李聰聰,朱秉堅(jiān),徐 琳,李香真,姚敏杰

1 中國科學(xué)院成都生物研究所,環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 環(huán)境微生物四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610041

2 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

3 福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院土壤修復(fù)福建省高校工程研究中心,福州 350002

在植物的內(nèi)部(內(nèi)生菌)和表面(附生菌)都存在著大量的微生物,構(gòu)成植物微生物組(plant microbiome)[1]。植物內(nèi)生微生物長期與植物共同進(jìn)化,與宿主植物建立了共生關(guān)系[2]。植物內(nèi)生菌參與了植物的眾多生命過程,如通過分泌生長激素(例如吲哚乙酸IAA)來促進(jìn)植物生長[3],促進(jìn)植物對營養(yǎng)元素氮、磷的獲取[4-5],調(diào)節(jié)植物免疫系統(tǒng),增強(qiáng)對病原菌的抵抗力[6]等。內(nèi)生微生物通常受宿主植物類型、植物不同部位、植物生長環(huán)境和土壤類型等多種因素的影響[7-8],但關(guān)鍵因子隨環(huán)境條件的變化而變化,目前還沒有統(tǒng)一的定論。

通常來說,不同植物相同部位微生物群落存在一定的差異,對楊樹Populus,槲皮樹Quercus和松樹Pinus三種植物根內(nèi)微生物進(jìn)行454擴(kuò)增子測序,結(jié)果表明植物類型是影響木本植物根內(nèi)細(xì)菌群落差異的主要因子[9]；進(jìn)一步,利用16 S rRNA基因Illumina測序技術(shù)對18種草根內(nèi)和根際微生物的研究中同樣發(fā)現(xiàn)植物類型是影響草根部微生物群落分化的主要因子[10]；然而利用焦磷酸測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)同一生長環(huán)境下的擬南芥(Arabidopsisthaliana)與其近緣種碎米薺(Cardaminehirsuta)根內(nèi)微生物群落沒有顯著差異[11]；類似的,對仙人掌科兩種植物Myrtillocactusgeometrizans和Opuntiarobusta采用16 S rRNA Illumina測序技術(shù)對其根內(nèi)、根際微生物分析表明,植物類型對兩種植物之間根部微生物群落的分化的影響很小[12],說明不同宿主對其微生物組的選擇作用不一樣。同種植物不同部位微生物組存在一定差異,Gottel等[13]利用16S rRNA基因454測序方法比較了成年楊樹根內(nèi)和根際細(xì)菌群落的組成,發(fā)現(xiàn)二者在組成和群落結(jié)構(gòu)上存在顯著差異。同時(shí),植物的各部位又存在緊密的聯(lián)系,Bai等[14]通過分離培養(yǎng)技術(shù)和無菌植物微生物定殖實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)擬南芥根際和葉際微生物群落結(jié)構(gòu)明顯不同,但微生物群落組成部分相同,而且擁有共同的功能。土壤是植物內(nèi)生菌的“種子庫”[15],影響著植物內(nèi)生菌的組成,土壤中微生物多樣性顯著高于植物內(nèi)生微生物群落。在微生物組成上,土壤與植物內(nèi)生菌存在一定差異,從門水平上看植物內(nèi)變形菌門相對豐度較高,而土壤中放線菌門更高[16]；從更低級的分類水平上看,例如屬、種水平,則因宿主和外界環(huán)境而異,例如有研究發(fā)現(xiàn),干旱條件下多種草的根內(nèi)鏈霉菌屬Streptomyces顯著增加,與土壤存在顯著差異[10]。盡管對不同植物地上地下不同部位微生物研究的很多,但對自然狀態(tài)下生長的植物,尤其是嚴(yán)苛環(huán)境下的高寒草甸優(yōu)勢植物研究較少。不同優(yōu)勢植物根內(nèi)、葉內(nèi)原核微生物群落的構(gòu)成、關(guān)鍵控制因子及其與非根際土壤微生物群落在組成和結(jié)構(gòu)上的差異和聯(lián)系還有待進(jìn)一步探索。

