曾東，馮艷玲，鄭葉，楊月香，石雨涵

肝細胞癌(HCC)已成為全球常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，初期臨床癥狀和體征不典型，早期不易發(fā)現(xiàn)，往往延誤最佳治療時機；此外由于該病侵襲轉(zhuǎn)移性強而導致預后極差，因此具有較高的發(fā)病率和病死率。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染被廣泛認為是導致HCC發(fā)生的主要高危因素之一，我國80%的肝癌患者合并HBV感染，HBV感染患者較正常人群發(fā)生肝癌的幾率更高[1]。作為首個被發(fā)現(xiàn)的通過反式作用調(diào)控下游基因表達的長鏈非編碼RNA(Lnc RNA)，HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA (HOTAIR)已被證實在胃癌、乳腺癌及非小細胞肺癌等多種癌癥中表達明顯上調(diào)，且其高表達與腫瘤耐藥、增殖、侵襲及遷移密切相關(guān)[2-4]。作為鋅指蛋白超家族成員之一，鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)對上皮間葉表型轉(zhuǎn)化(EMT) 具有強大的誘導能力，近年來在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用越來越被重視[5-6]。Wnt3a是Wnt 信號傳導通路的關(guān)鍵分子，在胚胎發(fā)育、造血、組織再生及細胞增殖分化等生物學過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，也在多種腫瘤中異?；罨l(fā)揮重要作用[7-8]。目前，關(guān)于HOTAIR、Snail和Wnt3a通路蛋白在HBV相關(guān)肝細胞癌組織中的表達及對預后的意義報道較為少見。因此，本研究通過檢測HOTAIR、Snail和Wnt3a 通路蛋白在HBV相關(guān)HCC組織中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討三者在HBV相關(guān)HCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其對預后的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年6月—2014年12月于復旦大學附屬上海市公共衛(wèi)生臨床中心病理科經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的HBV相關(guān)肝細胞癌組織樣本82份，患者血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)為陽性，甲型、丙型、丁型及戊型肝炎病毒均為陰性；術(shù)前增強CT和腹部B型超聲均明確診斷為原發(fā)性HCC，且未接受任何抗癌治療；術(shù)后病理組織學確診為HCC；不合并其他疾病，無器質(zhì)性疾病和既往惡性腫瘤史。82例中男66例，女16例，年齡36～75 (53.82±9.47) 歲，>50歲49例，≤50歲33例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例；腫瘤直徑：>5 cm 44例，≤5 cm 38例；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)：升高>2倍17例，≤2倍65例；甲胎蛋白：<400 μg/L 63例，≥400 μg/L 19例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ 期55例；分化程度：低分化21例，中分化49例，高分化12例；E 抗原：陽性11例，陰性71例；未行抗乙肝病毒治療者72例，行抗乙肝病毒治療者10例。另外選擇同期于醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的正常肝組織樣本35份，患者無肝炎史，且血清甲型、丙型、丁型及戊型肝炎病毒等檢測均為陰性；臨床癥狀結(jié)合腹部CT和B型超聲等診斷為肝臟良性血管瘤或肝內(nèi)膽管多發(fā)結(jié)石，且術(shù)后經(jīng)病理組織學證實；正常肝組織樣本為病變旁組織；不合并其他疾病，且無既往病史。其中男28例，女7例，年齡35～75 (54.13±9.52) 歲，>50歲21例，≤50歲14例；因肝臟良性血管瘤切除8例，因肝內(nèi)膽管多發(fā)結(jié)石切除27例。

1.2 觀測指標與方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測HOTAIR：將收集的HBV相關(guān)肝細胞癌組織和正常肝組織，采用Trizol(TaKaRa公司)法提取各組織中總RNA并進行濃度測定，之后采用試劑盒Trans Script mi RNA First-Strand c DNA Synthesis Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)對提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄以獲取cDNA，將得到的cDNA作為模板，采用Trans Start Top Green q PCR super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進行實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)，檢測HOTAIR在HBV相關(guān)肝細胞癌組織和正常肝組織中的表達，引物序列：上游5’-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3’，下游5’-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3’；同時以微管蛋白(TUBULIN)作為內(nèi)參基因，引物序列：上游5’-TGGCTCTGGCTTCACCTCACTC-3’，下游 5’-TCGACCACGGCTGTAGACACC-3’；每個樣本均重復3次，采用 2-ΔΔCt計算HOTAIR的相對表達量。以大于正常肝組織中HOTAIR相對表達量平均值2倍判為陽性。

