菌（NOB）世代時間短[27]、繁殖速率快，所以規(guī)律快速的排泥使細菌得到了篩選。

通過對比三個階段的高通量和數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)繼續(xù)污泥濃度的增加及規(guī)律的排泥在硝化效率和積累率上并沒有得到快速響應(yīng)。從實際培養(yǎng)效果來看，一方面一味地提升AOB 的占比使其成為菌群結(jié)構(gòu)中絕對優(yōu)勢菌屬并不能相應(yīng)地帶來較好的比氨氧化速率。這可能與菌群之間的協(xié)同、共生作用有關(guān)。有研究表明污水生物處理工藝(包括硝化工藝)作為多物種共存的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，其所表現(xiàn)出的系統(tǒng)功能不僅受特定功能菌群的影響，還與共存的其他物種有關(guān)[28-29]。另一方面反復(fù)的篩選需要較長的培養(yǎng)時間和較大的經(jīng)濟成本。

2.2.3 微生物種群結(jié)構(gòu)變化 選取污水廠2個活性污泥樣分別命名為H1、H2，圖9中分別從門、綱和屬水平分析了活性污泥與各培養(yǎng)階段的硝化污泥微生物種群結(jié)構(gòu)變化。6 個樣本中相對豐度大于1%的菌門類共檢測到13 個，其中變形菌門（Proteobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為各個樣本的主要優(yōu)勢菌門。盡管從門種類上來看各樣本種群組成基本相同，但從單個門類的相對豐度和構(gòu)成來看存在明顯的差異。L0 中擬桿菌門為其第一大類優(yōu)勢菌門，相比其他樣品其占比高達49.95%。觀察其對應(yīng)的綱水平下發(fā)現(xiàn)鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)為主要貢獻者。研究表明，Sphingobacteria 作為一種能夠產(chǎn)生鞘脂的細菌，包括聚糖菌等細菌[30]。正由于其特殊的鞘脂結(jié)構(gòu)和體內(nèi)富集的PHA 等高能物質(zhì)的存在，其對于饑餓環(huán)境有著較強的抵抗能力，故而可以在長期饑餓環(huán)境中得以生存。H1、H2 作為平行樣，無論從門、綱和屬上物種相對豐度差別不大。而各個樣本從門、綱種類上種群組成相同可印證它們之間的同源性。后期培養(yǎng)過程中由于定向篩選的原因而導(dǎo)致種群豐度上的明顯差異，這一點從各個樣本屬層次的差異性更能看出。經(jīng)過24 d 培養(yǎng)L1 樣本與L0相比，擬桿菌門（Bacteroidetes）有大幅度下降。表現(xiàn)在綱水平分別是鞘脂桿菌綱(Sphingobactera)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、黃桿菌綱(Flavobacteria)等異養(yǎng)菌的大量減少。說明經(jīng)歷短暫的好氧底物投加即可以實現(xiàn)對異養(yǎng)菌的快速淘洗。與初期L0樣本相比，L2、L3 樣本在變形菌門（Proteobacteria）和鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)水平上分別有平均30%、37%增長。 這主要由屬水平上亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）增長的結(jié)果導(dǎo)致。從整個培養(yǎng)時期的種群結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)，通過工業(yè)級生物反應(yīng)器定性短期篩選可以實現(xiàn)特定菌門、特定菌屬的優(yōu)勢富集。

圖9 污泥樣本中含量大于1%的細菌序列的相對豐度（門、綱和屬水平）Fig.9 Relative abundance of bacterial sequences(at the level of phylum,class and genus)containing more than 1%in sludge samples

3 結(jié) 論

（1）通過工業(yè)級反應(yīng)器富集培養(yǎng)硝化細菌數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在起始階段末期24～27 d，污泥濃度3000～4000 mg·L-1左右時污泥增長速率最快、產(chǎn)泥經(jīng)濟性最佳。其穩(wěn)定運行階段每天產(chǎn)出干泥量為0.3 kg·(m3·d)-1，濕泥（含水率85%）為2 kg·(m3·d)-1。

（2）從整個培養(yǎng)過程中的高通量在不同水平上的變化可以說明通過生物反應(yīng)器定性短期篩選可以實現(xiàn)特定菌門、特定菌屬的優(yōu)勢富集，并且以較短時間即可實現(xiàn)功能菌篩選及產(chǎn)出。

（3）證明了該生物反應(yīng)器對硝化細菌規(guī)?；焖俑患囵B(yǎng)并穩(wěn)定產(chǎn)泥方法的可行性。為包埋固定化技術(shù)實現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用在菌源制備方面提供了技術(shù)路線。通過硝化細菌培養(yǎng)實驗探究，優(yōu)化了培養(yǎng)周期，解析了菌群演變規(guī)律。