青藏高原高寒草甸是一類重要的生態(tài)系統(tǒng)和高山植物基因庫, 也是我國主要的天然牧場,而草甸植物尤其是優(yōu)勢植物對草地畜牧業(yè)發(fā)展和高寒生態(tài)系統(tǒng)功能的維持具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)存在宿主特異性內(nèi)生菌,這些內(nèi)生菌在寒冷條件仍然具有溶解礦物磷,分解蛋白酶等功能,在寒冷條件下表現(xiàn)出冷適應(yīng)性[2, 17],可能通過協(xié)助植物營養(yǎng)吸收等作用來幫助植物在寒冷條件下健康生長。青藏高原特殊的高寒缺氧環(huán)境,屬于全球變化的敏感區(qū)和生態(tài)系統(tǒng)的脆弱地區(qū),闡明高寒草甸優(yōu)勢植物與微生物的相互作用,對系統(tǒng)認(rèn)知高寒生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能和保護(hù)有著重要意義。青藏苔草(Carexmoorcroftii)、火絨草(Leontopodiumjacotianum)、高山嵩草(Carexparvula)是青藏高寒草原、高寒草甸的優(yōu)勢植物。我們以這三種植物為對象,研究了植物葉內(nèi)、根內(nèi)和非根際土壤的原核微生物群落的組成和多樣性,旨在揭示以下三個(gè)科學(xué)問題：1)葉內(nèi)、根內(nèi)和非根際土壤的原核微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性的差異；2)原核微生物群落與樣品來源類型(植物葉內(nèi)、根內(nèi)以及土壤)、不同植物類型之間的關(guān)系；3)植物葉內(nèi)、根內(nèi)特有的內(nèi)生菌及其潛在的功能。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究采樣點(diǎn)在中國科學(xué)院青藏高原研究所那曲生態(tài)環(huán)境綜合觀測研究站(E 91°12′,N 30°31′)。該實(shí)驗(yàn)站位于藏北高原的腹地那曲縣境內(nèi),海拔均在4450 m以上,屬于高原亞寒帶季風(fēng)半濕潤氣候區(qū),年均降水量為406.2mm,多集中在6—9月間,相對濕度只有51%[18]。青藏高原上分布著各類草地面積約1.4億hm2畝,其中高寒草甸約占50%,是那曲草原畜牧業(yè)的主要草地利用類型,植被群落以高寒小嵩草草甸、藏嵩草草甸群落為主,也是我國第五大放牧區(qū)?？紤]到植物類型對植物微生物的影響,本研究在那曲實(shí)驗(yàn)站的高寒草甸上選取了兩種單子葉植物青藏苔草(Carexmoorcroftii)、高山嵩草(Carexparvula)和一種雙子葉植物火絨草(Leontopodiumjacotianum)為研究對象。青藏苔草和高山嵩草屬于苔屬植物,火絨草屬于火絨屬植物,這三種植物是高寒草甸三種典型的草本植物,分布廣泛[19]。

1.2 采集方法

于2018年7月份生長季采集植物。將整株植物挖出,用無菌剪刀分別剪部分植物嫩葉和嫩根,分別裝在50 mL無菌離心管里,取每一個(gè)植物樣品時(shí)對應(yīng)地取植物周邊0—10 cm深的非根際土壤裝入50 mL無菌離心管中。每種植物及其對應(yīng)的土壤均采集6個(gè)重復(fù)樣品。采集的樣品放在冰塊上運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-20℃冰箱保存,進(jìn)行后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)。

1.3 DNA 提取、PCR擴(kuò)增及高通量測序

將土壤直接稱量到帶有無菌玻璃珠的離心管中,用Mini-bead beater(Biospec MiniBeadbeater- 16,USA)破碎；根和葉分別用滅菌后的PBS緩沖液(PBS：130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4, pH 7.4)清洗6次,充分洗掉表面附著物,液氮磨碎后放入帶有無菌玻璃珠的離心管中。土壤、葉內(nèi)、根內(nèi)總DNA根據(jù)MO BIO的DNA提取試劑盒(Power Soil DNA Isolation kit)的流程提取,對提取的DNA利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)量檢測,將高質(zhì)量的DNA模板統(tǒng)一稀釋到10 ng/μl用于后續(xù)的16S rRNA基因的 PCR反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中用到的擴(kuò)增引物為：515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTA- 3′), 909R (5′-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT- 3′)[20]。反應(yīng)體系為25 μl：包括2 ×Es Taq Master Mix (康為世紀(jì),中國) 12.5 μl、引物各1 μl(濃度為1 μM)、DNA 模板10 ng、超純水(ddH2O) 9.5 μl。PCR 反應(yīng)程序?yàn)? 預(yù)變性(94℃,4 min),變性(94 ℃,30 s),退火(55 ℃,30 s),延伸(72 ℃,45 s)共30個(gè)循環(huán),最后72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用膠回收試劑盒AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)純化后,利用NanoDrop 分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)量檢測,合格的樣品進(jìn)行等摩爾質(zhì)量混合,使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒建庫并利用Illumina HiSeq測序儀進(jìn)行PE250測序。

