張靜茹,張樂樂,常璐璐,張少穎
(山西師范大學食品科學學院,山西臨汾 041004)
冬棗為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Zizyphus),別名冰糖棗、蘋果棗、雁來紅、凍棗[1]。因其果皮薄,果肉脆甜,果核小,可食率高且富含豐富的維生素、多種礦物質(zhì)、多酚、花色苷以及抗癌物質(zhì)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP),成為被大眾所喜愛的一種鮮食棗品。然而其采后呼吸強度大,對空氣中的CO2敏感,極易失水、褐變、軟化、酒化和腐爛,在常溫條件下貯藏3 d左右就會失水、軟化、霉爛[2]。在冬棗收獲、儲存、加工和運輸?shù)倪^程中都容易出現(xiàn)由鏈格孢菌(A.alternata)引起的黑斑病,導致冬棗腐爛。這不僅造成了冬棗的品質(zhì)下降,更造成了經(jīng)濟上的損失。有研究表明A.alternata還可在寄主細胞內(nèi)產(chǎn)生真菌毒素,對人體健康造成潛在危害[3]。近年來主要采用化學殺菌劑來控制真菌引起的病害。但是,化學殺菌劑的使用會造成環(huán)境污染、菌株抗藥性增強、致癌作用等問題,尋找無污染、無公害的新的防治植物采后病害的方法成為當務之急。
殼聚糖(CTS)是甲殼素脫乙?;a(chǎn)生的一種多糖類物質(zhì)。因其具有無毒無味、生物可降解性、選擇透過性和抑菌性等優(yōu)點,已被廣泛應用于果蔬貯藏[4]。CTS可抑制或者殺滅水果上的多種病原菌,例如鏈格孢菌、灰霉菌、枯草芽孢桿菌[5]等。有研究表明,CTS能夠增強馬鈴薯[6]的苯丙烷類代謝酶的活性以及提高梨[7]防御相關酶的活性。謝春暉[8]發(fā)現(xiàn)用不同濃度CTS處理冬棗,與其他處理冬棗相比,1% CTS涂膜處理效果最佳,冬棗腐爛率最低,硬度、可滴定酸下降最緩慢。
硅作為地球表面第二大元素,在植物抗病性方面有著重要的作用。硅酸鈉作為硅的供體,可抑制杏果實[9]和冬棗[10]黑斑病等。Na2SiO3可以通過苯丙烷途徑激活活性氧代謝從而提高果實的抗逆性,保持果蔬品質(zhì)[11]。Na2SiO3與其他抗菌試劑的復合處理也能增強果實的抗病性,有研究報道Na2SiO3與脫氫乙酸鈉聯(lián)合使用對在貯藏期間柑橘果實酸腐病菌(Geotrichumcitri-aurantii)引起的酸腐病有顯著的抑制作用[12]。CTS和Na2SiO3處理對冬棗采后抗病性的影響已有研究,但二者結合使用對于果蔬的抗病性影響研究較少。通過結合使用可以發(fā)揮各自的特性,提高保鮮的總體效果。因此,本實驗旨在研究CTS和Na2SiO3復合處理對冬棗果實苯丙烷代謝及相關防御酶的影響,以期豐富CTS和Na2SiO3復合處理在果蔬采后抗性誘導作用方面的研究,同時為果蔬采后病害防治提供一種新方法。
供試白熟期冬棗采自山西省臨汾市堯鄉(xiāng)冬棗種植基地,手工采摘,裝箱后迅速運回實驗室,挑選大小均一、無病蟲害機械損傷的冬棗作為試驗用果;鏈格孢菌(A.alternata) 在PDA上培養(yǎng)備用,北納生物有限公司;殼聚糖(相對分子質(zhì)量:15~20萬之間;脫乙酰度:87%~90%) 山東奧康科技公司;硅酸鈉、硼砂、雙氧水、氫氧化鈉 分析純,天津市風船化學試劑科技有限公司;聚乙烯吡咯烷酮 Sigma;L-苯丙氨酸 天津博迪化工股份有限公司;愈創(chuàng)木酚 武漢東康源科技有限公司;p-香豆酸 上海邦景事業(yè)有限公司;β-巰基乙醇、福林酚 山東西亞化學工業(yè)有限公司。
759S紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司;IMS-40全自動雪花制冰機 常熟市雪科電器有限公司;CP214電子天平 常州奧豪斯儀器有限公司;H1850R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;MDF-U53V超低溫冰箱 日本三洋集團;SpectraMax M2/M2e酶標儀 上海普迪生物科技有限公司;DZKW-D-4恒溫水浴鍋 上??坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司。