1.2.2 免疫組織化學檢測Snail和Wnt3a蛋白：用4%中性甲醛溶液將收集的肝組織樣本固定后，依次進行脫水、透明及石蠟包埋，再連續(xù)切成5 μm厚的切片，置入二甲苯中脫蠟處理，然后經(jīng)梯度乙醇浸泡水化及3 mol/L尿素消化，之后采用枸櫞酸鈉溶液修復抗原，3%雙氧水室溫下孵育10 min后封閉，棄封閉液，分別加入適量稀釋好的一抗Anti-SNAIL抗體(山羊多克隆抗體to SNAIL,Abcam公司)和Anti-Wnt3a抗體(兔多克隆抗體to Wnt3a,Abcam公司)，置于4℃冰箱孵育過夜，次日取出，復溫后加磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗干凈，再分別加入適量稀釋好的二抗驢抗山羊IgG H&L (HRP)(Abcam公司)和山羊抗兔IgG H&L (HRP)(Abcam公司)，室溫孵育30 min，PBS洗滌干凈。加適量二氨基聯(lián)苯胺(DAB 顯色試劑盒,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)用于顯色，作用5 min后加去離子水以使反應(yīng)終止，蘇木素復染后，加1%鹽酸酒精進行分化，之后用自來水清洗并經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，干燥后封片，鏡檢觀察。

病理切片需由2位資深專業(yè)的病理科醫(yī)師盲評。在每張切片上隨機選取5個高倍鏡視野，每個視野隨機對200個細胞進行計數(shù)，陽性表達為細胞出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒，最終以組織樣本中陽性細胞染色強度及其所占比例對染色結(jié)果進行綜合評定。染色強度計分按照無著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色順序分別計0分、1分、2分、3分。陽性細胞數(shù)計分按照無陽性細胞、陽性細胞< 25%、陽性細胞26%～50%、陽性細胞51%～75%、陽性細胞>75%分別計0分、1分、2分、3分及4分。以上2項計分相加后≥3分判為陽性。

1.2.3 隨訪預后：HBV相關(guān)肝細胞癌患者手術(shù)后安排專門人員定期進行門診或電話隨訪，隨訪終點為患者死亡時間或2019年12月20日。建議患者至少每3個月于醫(yī)院行甲胎蛋白、肝臟MR或增強CT、肝功能、乙型肝炎表面抗原、E抗原及血清HBV DNA檢查，必要時可行骨掃描或病灶穿刺病理檢查。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以頻數(shù)或率(%)表示，比較采用χ2檢驗；3種蛋白在HBV相關(guān)HCC組織中表達的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗；組間生存率比較采用GraphPad Prism軟件的Log-rank(Mantel-Cox)檢驗；生存曲線采用Kaplan-Meier繪制；Cox回歸比例風險模型分析影響患者的預后因素。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HOTAIR、Snail和Wnt3a在HBV相關(guān)HCC組織中的表達 HBV相關(guān)肝細胞癌組織中HOTAIR相對表達量的平均值為(9.85±0.87)，正常肝組織中為(4.69±0.42)，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(t/P=33.406/0.000)；HOTAIR、Snail及Wnt3a在HBV相關(guān)肝細胞癌組織中的陽性表達率分別為85.37%、78.05%及89.02%，在正常肝組織中分別為20.00%、17.14%及25.71%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=46.582、 37.861、 46.896,P均<0.01)，見圖1，表1。

表1 HOTAIR、Snail和Wnt3a蛋白表達的陽性率比較 [例(%)]