1.4 生物信息處理

雙端測序下機(jī)數(shù)據(jù)用Flash- 1.2.8軟件[21]合并,不同樣品根據(jù)barcode的唯一性借助Fastx Toolkit軟件(hannonlab.cshl.edu/fastx toolkit/ind3ex.html)進(jìn)行拆分。 序列的質(zhì)控、過濾、嵌合體的去除利用QIIME[22]平臺上進(jìn)行：低質(zhì)量的序列(Q<30)和長度不足300 bp的序列去掉,嵌合體采用UCHIME[23]算法過濾,進(jìn)而得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。利用QIIME平臺的CD-HIT算法將具有至少97%相似性的序列聚類為一個(gè)操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTU)。采用RDP classifier[24]算法對97%水平OTU進(jìn)行分類學(xué)劃分, 16S rRNA基因比對數(shù)據(jù)庫為Greengenes(V13.8),去除分類為葉綠體以及未分類的OTU。為了計(jì)算α多樣性以及β多樣性,將所有樣品隨機(jī)重抽樣到1000條序列,最后總共得到3769個(gè)OTU。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用Kruskal-Wallis和Dunn′s Kruskal-Wallis Multiple Comparisons[25]檢驗(yàn)門水平微生物類群的豐度在植物不同部位和不同植物之間的差異。不同部位相同OTUs比例的venn圖由線上服務(wù)器工具構(gòu)建(http://bioinfogcnb.csic.es/tools/venny/index.html)。α多樣性指數(shù)包括Shannon 多樣性指數(shù)、物種均勻度(Pielou′s evenness index)以及觀察到的物種數(shù)(Observed species)借助R中vegan包中的“diversity”函數(shù),“specnumber”函數(shù),“estimate”函數(shù)完成計(jì)算。利用R中的vegan包的“vegdist”函數(shù)計(jì)算Bray-Curtis相異矩陣, 然后利用vegan包中“metaMDS”函數(shù)進(jìn)行非度量多維尺度分析(NMDS)。置換多元方差分析(PERMANOVAs)[26]用來檢驗(yàn)微生物群落結(jié)構(gòu)組成在不同部位和不同植物類型間的差異。利用STAMP[27](v2.1.3)軟件的Kruskal-WallisH-test和Welch′s多重檢驗(yàn)方法找出與土壤有顯著性差異的內(nèi)生菌OTU。進(jìn)一步,利用PICRUSt,基于KEGG數(shù)據(jù)庫來預(yù)測葉內(nèi)和根內(nèi)高豐度差異OTU(相對豐度>1%)的潛在功能。

2 結(jié)果

2.1 三種植物不同部位微生物組成

青藏苔草、火絨草、高山嵩草葉內(nèi)、根內(nèi)以及非根際土壤原核微生物在門分類水平上的組成如圖1所示。其中,變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)在三種植物葉內(nèi)和根內(nèi)占據(jù)主導(dǎo)地位,平均相對豐度之和高達(dá)70% 以上；而土壤中則以變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門作為優(yōu)勢門類,平均相對豐度之和高達(dá)60%以上。各門類在各部位和不同植物中的相對豐度以及差異性見表 1。結(jié)果表明,放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門(Chloroflexi)、泉古菌門(Crenarchaeota)、浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌(Gemmatimonadetes)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)在土壤中相對豐度較高,與根內(nèi)和葉內(nèi)有顯著性差異(P<0.001)；而葉內(nèi)富含變形菌門和厚壁菌門,與根內(nèi)和土壤相比具有顯著差異(P< 0.001)；根內(nèi)大部分門類相對豐度介于土壤和葉內(nèi)之間。葉內(nèi),根內(nèi)以及土壤之間的venn如圖2,根內(nèi)與土壤有27.7%的共有OTUs,而葉內(nèi)與土壤有14%的共有OTUs,說明植物根系微生物組裝受土壤微生物群落的影響更大,而葉微生物群落的組裝則較少依賴于土壤微生物群落。另外,土壤中存在大量特有的微生物,比例達(dá)到42.5%。