1.2.1 孢子懸浮液的配制 參照He等的方法[13],將斜面鏈格孢菌接種于PDA平板上,在28 ℃下恒溫培養(yǎng)7~10 d。孢子成熟后,用含有0.05% 吐溫20的生理鹽水將其從平板上刮下,用雙層紗布過濾掉多余菌絲,在顯微鏡下觀察計數(shù),將其最終孢子懸浮液的濃度調(diào)成1×105個/mL。
1.2.2 損傷接種及取樣 將冬棗平均分成5組,分別用蒸餾水、1% CTS、1% CTS+10 mmol/L Na2SiO3、1% CTS+40 mmol/L Na2SiO3、1% CTS+160 mmol/L Na2SiO3浸泡5 min,自然晾干。每組100個冬棗,重復三次。用打孔器在冬棗的赤道處打出一個深2 mm,直徑為3 mm的小孔,放置1 h。將5 μL孢子懸浮液打入小孔內(nèi),將接種后的果實放入大保鮮盒內(nèi),用保鮮膜封口。室溫(22 ℃),相對濕度(RH)90%下貯藏,每隔4 d取樣,進行病斑直徑的測定。
取冬棗損傷處皮下0.2~10 mm范圍內(nèi)的果肉,液氮冷凍后磨粉,保存在-80 ℃的超低溫冰箱,用于后期指標的測定。
1.2.4 苯丙烷類代謝相關酶活性的測定 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定參照曹建康等[14]的方法,適當修改。取4 g棗粉,加入4 mL提取液(含有40 g/L PVPP、2 mmol/L EDTA和5 mmol/Lβ-巰基乙醇)。4 ℃、12000×g離心30 min,收集上清液,即為提取酶液。PAL反應體系為3 mL 50 mmol/L pH8.8的硼酸緩沖液、0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液、0.5 mL酶液。煮沸 6 min作為對照,37 ℃下保溫1 h,加入0.1 mol 6 mol/L HCl終止反應,在290 nm處測定其吸光度值。以每小時每克冬棗實(鮮重)酶促反應體系吸光度值增加0.01為1個PAL活性單位(U),單位是U·h-1·g-1FW。
肉桂酸4-羧化酶(C4H)的測定方法參照范存斐等[15]的方法,適當修改。取1 g棗粉,加入3 mL提取液(50 mmol/L pH8.9 Tris-HCl,15 mmol/Lβ-巰基乙醇、4 mmol/L MgCl2、5 mmol/L VC、5 μmol/L亮肽素、5 mmol/L PMSF、0.15% PVP、10%甘油),4 ℃、12000×g離心25 min,取上清液為提取酶液。反應體系包括0.8 mL酶液,2.2 mL緩沖液(50 mmol/L pH8.9 Tris-HCl、2 μmol/L反式肉桂酸、2 μmol/L NADPNa、5 μmol/L G-6-PNa2),加入0.1 mL 6 mol/L HCl終止反應。在340 nm處測定其吸光度值。OD值每分鐘變化0.01作為一個酶的活性單位,單位是U·min-1·g-1FW。
4-香豆酰-輔酶A連接酶(4CL)的測定方法參照張杼潤等[16]方法,適當修改。取2 g棗粉,加入6 mL預冷的0.2 mol/L的Tris-HCl(含有25%甘油和0.1 mol/L DTT,pH為8.0)緩沖液,4 ℃、12000×g離心20 min,取上清液為提取酶液。1 mL酶液中依次加入1.5 mL反應液(含有0.9 mL 15 μmol/L MgSO4、0.3 mL 5 μmol/L P-香豆酸、0.3 mL 5 μmol/L CoA)、0.3 mL 50 μmol/L ATP,40 ℃水浴10 min后加入0.1 mol 6 mol/L HCl終止反應,在333 nm處測定其吸光度值。OD值每分鐘變化0.1 作為一個酶的活性單位(U),單位是U·min-1·g-1FW。