2.2 HOTAIR、Snail和Wnt3a在不同臨床病理特征患者中的表達 HBV相關(guān)肝細胞癌組織中HOTAIR、Snail及Wnt3a的表達在不同性別、年齡、E 抗原、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、有無行抗乙肝病毒治療及甲胎蛋白水平方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。HOTAIR在患者不同TNM 分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤直徑方面比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)；Snail在不同TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Wnt3a在不同TNM 分期、組織分化程度及腫瘤直徑方面比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 82例HBV相關(guān)HCC患者中HOTAIR、Snail和Wnt3a表達在不同臨床病理特征中表達比較 [例(%)]

2.3 HOTAIR、Snail和Wnt3a在HBV相關(guān)HCC組織中表達的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，HBV相關(guān)肝細胞癌組織中HOTAIR的表達與Snail、Wnt3a的表達呈正相關(guān) (r/P=0.281/0.011、0.296/0.007)，Snail與Wnt3a的表達呈正相關(guān)(r/P=0.285/0.009)。

2.4 Cox比例風險回歸模型分析HBV相關(guān)HCC臨床預后的影響因素 結(jié)果顯示，TNM 分期高、組織分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑大，HOTAIR、Snail及Wnt3a高表達是影響HBV相關(guān)肝細胞癌預后的危險因素 (P<0.05)，見表3。

表3 Cox比例風險回歸模型分析HBV相關(guān) HCC臨床預后的影響因素

2.5 HOTAIR、Snail和Wnt3a表達與HBV相關(guān)肝細胞癌患者的生存分析 HBV相關(guān)肝細胞癌82例患者5年總生存率為52.44%。HOTAIR、Snail、Wnt3a陽性患者的5年生存率顯著低于其陰性患者(47.14% vs. 83.33%、45.31% vs. 77.78%、47.95% vs. 88.89%)(χ2/P=5.380/0.020,5.937/0.015,5.385/0.020)，見圖2。

3 討 論

目前，肝細胞癌的治療以手術(shù)為主，輔助其他治療，盡管治療方法較多，但僅能使患者生存期有限延長，預后效果并不理想。基因突變、染色體變異、表觀遺傳學改變及多種信號傳導通路異常調(diào)節(jié)均參與肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展，是一個復雜的多階段過程[9]。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)由HBV基因組最小的開放式閱讀框架X基因(X-ORF) 編碼，作為一種反式作用因子不直接結(jié)合DNA，而是將多種細胞的基因啟動子激活以干擾基因轉(zhuǎn)錄和表達，進而影響細胞分化、增殖及細胞信號轉(zhuǎn)導途徑[10]。HBV侵染宿主是通過將自身基因組整合到宿主肝細胞基因組中并表達HBx蛋白，最新研究結(jié)果表明，HBx蛋白對肝細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移及惡性轉(zhuǎn)化具有促進作用，且可通過誘導肝癌細胞發(fā)生EMT、促進細胞外基質(zhì)降解及干擾癌細胞間的黏附連接等途徑完成[11]。