圖1 三種植物根內(nèi)、葉內(nèi)以及土壤原核微生物在門水平上優(yōu)勢群組成

圖2 植物葉內(nèi)、根內(nèi)以及土壤之間特有和共有的OTUs

從不同植物來看,只有變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)以及FBP門在相同部位不同植物之間有顯著性差異(表 1)。兩種單子葉植物青藏苔草與高山嵩草葉內(nèi)在變形菌門、擬桿菌門相對豐度上有顯著性差異；根內(nèi)在厚壁菌門、疣微菌門有顯著性差異。雙子葉植物火絨草與單子葉植物高山嵩草葉內(nèi)在厚壁菌門、擬桿菌門以及FBP相對豐度上有顯著性差異；根內(nèi)在厚壁菌門上也有顯著性差異。而雙子葉植物火絨草與另一種單子葉植物青藏苔草各優(yōu)勢微生物門無顯著性差異。三種植物對應(yīng)的土壤間在所有門類上都無顯著性差異,說明植物對內(nèi)生菌有更強(qiáng)選擇性?？傮w來看,大多數(shù)原核生物門類(13個(gè)門)在葉內(nèi)、根內(nèi)和土壤樣品間具有顯著性差異,而少數(shù)門類(5個(gè)門)在不同植物相同部位或土壤之間具有顯著性差異。說明了樣品來源類型,亦可說葉內(nèi)、根內(nèi)以及土壤的空間生態(tài)位分異是造成微生物組成差異的主要原因,而植物種類對植物微生物的選擇性相對較小。

表1 三種植物葉內(nèi)和根內(nèi)及土壤原核微生物優(yōu)勢門的相對豐度/%

2.2 植物內(nèi)生原核微生物群落的α多樣性

我們計(jì)算了三種植物不同部位內(nèi)生原核微生物群落的Shannon多樣性指數(shù)、物種均勻度(Pielou′s evenness index)以及觀察到的物種數(shù)(Observed species)(表 2、圖3)。相同植物不同部位葉內(nèi)、根內(nèi)以及土壤α多樣性均具有顯著性差異(P<0.001),并且從葉內(nèi)、根內(nèi)再到土壤,α多樣性逐漸升高。此外,土壤樣品間α多樣性差異較小,而葉內(nèi)和根內(nèi)樣品間α多樣性差異較大。從不同植物類型來看,三種植物在土壤和根內(nèi)α多樣性上均具顯著性差異(P<0.05),但在葉內(nèi)α多樣性上沒有顯著性差異。另外,青藏苔草在葉內(nèi)和根內(nèi)Shannon多樣性、均勻度和觀察到的物種數(shù)上都要高于高山嵩草和火絨草。單子葉植物青藏苔草與火絨草α多樣性在土壤和根內(nèi)均沒有顯著性差異,而兩種單子葉植物青藏苔草和高山嵩草α多樣性在土壤和根內(nèi)有顯著性差異,這種結(jié)果說明植物類型對微生物的選擇性較弱,與前面物種組成的分析結(jié)果是一致的。

表2 三種植物葉內(nèi)、根內(nèi)以及土壤原核微生物群落α多樣性指數(shù)

圖3 三種植物葉內(nèi)、根內(nèi)以及非根際土壤的香濃多樣性

2.3 影響植物微生物群落差異的因素

基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度分析(NMDS)用來展示微生物群落間的差異(圖4)。在NMDS圖中,首先可以看到所有樣品按照不同部位在NMDS1維度分開,說明植物部位對植物微生物群落結(jié)構(gòu)的分化有影響；其次,在NMDS2維度,相同部位按照植物類型聚集形成不同的集團(tuán),表明不同植物類型對微生物群落結(jié)構(gòu)差異也有一定的影響。另外,根內(nèi)微生物群落處于葉內(nèi)和土壤樣品之間,而葉內(nèi)和土壤微生物群落相隔較遠(yuǎn),說明了微生物在植物根內(nèi)的定殖受土壤微生物群落影響更大,而植物對葉內(nèi)微生物群落的選擇受土壤微生物群落影響較小。

