馬煒秀，王志文，袁強(qiáng)，張愛國，曹穎

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以滑膜病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖呒膊?，表現(xiàn)為滑膜組織增生及血管翳生成，繼而侵蝕破壞關(guān)節(jié)[1]。研究表明，RA患者滑膜液中1-磷酸鞘氨醇(S1P)濃度遠(yuǎn)超過生理濃度[2]。高濃度S1P與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，減弱了內(nèi)皮細(xì)胞間的連接，增加了血管通透性，損害了血管屏障功能[3]。RA新生血管內(nèi)皮細(xì)胞排列不整齊，血管通透性增加，炎性細(xì)胞浸潤增多，不僅加重滑膜炎性反應(yīng)，同時侵蝕軟骨。由此可見，血管內(nèi)皮高通透性與RA的持續(xù)炎性反應(yīng)和軟骨損傷有著密不可分的關(guān)系，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，有利于減弱滑膜組織的炎性反應(yīng)。本研究通過S1P誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)，建立血管內(nèi)皮高通透性模型，觀察麝香烏龍丸對HUVEC通透性及連接蛋白的影響，以及其保護(hù)血管屏障減輕RA滑膜炎性反應(yīng)的可能機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞株：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購于上海中喬新舟生物科技有限公司。(2)藥物與試劑：麝香烏龍丸(成分：人工麝香、全蝎、地龍、制川烏、黑豆)委托頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，每粒(100±5)mg。用水提法進(jìn)行藥物粗提物的提?。簩⒏咚俜鬯楹蟮镊晗銥觚埻?，按一定比例加入蒸餾水,37℃攪拌浸泡過夜， 37℃下超聲80 Hz提取30 min， 離心取上清液冷凍干燥得麝香烏龍丸提取物，無菌過濾后于-20℃保存?zhèn)溆?。S1P試劑(英國 Abcam 公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)， 胎牛血清 (德國Cegrogen公司)，Trypsin-EDTA胰蛋白酶消化液(美國Gibco公司)；CCK8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，F(xiàn)ITC-BSA(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，熒光二抗Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(英國Abcam公司)，β-肌動蛋白(β-actin)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)， Claudin-5兔多克隆抗體(英國Abcam公司)，ZO-1兔多克隆抗體(美國Gene Tex公司)，Occludin 兔多克隆抗體(英國Abcam公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)： 2018年8月—2019年11月于華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院實驗室進(jìn)行實驗。HUVEC用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，1～2 d換液1次，每2～3 d傳代1次，傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。

1.2.2 實驗分組：實驗分為3組。(1)對照組：HUVEC用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h；(2)S1P誘導(dǎo)組：含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC 24 h后，去掉培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，用含S1P 10 μmol/L 的RPMI-1640培養(yǎng)基干預(yù)30 min；(3)藥物組：麝香烏龍丸160 μg/ml提取物、10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC 24 h，去掉原培養(yǎng)基，PBS沖洗2次， 用含S1P 10 μmol/L 的RPMI-1640培養(yǎng)基干預(yù)30 min。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 CCK8實驗檢測HUVEC增殖抑制率：將HUVEC接種于96孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞長至80%左右時，用無血清培養(yǎng)基同步24 h。分別加入RPMI-1640培養(yǎng)基及濃度為80、160、320 μg/ml麝香烏龍丸提取物的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，去除原培養(yǎng)基。每孔加入CCK-8 10 μl、RPMI-1640培養(yǎng)基90 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，將酶標(biāo)儀設(shè)置于450 nm波長處，檢測OD值。細(xì)胞抑制率(%)=[(對照組OD值-實驗組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%，其中，對照組為含HUVEC的培養(yǎng)基+CCK8，實驗組為含HUVEC的培養(yǎng)基+CCK8+麝香烏龍丸提取物，空白組為不含HUVEC的培養(yǎng)基+CCK8，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 Transwell小室測定HUVEC細(xì)胞相對通透性：Transwell小室的上室加入HUVEC懸液，每孔為1×105個/cm2，5%CO2、37℃孵育箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合成單層后，按上述實驗分組處理各組細(xì)胞。上室中加入濃度為0.25 g/L的FITC-BSA 100 μl，下室中加入RPMI-1640無血清培養(yǎng)基600 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。在每個Transwell下室取100 μl培養(yǎng)基置于新96孔板中，熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度。通過以下公式計算濾過率，濾過率(%)=(C下室×V下室/C上室×V上室)×100%。C為收集液體的FITC-BSA質(zhì)量濃度，V為液體的體積。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 連接蛋白免疫熒光染色觀察： 將HUVEC接種于蓋玻片上，待細(xì)胞融合成單層，換成空白RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待HUVEC細(xì)胞同步化以后，分組處理HUVEC細(xì)胞。干預(yù)完成后，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，1%BSA封閉30 min，分別加入一抗ZO-1(1∶100)、occludin(1∶200)、claudin-5(1∶200)，4℃孵育過夜。PBS洗3次，加入熒光二抗(1 ∶100)，37℃避光孵育2 h，PBS洗3次，加入DAPI后室溫避光孵育10 min，PBS洗3次，滴入防淬滅溶液，于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.3.4 蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測連接蛋白：取生長狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞，按上述實驗分組處理內(nèi)皮細(xì)胞，用PBS洗滌后加入RIPA裂解液，混勻，冰上裂解30 min后，4℃離心收集上清液。BCA試劑盒測蛋白濃度，常規(guī)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，一抗 ZO-1(1∶500)、occludin(1∶1 000)、claudin-5(1∶1 000)，4℃孵育過夜，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行細(xì)胞間蛋白表達(dá)的差異比較，并以 Image J軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 各組HUVEC細(xì)胞增殖抑制率比較 麝香烏龍丸提取物80、160、320 μg/ml抑制率分別為(1.114±1.483)%、(8.694±0.129)%、(14.839±0.563)%。不同濃度藥物組與對照組比較，80 μg/ml時差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.301，P=0.263)，160、320 μg/ml時比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=116.852、45.636，P均=0.000)，160 μg/ml與320 μg/ml比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.422，P=0.002)。因此，本實驗選取麝香烏龍丸160 μg/ml提取物作為后續(xù)實驗的干預(yù)濃度。