POD活性的測定參照曹建康等[14]的方法。取3 g棗粉,加入3 mL提取緩沖液(含1 mmol/L PEG、4% PVPP、1% TritonX-100)混勻后于4 ℃、12000×g離心30 min,取上清液為提取酶液。0.5 mL酶液中加入3 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液,0.2 mL 0.5 mmol/L H2O2混勻,470 nm處測定吸光度值的變化。以每分鐘吸光度變化1所需的酶量為一個POD單位,單位是U·min-1·mg-1protein。
1.2.5 總酚、類黃酮和木質(zhì)素的測定 總酚含量的測定參照Xiao等[17]方法并修改。配制含有0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18 mg/mL的標準沒食子酸溶液。取0.2 mL各濃度標準液,加入2 mL Folin-Ciocalteau試劑(稀釋10倍)混勻后室溫放置5 min,然后加入2 mL 10% Na2CO3溶液,室溫避光放置90 min,在765 nm測定其吸光度值。以吸光度對濃度進行線性回歸分析,求得回歸方程和決定系數(shù)分別為A=4.3216C+0.0694,R2=0.997。取0.5 g棗粉,加入4 mL 80%的乙醇,混勻后于4 ℃、8000×g離心20 min。取0.2 mL上清液,依次加入Folin-Ciocalteau、Na2CO3溶液,測量方法與制作標曲方法相同。樣品中總酚的含量用沒食子酸當量(mg·g-1)來表示。
類黃酮含量的測定參照Jia等[18]方法并修改。配制含有0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的蘆丁標準溶液。各取0.1 mL,加入0.3 mL 5% NaNO2搖勻后靜置5 min,加入0.3 mL 10% Al(NO3)3放置6 min。最后加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液,室溫下放置15 min,在510 nm處測定其吸光度值。以吸光度對濃度進行線性回歸分析,求得回歸方程和決定系數(shù)分別為A=0.0732C-0.0067,R2=0.9967。樣液的制備與測量總酚方法相同。取0.1 mL上清液,依次加入NaNO2、Al(NO3)3、NaOH溶液,測量方法與制作標曲方法相同。樣品中的黃酮含量用蘆丁的當量(mg·g-1)來表示。
木質(zhì)素含量的測定參照Morrison[19]方法并作修改。取1 g棗粉加入4 mL預冷的95%乙醇混勻,于4 ℃、12000×g離心10 min。沉淀物用95%乙醇沖洗3次,再用乙醇∶正己烷=1∶2 (v/v)沖洗3次。收集沉淀干燥,干燥后加入1 mL 25%溴乙酰,70 ℃恒溫水浴30 min。加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液中止反應。再加入2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L鹽酸羥胺。再次離心,取上清液0.25 mL用醋酸定容至5 mL。在280 nm處測定其吸光度值。木質(zhì)素含量用OD280·g-1FW表示。
在明確了著作權所特有的性質(zhì)后,我們就可得知,未經(jīng)許可演繹人取得著作權后,法律并未賦予其以法律規(guī)定以外的方式利用其作品的權利。其是否有權對其作品實施控制,仍須得到原作品著作權人的許可。這是因為,哪里有獨創(chuàng)性表達,哪里就有保護,未經(jīng)許可演繹作品中包含有原作品著作權人的獨創(chuàng)性表達,因此原作品著作權人可依法對未經(jīng)許可演繹作品進行控制,以禁止或許可未經(jīng)許可演繹人乃至于第三人利用未經(jīng)許可演繹作品。而賦予未經(jīng)許可演繹人著作權,僅賦予了其許可或禁止他人以特定方式利用其作品的權利。他人欲利用未經(jīng)許可演繹作品,需獲得雙重許可,除了得到未經(jīng)許可演繹人的許可之外,還須得到原作品著作權人的許可。