圖4 三種植物根內(nèi)、葉內(nèi)以及土壤原核微生物群落基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度分析(NMDS)

基于Bray-Curtis距離置換多元方差分析(PERMANOVA)檢驗(yàn)微生物群落結(jié)構(gòu)組成在不同因子間的差異(表 3)。結(jié)果表明,樣品類型(葉內(nèi)、根內(nèi)、土壤)、植物類型以及二者的交互作用都對微生物群落差異有顯著性影響,總共解釋了微生物群落51.94%的變異。其中樣品類型對微生物群落間差異貢獻(xiàn)度最大(R2=20.13%,P<0.001),其次是植物類型和樣品類型的交互作用(R2=17.40%,P<0.05),而植物類型對微生物間變異的貢獻(xiàn)度為14.41%(P<0.001)。

表3 三種植物葉內(nèi)、根內(nèi)以及土壤原核微生物群落基于Bray-Curtis距離的置換多元方差分析(PERMANOVA)

2.4 植物內(nèi)生特異性O(shè)TU和核心OTU

部分微生物可以從土壤和根際轉(zhuǎn)移到植物內(nèi)部,但不同部位如葉內(nèi)和根內(nèi)也存在特定的與土壤有顯著性差異的微生物類群。在OTU水平上,我們將不同植物不同部位分別進(jìn)行差異比較,將與土壤有顯著性差異并且相對豐度高于土壤的內(nèi)生OTU定義為植物富集OTUs(enriched OTUs)。青藏苔草、火絨草和高山嵩草葉內(nèi)分別發(fā)現(xiàn)了16個(gè)、27個(gè)和3個(gè)富集OTUs,相對豐度之和為39.41%、15.01%、42.10%,這些OTUs主要來自變形菌門和厚壁菌門,且在土壤中相對豐度很低,大部分內(nèi)生富集OTUs在土壤中相對豐度小于0.01%,在青藏苔草、火絨草和高山嵩草周邊土壤中對應(yīng)的相對豐度之和分別為為0.72%、0.51%、0.03%,與在葉內(nèi)的高豐度形成顯著差異。部分葉內(nèi)富集OTUs能分類到屬水平上,包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)等。根內(nèi)富集OTUs在青藏苔草、火絨草和高山嵩草中分別為16個(gè)、48個(gè)和11個(gè),這些OTUs主要來自變形菌和放線菌門,相對豐度之和為17.90%、33.97%、9.62%,對應(yīng)在土壤中的相對豐度為3.72%,0.79%,0.03%。類似的,部分根內(nèi)富集OTUs能分類到屬水平上,包括假單胞菌屬、不動桿菌屬以及德沃斯氏菌屬(Devosia)。為了進(jìn)一步確認(rèn)哪些屬在葉內(nèi)或根內(nèi)屬于優(yōu)勢屬,我們從屬水平上進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn),假單胞菌屬,不動桿菌屬,鞘氨醇單胞菌屬以及德沃斯氏菌在葉內(nèi)或根內(nèi)屬于優(yōu)勢屬且與土壤有顯著差異,四種屬在三種植物不同樣品類型的相對豐度及差異分析如圖5所示,假單胞菌在青藏苔草葉內(nèi)、高山嵩草根內(nèi)以及火絨草的葉內(nèi)和根內(nèi)均顯著富集,在火絨草中相對豐度高達(dá)30%,且與土壤有顯著性差異；不動桿菌屬在三種植物葉內(nèi)和根內(nèi)豐度顯著高于土壤；鞘氨醇單胞菌在三種植物葉內(nèi)相對豐度高于根內(nèi)和土壤；德沃斯氏菌在三種植物根內(nèi)相對豐度較高,特別是在高山嵩草中顯著地富集。這些差異體現(xiàn)了不同部位和不同植物對不同屬的選擇性。