2.2 3組HUVEC細(xì)胞通透性比較 3組FITC-BSA濾過率分別為(10.832±0.837)%、(21.002±1.727)%、(16.671±0.452)%。與對照組比較，S1P誘導(dǎo)組細(xì)胞FITC-BSA濾過率升高(t=9.180，P=0.001)。與S1P誘導(dǎo)組比較，藥物組FITC-BSA濾過率降低(t=4.206，P=0.014)。

2.3 3組免疫熒光檢測細(xì)胞連接蛋白表達(dá)比較 熒光顯微鏡下觀察，對照組HUVEC細(xì)胞的ZO-1、claudin-5及occludin蛋白主要分布于細(xì)胞邊緣，排列良好，熒光強(qiáng)；S1P誘導(dǎo)組3種蛋白表達(dá)減少，甚至缺失；藥物組3種蛋白表達(dá)較S1P誘導(dǎo)組明顯增加，見圖1、2、3。

2.4 3組Western-blot檢測細(xì)胞連接蛋白表達(dá)比較 與對照組比較， S1P誘導(dǎo)組細(xì)胞ZO-1、claudin-5及occludin蛋白表達(dá)明顯減少(t/P=7.393/0.002、15.437/0.000、15.808/0.000)，而藥物組較S1P誘導(dǎo)組3種蛋白表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t/P=6.586/0.003、3.554/0.024、2.971/0.041)，見圖4、表1。

表1 3組HUVEC細(xì)胞連接蛋白表達(dá)比較

3 討 論

RA是一種全身炎性反應(yīng)性自身免疫疾病。表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞增生，伴隨血管新生及炎性反應(yīng)浸潤。滑膜病變的初期病理特征為血管擴(kuò)張，擴(kuò)張的血管提供充足的氧氣及營養(yǎng)支持，并促進(jìn)炎性反應(yīng)浸潤，導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜結(jié)構(gòu)異常[4-6]。同時滑膜組織中增生的血管結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，內(nèi)皮細(xì)胞排列不規(guī)則，增加血管通透性，炎細(xì)胞浸潤，加重滑膜炎性反應(yīng)。RA的促炎狀態(tài)與內(nèi)皮屏障功能有關(guān)，Atehortúa 等[7]提出，炎性反應(yīng)主要影響中小型血管(微血管系統(tǒng))，內(nèi)皮屏障功能異常是RA發(fā)病機(jī)制的重要組成部分，在炎性反應(yīng)中，血管活性物質(zhì)和促炎介質(zhì)會引起血管通透性增加和血管損傷。由此可見，血管屏障功能異常、通透性增加在RA發(fā)展過程中起到了重要作用。