1.2.6 病程相關酶活性的測定 CHT活性的測定參照曹建康等[14]的方法。取3 g棗粉,加入5 mL預冷丙酮,混勻后于4 ℃、12000×g離心30 min。反應體系中依次加入0.5 mL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=5.2)、0.5 mL 10 g/L 膠狀幾丁質(zhì)懸浮液,反應管和對照管各加入 0.5 mL酶液,對照管煮沸5 min。反應管37 ℃水浴1 h后加入0.1 mL 30 g/L的脫鹽蝸牛酶混勻繼續(xù)水浴1 h,然后加入0.2 mL 0.6 mol/L四硼酸鉀溶液,煮沸3 min后迅速冷卻,于585 nm處測定吸光度值。酶活性單位是U·mg-1protein。
PPO活性的測定參照曹建康等[14]的方法。粗酶液與POD活性測定的提取方法相同。反應體系中依次加入2 mL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=5.5)、1 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液,最后加入0.1 mL酶液。于420 nm處測定吸光度值的變化,以每分鐘吸光度變化增加1為一個活性單位,單位是U·min-1·mg-1protein。
GLU活性的測定參照曹建康等[14]的方法。粗酶液與CHT活性測定的提取方法相同。反應體系加入100 μL 4 g/L的昆布多糖、100 μL酶液,煮沸5 min的酶液作為對照。反應管37 ℃水浴40 min后,依次加入1.8 mL蒸餾水、1.5 mL DNS試劑,沸水加熱5 min,用蒸餾水稀釋至20 mL,混勻。于540 nm處測定吸光度值。酶活性單位是U·mg-1protein。
以上指標均取3個平行樣,重復測定3次。使用Excel 2010計算平均值并繪制圖表,SPSS statistics 20進行Duncan’s多重比較進行差異分析。圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。使用Adobe Photoshop CC 2018作圖。
貯藏期間冬棗病斑直徑逐漸增大,且處理組的病斑直徑顯著低于對照組(P<0.05)。前12 d各處理組之間并差異不明顯,貯藏后期整體來說CTS+Na2SiO3處理效果優(yōu)于CTS單獨處理(圖1和圖2)。第20 d CTS處理組的病斑直徑比復合40、160 mmol/L Na2SiO3處理組的高出36.29%、21.11%。CTS+40 mmol/L Na2SiO3處理組對病斑直徑的抑制效果最好,因此,選擇CTS+40 mmol/L Na2SiO3處理組進行后續(xù)指標的分析。
圖1 CTS+Na2SiO3處理對冬棗挑戰(zhàn)接種A. alternata病斑直徑的影響Fig.1 Effects of CTS+Na2SiO3 treatment on colony diameterin winter jujube inoculated with A. alternata注:不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(P<0.05)。
圖2 CTS+Na2SiO3處理對冬棗挑戰(zhàn)接種A. alternata貯藏20 d后各處理的病斑擴展情況Fig.2 Effects of CTS+Na2SiO3 treatment on theexpansion of lesions in winter jujube inoculatedwith A. alternata after storage for 20 d注:對照(a);1% CTS處理(b);1% CTS+10 mmol/LNa2SiO3處理(c);1% CTS+40 mmol/L Na2SiO3處理(d);1% CTS+40 mmol/L Na2SiO3處理(e)。