圖5 四種優(yōu)勢屬在三種植物根內(nèi)、葉內(nèi)以及非根際土壤的相對豐度

在這些富集OTU當(dāng)中有一部分OTU出現(xiàn)在80%以上的樣品中(總共18個(gè)樣品,出現(xiàn)頻率大于或等于15),我們將這部分OTU定義為核心OTU(表 4)。在葉內(nèi)共有6個(gè)核心OTU,總的相對豐度為25.62%,其中,一個(gè)屬于Bacillales,三個(gè)OTU屬于Pseudomonadales,另外兩個(gè)OTU分別屬于Enterobacteriales和Rhizobiales；根內(nèi)發(fā)現(xiàn)4個(gè)核心OTU,總的相對豐度為14.13%,其中,兩個(gè)屬于Pseudomonadales,另外兩個(gè)分別屬于Rhizobiales和Actinomycetales。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對相對豐度高于1%的富集OTUs進(jìn)行功能預(yù)測,我們在level 2水平上共發(fā)現(xiàn)了37個(gè)基因功能,包括多種代謝過程如氨基酸代謝、碳水化合物代謝、次生代謝產(chǎn)物生物合成等,環(huán)境信息處理過程如信號分子相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及膜轉(zhuǎn)運(yùn)；細(xì)胞過程如細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞生長和死亡以及細(xì)胞通訊,這些潛在的生物功能,為植物-微生物的相互作用奠定了基礎(chǔ)。