內(nèi)皮間的緊密連接和連接蛋白的黏附特性決定細(xì)胞連接的通透性。其中緊密連接為組織結(jié)構(gòu)完整性起到重要作用。緊密連接是由膜相關(guān)蛋白和不同類型的跨膜蛋白組成的，如ZO-1、claudin-5及occludin蛋白，這些蛋白將細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架相連接，能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮屏障功能[8-9]。ZO-1在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能和形成中發(fā)揮重要作用，是調(diào)控細(xì)胞連接形成的重要組成部分，并且介導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架的重組以形成功能性內(nèi)皮連接[10]。occludin和claudins做為緊密連接蛋白復(fù)合物，是跨膜蛋白的關(guān)鍵組成部分，參與了內(nèi)皮屏障功能調(diào)控[11]。claudin-5是claudins家族的蛋白質(zhì)成員，參與內(nèi)皮緊密連接的必需膜蛋白，是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和緊密連接活性的指標(biāo)[12]，其表達(dá)過少或者重新分布，與內(nèi)皮細(xì)胞的高通透性有關(guān)。由此可見，細(xì)胞接連的穩(wěn)定是確保血管內(nèi)皮屏障功能正常的基礎(chǔ)。

有研究發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜炎性因子持續(xù)浸潤與S1P水平升高有著密不可分的關(guān)系[2]。S1P是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的鞘磷脂信號分子，主要來源于紅細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。S1P與5種G蛋白(S1P1～5受體)結(jié)合，激活多種細(xì)胞內(nèi)信號通路，導(dǎo)致不同的生物學(xué)效應(yīng),包括調(diào)節(jié)細(xì)胞屏障、細(xì)胞遷移、炎性反應(yīng)因子和黏附分子的表達(dá)、血管再生等，是滑膜微血管結(jié)構(gòu)異常的重要原因所在。已有研究表明，高濃度的S1P通過激活S1PR2，進(jìn)而激活RhoA/RhoA通路，引起F-actin蛋白表達(dá)紊亂，并且使ZO-1發(fā)生解體，從而導(dǎo)致細(xì)胞間連接破壞，內(nèi)皮屏障功能障礙[3]。由此可以看出，RA滑膜液中高濃度S1P可能是導(dǎo)致滑膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞連接減弱和血管內(nèi)皮通透性增高的原因之一。本研究也證實高濃度S1P能誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的高通透性，與上述文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致，并進(jìn)一步證實高濃度S1P處理后的HUVEC細(xì)胞間連接蛋白明顯減少，說明HUVEC通透性的增高與ZO-1、claudin-5及occludin 3種蛋白表達(dá)的減少有關(guān)。

麝香烏龍丸用于治療RA有多年的臨床實踐，且臨床療效確切[13]。以往研究表明，麝香烏龍丸可降低RA患者體內(nèi)IL-18、FKN/CX3CL1表達(dá)[14]。動物實驗表明，麝香烏龍丸可改善佐劑性關(guān)節(jié)炎(RA)大鼠滑膜炎性反應(yīng)發(fā)生及血管翳產(chǎn)生，可能與減少RA大鼠滑膜HIF-1α、MMP-2的表達(dá)水平有關(guān)[15]。麝香烏龍丸能夠抑制滑膜組織增生，減少炎性細(xì)胞浸潤，減輕軟骨和骨的損壞，并且能通過上調(diào)VE-cadherin和ZO-1表達(dá)改善膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠血管新生[16]。由此可見，麝香烏龍丸治療RA的作用可能與麝香烏龍丸對血管內(nèi)皮屏障的保護(hù)有關(guān)。因此本研究以HUVEC細(xì)胞連接為切入點，模擬RA關(guān)節(jié)中血管內(nèi)皮細(xì)胞高濃度S1P的生存環(huán)境，探討麝香烏龍丸對血管內(nèi)皮屏障功能的保護(hù)作用。結(jié)果表明，經(jīng)麝香烏龍丸預(yù)處理后，暴露于高濃度S1P下的HUVEC通透性明顯降低。說明麝香烏龍丸對于高濃度S1P誘導(dǎo)的HUVEC通透性增強(qiáng)具有很好的保護(hù)作用，而這一作用主要與上調(diào)HUVEC中ZO-1、claudin-5及occludin蛋白表達(dá)有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

馬煒秀：實施研究過程，統(tǒng)計學(xué)分析，論文撰寫；王志文：課題設(shè)計，論文審核；袁強(qiáng)、張愛國：課題設(shè)計，統(tǒng)計分析及文獻(xiàn)整理；曹穎：課題設(shè)計，論文修改及審核