PAL、C4H、4CL是苯丙烷代謝途徑中的三個關鍵酶,POD處于苯丙烷代謝途徑末端[20]。隨著貯藏時間的延長,果實中PAL、C4H的活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,且在第12 d出現(xiàn)活性高峰(圖3A、B)。從第8 d開始處理組與對照組出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。在第20 d CTS+Na2SiO3處理組PAL、C4H比對照組分別高出37.16%、120.48%。如圖3C所示,4CL的活性呈上升趨勢且復合處理組的活性高于對照組,貯藏4 d之后差異顯著(P<0.05)。尤其是在第8 d,CTS+Na2SiO3處理組是對照組4CL活性的1.73倍。貯藏期間棗果實中POD的變化趨勢與C4H相似,但其活性峰值出現(xiàn)在第8 d(圖3D),比C4H活性高峰提前4 d出現(xiàn)。
總酚、類黃酮、木質(zhì)素是苯丙烷代謝途徑的重要產(chǎn)物??偡雍皖慄S酮是苯丙烷代謝的最終產(chǎn)物,與植物抗氧化活性[21]及果實抗病性密切相關。如圖4A、4B所示,在整個貯藏期間,CTS+Na2SiO3處理組與對照組的總酚與類黃酮含量均呈先下降再上升最后下降趨勢,在第12 d出現(xiàn)峰值。CTS+Na2SiO3處理在貯藏中后期(8~20 d)顯著提高了棗果實的總酚、類黃酮含量(P<0.05)。貯藏結束時,CTS+Na2SiO3處理組果實的總酚、類黃酮含量分別比對照組高17.34%、6.18%。
圖4 CTS+Na2SiO3處理對冬棗挑戰(zhàn)接種A. alternata苯丙烷代謝產(chǎn)物的影響Fig.4 Effect of CTS+Na2SiO3 treatment on metabolites ofphenylpropan in winter jujube inoculated with A. alternata注:總酚含量(A)、類黃酮含量(B)和木質(zhì)素含量(C)。
木質(zhì)素是植物細胞壁成分之一,可以通過與細胞壁的結合使植物組織木質(zhì)化,保護細胞免受病原菌的侵害。如圖4C所示,各處理棗果實中的木質(zhì)素含量呈先上升后下降的趨勢,在第8 d達到峰值且第12 d CTS+Na2SiO3復合處理木質(zhì)素含量比對照組高11.02%。CTS+Na2SiO3復合處理冬棗的木質(zhì)素含量在貯藏8~20 d內(nèi)均顯著高于對照組(P<0.05)。
CHT是一種存在于植物中以幾丁質(zhì)為底物的一種水解酶,GLU的水解底物是某些真菌和一些病原菌細胞壁的主要成分,這兩種酶對于植物防衛(wèi)反應具有協(xié)同作用。各處理組在貯藏過程中的CHT、GLU活性均先升高后降低,對照外CHT的活性高峰出現(xiàn)在第8 d,GLU的活性高峰推遲4 d出現(xiàn)(圖5A和圖5B),其酶活性分別是對照組的2.5倍和1.47倍。復合處理組CHT、GLU活性從第8 d開始顯著高于對照組(P<0.05)。
PPO可以將植物中的酚類物質(zhì)轉化為醌和單寧從而抑制病原菌的擴散。貯藏期間PPO的活性呈上升趨勢,且在第12~16 d之間對照組活性顯著高于復合處理組(P<0.05,圖5C)。
圖5 CTS+Na2SiO3處理對冬棗挑戰(zhàn)接種A. alternata病程相關酶活性的影響Fig.5 Effect of CTS+Na2SiO3 treatment on theactivities of enzymes related to the pathogenesisin winter jujube inoculated with A. alternata注:CHT活性(A)、PPO活性(B)和GLU活性(C)。