表4 根內(nèi)和葉內(nèi)核心OTU及其分類

3 討論

3.1 空間生態(tài)位的差異是決定葉內(nèi),根內(nèi),土壤原核微生物群落的關(guān)鍵因子

通過對高寒草甸三種優(yōu)勢植物青藏苔草、火絨草、高山嵩草葉內(nèi)生、根內(nèi)生以及土壤原核微生物組的研究,發(fā)現(xiàn)樣品類型是影響植物原核微生物組差異的最主要因子,體現(xiàn)了葉內(nèi),根內(nèi),非根際土壤三者在空間上生態(tài)位的差異,而植物類型對不同部位微生物的選擇性相對較弱。從門水平上看,植物內(nèi)生原核微生物組都是以變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌群[16, 28],但不同部位主要門的相對豐度有顯著性差異。變形菌門的相對豐度從土壤到根內(nèi)和葉內(nèi)不斷升高,在根內(nèi)和葉內(nèi)平均相對豐度占比都超過了50%；而放線菌門在土壤中相對豐度最高,在根內(nèi)和葉內(nèi)相對豐度降低。在對楊樹不同部位(土壤,根內(nèi),莖,葉內(nèi))的研究中也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)論[29]；水稻的根內(nèi)微生物與土壤有顯著性的差異,并且變形菌門的變化趨勢和本研究一致[30]。在OTU組成上,根內(nèi)與土壤共有28%的共有OTUs,而葉內(nèi)與土壤共有OTUs為16.2%,說明只有部分土壤微生物能夠進(jìn)入植物的根內(nèi)和葉內(nèi),植物內(nèi)生部位對微生物的選擇作用更強(qiáng)[31]。相比于樣品類型,植物類型對微生物的選擇性較弱。本研究發(fā)現(xiàn)在門分水平上絕大部分原核微生物在葉內(nèi),根內(nèi),土壤之間有顯著性差異,而在不同類型植物之間沒有顯著性差異。類似的,在α多樣性上葉內(nèi),根內(nèi),土壤間都表現(xiàn)出顯著性差異,而三種植物葉內(nèi)α多樣性之間無顯著差異。并且無論是多樣性、均勻度還是觀察到的物種數(shù),土壤微生物α多樣性遠(yuǎn)高于根內(nèi)和葉內(nèi),其中,葉內(nèi)的α多樣性最低。土壤養(yǎng)分相對含量較低,同時(shí)受到植物分泌物、枯枝落葉的影響較大,原核微生物多樣性高；而植物的地上部分特別是植物的葉,長期暴露在環(huán)境嚴(yán)苛的空氣當(dāng)中[32],高溫暴曬、紫外線的強(qiáng)烈照射、葉內(nèi)的特殊化學(xué)環(huán)境等因素使得只有部分微生物能定殖在葉表和葉內(nèi),α多樣性較低。另外,我們發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落的α多樣性變異程度最小,說明土壤樣本之間的差異較小；而葉內(nèi)和根內(nèi)變化較大,特別是葉內(nèi)微生物群落變異最大。在對擬南芥及其近緣種的研究中發(fā)現(xiàn)根內(nèi)微生物群落在去掉小于20條序列的OTU后,樣品之間的微生物群落趨于穩(wěn)定[11],說明稀有物種是造成樣品之間植物內(nèi)生菌差異的主要原因。在群落結(jié)構(gòu)上,本研究發(fā)現(xiàn)不同樣品類型和不同植物間微生物群落結(jié)構(gòu)都表現(xiàn)出顯著性差異,樣品類型對微生物群落結(jié)構(gòu)差異的貢獻(xiàn)度為20.13%,而植物類型對微生物群落結(jié)構(gòu)差異的貢獻(xiàn)度為14.41%,植物部位和非根際土壤對微生物的強(qiáng)烈選擇作用在其他植物中也得到證明。研究發(fā)現(xiàn)同屬三種龍舌蘭葉內(nèi)和根內(nèi)原核微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異,其中植物部位對原核微生物群落結(jié)構(gòu)差異貢獻(xiàn)度高達(dá)47.9%,而植物類型的貢獻(xiàn)度為10.8%[16]。另一個(gè)研究發(fā)現(xiàn)相對于植物基因型,楊樹不同樣品類型包括根內(nèi)、葉內(nèi)、莖以及非根際土壤之間的差異更大[29]。而本研究以差異更大的三種植物(不同綱不同屬)作為研究對象,進(jìn)一步證明了植物部位以及非根際土壤的對微生物的強(qiáng)烈選擇性。表明植物葉內(nèi),根內(nèi),非根際土壤存在獨(dú)特的生態(tài)位,是微生物群落構(gòu)建主要的驅(qū)動因子。葉內(nèi)、根內(nèi)以及非根際土壤對植物微生物的選擇歸結(jié)到底是由于微生物在不同部位生活歷史的差異,植物可以通過一系列手段來控制和選擇微生物,如,根際分泌物[15]、養(yǎng)分有效性[32]、地上部分與地下部分環(huán)境差異[14]等都可成為不同器官對生活在其中的微生物的選擇；而對于非根際土壤,首先受到植物根際分泌物的影響,其次也會受到氣候和理化性質(zhì)等因素較大的影響[9],這些差異造成了葉內(nèi)、根內(nèi)以及土壤微生物選擇的差異。盡管植物類型對微生物的選擇較弱,但植物物種的選擇作用在什么條件下比較強(qiáng),對哪些微生物類群起決定性的選擇作用,我們了解的還有限,尤其是對自然生長的高寒草甸植物。人們對叢枝菌根與植物之間的互利共生關(guān)系[33]研究較多,但大部分其他微生物在植物中的作用和功能還有待探索。綜上所述,植物不同部位和非根際微生物既有統(tǒng)一性又有特異性,并且樣品類型對微生物的選擇作用大于植物類型的選擇作用。

3.2 青藏高原優(yōu)勢植物葉內(nèi)和根內(nèi)高豐度OTU的的富集及其潛在功能對植物的營養(yǎng)吸收及生態(tài)適應(yīng)性有重要意義