位于人類染色體12q13.13區(qū)域的HOTAIR不編碼蛋白質(zhì)，但可編碼2.2 kb長鏈非編碼RNA 分子，通過改變?nèi)旧|(zhì)狀態(tài)，反式調(diào)控下游靶基因表達。早期文獻報道，敲除HOTAIR對胃癌細胞的增殖、侵襲具有抑制作用，胃癌細胞在體內(nèi)的致癌性被有效降低，過表達HOTAIR則使腫瘤細胞的惡性潛能顯著增加[12-13]。Troiano等[14]研究顯示，喉鱗狀細胞癌中HOTAIR呈高表達，且與腫瘤細胞的生長關(guān)系密切。轉(zhuǎn)錄抑制子超家族成員中的鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail，可結(jié)合上皮鈣黏素(E-cadherin, E-cad)啟動子區(qū)的E-box連接基序，以對E-cad 轉(zhuǎn)錄表達發(fā)揮抑制作用，從而誘導 EMT 的發(fā)生。位于染色體17q21上的Wnt3a是Wnt 經(jīng)典通路的關(guān)鍵信號分子，經(jīng)磷脂酰肌醇蛋白多糖-3和硫酸酯酶-2激活后，對肝癌細胞增殖和裸鼠皮下移植瘤的生長具有促進作用[15]。本研究顯示，HBV相關(guān)肝細胞癌組織中HOTAIR相對表達量顯著高于正常肝組織(P<0.05)。HOTAIR、Snail及Wnt3a在HBV相關(guān)肝細胞癌組織中的陽性表達率顯著高于正常肝組織(P<0.05)。該結(jié)果與以往研究報道一致[16]。HBV相關(guān)肝細胞癌組織中HOTAIR、Snail、Wnt3a的表達，兩兩之間互為顯著性正相關(guān)(P均<0.05)。細胞實驗表明，在人類卵巢癌細胞中，過表達HOTAIR可通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘導卵巢癌的發(fā)生和抗藥性[17]。模型實驗顯示，HOTAIR通過介導Wnt/β-catenin對MMP-13的調(diào)控參與軟骨損傷發(fā)病[18]。Battistelli等[19]發(fā)現(xiàn)，上皮間葉表型轉(zhuǎn)化過程中抑制因子Snail是通過HOTAIR將EZH2招募至特定基因組位點的。肺癌細胞系中敲除Zeb1和Snail1后，E-cad mRNA水平增加，侵襲性降低；敲除β-catenin后使E-cad升高，Zeb1和Snail1降低，進而使肺癌的侵襲性被抑制，表明Wnt信號通路通過Snail1和Zeb1調(diào)控肺癌骨轉(zhuǎn)移[20]。以上資料均證實HOTAIR、Snail及Wnt3a之間在多種疾病中具有直接或間接的正相關(guān)性，與本研究結(jié)果相符。

本研究結(jié)果表明，HOTAIR、Snail及Wnt3a均與HBV相關(guān)肝細胞癌的惡性生物學行為關(guān)系密切。Snail對EMT具有強大的誘導能力，因此極易促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而使其惡性程度增加，TNM 分期升高。異常活化的Wnt3a對肝癌細胞的增殖和分化發(fā)揮重要作用，因此，Wnt3a與TNM 分期、組織分化程度及腫瘤直徑有關(guān)。HOTAIR易與miRNA、靶基因形成競爭性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)，通過影響多條通路的基因表達以使該通路被激活，從而促進腫瘤細胞的增殖轉(zhuǎn)移等生物學過程，因此，HOTAIR與TNM 分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤直徑有關(guān)。該結(jié)果與HOTAIR、Snail及Wnt3a的生物學作用相符[21]。Cox比例風險模型分析結(jié)果顯示，除TNM 分期高、組織分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑大外，HOTAIR、Snail及Wnt3a高表達也是影響HBV相關(guān)肝細胞癌預后的關(guān)鍵風險因素 (P<0.05)。本研究所選82例HBV相關(guān)肝細胞癌患者5年總生存率為52.44%，HOTAIR、Snail及Wnt3a陽性患者的5年生存率均顯著低于陰性患者(P<0.05)。以上結(jié)果證實，HOTAIR、Snail及Wnt3a不僅參與HBV相關(guān)肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展，還嚴重影響患者的臨床預后，降低患者生存率。

綜上，HBV相關(guān)肝細胞癌中HOTAIR、Snail及Wnt3a均高表達且互為顯著正相關(guān)性，不僅參與癌癥的惡性進展，還是導致患者預后不良的關(guān)鍵風險因素。盡管三者之間的相互作用機制復雜，目前尚不完全清楚，但對HBV相關(guān)肝細胞癌的診治具有重要的潛在價值，今后將深入研究其詳細作用機制，為開發(fā)針對特定靶點的拮抗劑以有效對抗HBV相關(guān)肝細胞癌奠定新的基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

曾東：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；馮艷玲：課題設(shè)計，論文撰寫；鄭葉、楊月香：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;石雨涵：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改，統(tǒng)計學分析