苯丙烷途徑是植物特有的次生代謝途徑,植物受到逆境脅迫時,其代謝產(chǎn)物酚類、類黃酮可以作為抗病毒劑,保護植物免受生物或非生物脅迫,并且賦予果蔬顏色及味道[25]。PAL是苯丙烷衍生物途徑中的第一個關鍵限速酶,可以催化苯丙氨酸轉化為反式肉桂酸。C4H將反式肉桂酸轉化為P-香豆酸。4CL是苯丙烷途徑中最后一個關鍵酶,可以催化肉桂酸為相應的輔酶A酯,控制苯丙烷代謝主途徑向分支途徑轉折,其下游次級代謝產(chǎn)物為花青素、水楊酸、木質(zhì)素等其他參與抗性反應的物質(zhì)[26]。CTS可以誘導植物產(chǎn)生萜類、異黃酮、生物堿等植保素,進而誘導抗性蛋白活性提高并且木質(zhì)素含量增加。CTS處理蘋果后,其PAL 和 POD 活性增加,總酚、類黃酮和木質(zhì)素的含量也有所上升[27]。研究表明Na2SiO3處理可以提高SOD、PAL活性,誘導杏果實總酚、木質(zhì)素增加,提高杏果實的活性氧與苯丙烷代謝[11]。魏娟等[28]研究表明Na2SiO3處理提高了甜瓜果實PAL、CHS基因mRNA的表達量,說明Na2SiO3處理可在基因轉錄水平上促進苯丙烷代謝途徑的關鍵酶的表達,從而提高果實抗病性。本研究表明,CTS+Na2SiO3處理冬棗,激活了PAL、C4H、4CL及POD等苯丙烷代謝相關酶的活性,且增加了總酚、類黃酮、木質(zhì)素等苯丙烷代謝產(chǎn)物的含量??偡印㈩慄S酮、木質(zhì)素的增加可能與PAL活性的增加有關,第12 d時PAL、總酚、類黃酮同時達到峰值,但木質(zhì)素含量在第8 d達到峰值,說明CTS+Na2SiO3處理可能通過其他途徑誘導木質(zhì)素的形成。4CL也可以通過催化香豆酸合成酚類物質(zhì)前體,其活性高低與其他苯丙烷代謝酶的平衡可調(diào)節(jié)酚類物質(zhì)的合成有關[29]。POD參與了木質(zhì)素的合成,并且氧化酚類物質(zhì)形成對病原菌毒害較大的醌類物質(zhì)[27]。木質(zhì)素含量的提高可以增強果實細胞壁抵御病原菌的能力。這表明CTS+Na2SiO3可通過調(diào)節(jié)植物的苯丙烷代謝酶的活性及產(chǎn)物積累,增強冬棗的抗病性,維持其采后品質(zhì)。
病程相關蛋白是指植物在病理或病理相關的環(huán)境下產(chǎn)生的一類可以直接攻擊病原菌的蛋白,受病原菌或者其他外部脅迫誘導表達,與植物的抗病性及其適應環(huán)境脅迫有重要作用。CHT與GLU的底物分別是真菌細胞壁中的幾丁質(zhì)與葡聚糖,可水解真菌細胞壁,從而具有抗真菌作用。Meng等[30]發(fā)現(xiàn)CTS處理損傷接種后的梨果實,會顯著增強其CHT、GLU、POD的活性,并抑制病原菌的生長。本研究發(fā)現(xiàn),CTS+Na2SiO3處理冬棗提高其CHT、GLU活性,但抑制其PPO活性。這與CTS處理F.sulphureum挑戰(zhàn)接種馬鈴薯塊莖研究結果相反[31]。可能是CTS+Na2SiO3復合處理改變了果蔬的內(nèi)部環(huán)境,也可能是因為實驗材料和病原菌的不同引起了差異。同時,實驗結果也暗示,CTS+Na2SiO3復合處理并不能通過提高PPO活性來抑制A.alternata引起的冬棗腐爛。CTS+Na2SiO3處理增加了果實抗病性,不僅表現(xiàn)在苯丙烷代謝的增強,也表現(xiàn)在抑制病原菌和采后病害的發(fā)生。CHT、GLU、PAL、POD活性增加,可以抵御病原菌的擴張。CTS+Na2SiO3處理對A.alternata抑制作用及其如何在果實內(nèi)部發(fā)揮信號分子作用還需進一步研究。
1% CTS+40 mmol/L Na2SiO3能有效地控制冬棗采后病害的發(fā)生,貯藏效果最佳。CTS+Na2SiO3復合處理采后冬棗,可減少病斑直徑的擴展;增加苯丙烷途徑相關酶PAL、C4H、4CL、POD活性,并且促進了苯丙烷途徑產(chǎn)物總酚、類黃酮、木質(zhì)素的形成;提高了抗病相關蛋白CHT、GLU活性,但不能誘導PPO活性的升高。實驗結果表明,CTS+Na2SiO3復合處理能調(diào)節(jié)冬棗的苯丙烷代謝,誘導病程相關蛋白活性升高,從而增強冬棗的抗病性。