本研究在對植物內(nèi)生菌和土壤原核微生物對比分析中發(fā)現(xiàn),不同植物葉內(nèi)和根內(nèi)存在與土壤原核微生物有顯著差異的菌群(OTU)。對比擬南芥根內(nèi)和對應(yīng)土壤微生物組成發(fā)現(xiàn)70個(gè)OTU在擬南芥根部顯著富集,與土壤存在顯著性差異,并且這些微生物類群對植物部位和植物類型之間微生物群落的差異有顯著的貢獻(xiàn)[11]。這些OTU盡管數(shù)量不多,但相對豐度較高,在群落中屬于優(yōu)勢物種。本研究還發(fā)現(xiàn),無論是在葉內(nèi)還是在根內(nèi),假單胞菌Pseudomonas都顯著富集,在根內(nèi)總相對豐度為10.93%,在葉內(nèi)總相對豐度為13.43%,并且在根內(nèi)作為核心微生物出現(xiàn)在絕大部分樣品中(表 4)。以往的研究發(fā)現(xiàn),在不同寒冷地帶的不同植物內(nèi)生菌中都分離出了假單胞菌及其相關(guān)的類群。Sheng et al(2001)報(bào)道,從天山山脈超過20種高寒植物中分離出46%的內(nèi)生菌與從其他寒冷地區(qū)分離出的內(nèi)生菌相似,其中假單胞菌、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas、紅球菌屬Rhodococcus分布最廣泛[34],這些類群同樣存在于本研究的樣品中。在高寒林區(qū)采集的番紅花Crocusalbifloru中分離出數(shù)種與假單胞菌相關(guān)的高豐度內(nèi)生菌,如PseudomonassE3AY745742,PseudomonassK94.23AY456705,PseudomonastrivialisAJ492831[35]。另一個(gè)研究發(fā)現(xiàn),從三種極地植物Oxyriadigyna、Diapensialapponica、Juncustrifidus中分離純培養(yǎng)的內(nèi)生菌株絕大部分在低溫實(shí)驗(yàn)控制下(4℃)生長良好并且具有活性,包括豐度較高的假單胞菌假、根瘤菌Rhizobium、慢生根瘤菌Bradyrhizobium、伯克氏菌屬Burkholderia、紅球菌屬,另外還發(fā)現(xiàn)有58%的菌株能夠溶解磷礦物,降解幾丁質(zhì)、纖維素或蛋白,包括伯克霍爾德菌、葉居菌Frondihabitans、假單胞菌、鞘氨醇單胞菌和貪噬菌屬Variovorax[17]。以上大部分微生物類群如假單胞菌,根瘤菌,慢生根瘤菌,鞘氨醇單胞菌,紅球菌屬在本研究的植物內(nèi)生菌(根內(nèi)和葉內(nèi))中同樣聚集。同時(shí)我們也在葉內(nèi)和根內(nèi),特別是根內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種具有潛在固氮功能的菌群,如根瘤菌[36]、葉桿菌Phyllobacterium[37]、氨基桿菌屬Aminobacter、德沃斯氏菌Devosia[38]、慢生根瘤菌[39],這些菌群可能為非豆科植物提供氮營養(yǎng)。這些微生物的耐冷機(jī)制有待進(jìn)一步探索,有研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌Pseudomonassp. ID1通過產(chǎn)生胞外多糖作為低溫防護(hù)劑,使其在-20℃到-80℃之間仍具有活性[40],另外有些微生物能夠分泌冷休克蛋白維持細(xì)胞膜的流動性[41],這些耐冷機(jī)制有助于寒冷條件下內(nèi)生菌的生存。與此研究一致,在對本研究中植物內(nèi)生高豐度富集OTUs進(jìn)行功能預(yù)測中,我們發(fā)現(xiàn)了包括氨基酸代謝,碳水化合物代謝,膜轉(zhuǎn)運(yùn),信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能基因的存在。微生物可能通過這些潛在的功能參與植物的眾多生命過程,幫助植物在逆境中生長。以上結(jié)果表明,植物內(nèi)生菌中存在的特定菌群,可能在植物營養(yǎng)獲取方面起著重要的作用。另外,這些菌群具有多種潛在的功能,可能參與協(xié)同植物在高寒環(huán)境中生存,并且這些內(nèi)生菌跨越了不同植物和不同地域廣泛存在,可能與植物共同進(jìn)化,對植物抗逆性、生態(tài)適應(yīng)性都具有重要的意義。

4 結(jié)論

對青藏高原高寒草甸三種優(yōu)勢植物的研究發(fā)現(xiàn),不同植物部位存在著顯著差異的原核微生物類群,并且植物部位對微生物的選擇性強(qiáng)于植物類型。高寒草甸植物內(nèi)部存在著與土壤有顯著差異的內(nèi)生菌,這些內(nèi)生菌可能對協(xié)助植物在條件嚴(yán)苛的寒冷環(huán)境中正常生長有重要作用。但這些微生物與其宿主植物的互作機(jī)制還有待進(jìn)一步探索,可以通過實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn),如無菌苗定殖實(shí)驗(yàn),探索這些微生物的具體作用。