侯英宇，劉晨陽，張丹梅，楊敏

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是由氣道阻塞和肺實質(zhì)被破壞而引起的以進行性氣道炎性反應(yīng)和不可逆氣流受限為主要特征的肺部疾病[1-2]。COPD的急性加重(acute exacerbation of COPD，AECOPD)會導致患者出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽和咯痰等臨床癥狀，降低患者的呼吸功能，對疾病進展和預后產(chǎn)生不良影響，同時，其發(fā)作頻率和嚴重程度加重與COPD患者的病死率增加有關(guān)[3-5]。預計到2021年，AECOPD將成為全球第三大死因[6]。感染、常年接觸煙霧和空氣污染是導致AECOPD發(fā)生的主要原因，其中細菌感染的因素高達70%[7]。研究表明，AECOPD患者免疫功能障礙與免疫抑制細胞數(shù)量或功能的改變及效應(yīng)T細胞的功能障礙有關(guān)，機體固有免疫及適應(yīng)性免疫的抑制導致抗病原機制功能障礙，使AECOPD患者肺部微環(huán)境發(fā)生持續(xù)性的炎性反應(yīng)并增加疾病的嚴重程度[8]。輔助性CD4+T細胞(包括Th1、Th17)細胞和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)是近年來受到廣泛研究的免疫細胞，其平衡失調(diào)是導致機體發(fā)生持續(xù)性炎性反應(yīng)和免疫抑制的重要原因，同時伴隨多種炎性因子水平的變化[9-10]。本研究通過對AECOPD患者外周血Th17/Treg及炎性因子水平改變進行研究，旨在為該病的免疫功能障礙研究及免疫靶向治療藥物開發(fā)提供依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年6月—2019年6月武警黑龍江總隊醫(yī)院內(nèi)科確診為下呼吸道細菌感染的COPD患者118例作為研究對象。納入標準：(1)COPD的診斷標準參考《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》[11]中的規(guī)定，相關(guān)病原菌的診斷參考《醫(yī)院感染診斷標準(試行)》[12]中的規(guī)定；(2)臨床資料完整，數(shù)據(jù)完整。排除標準：(1)合并肺結(jié)核、病毒性肝炎患者；(2)患有高血壓、心臟病及其他嚴重器官病變者；(3)合并惡性腫瘤患者。根據(jù)其肺功能及臨床癥狀分為2組：加重期組(n=62)，臨床癥狀表現(xiàn)為呼氣迅速加重，咯痰量增加，痰中帶膿；其中男44例，女18例，年齡(60.83±4.12)歲；病程(9.71±2.61)年，吸煙指數(shù)(602.51±52.87)支年。穩(wěn)定期組(n=56)，病情穩(wěn)定，控制良好；其中男40例，女16例，年齡(60.51±3.96)歲；病程(8.94±2.25)年，吸煙指數(shù)(563.38±49.35)支年。另隨機選擇同期醫(yī)院健康體檢者60例作為健康對照組，其中男46例，女14例，年齡(61.10±4.29)歲，吸煙指數(shù)(326.54±39.21)支年。 3組研究對象在性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；加重期組、穩(wěn)定期組COPD患者吸煙指數(shù)、病程差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但吸煙指數(shù)均大于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過，全部受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測指標與方法

1.2.1 肺功能檢測：按照肺功能檢查操作規(guī)范對COPD患者進行常規(guī)檢測，主要檢測指標包括：第1秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1占預計值百分比(FEV1Pred%)、用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)。

1.2.2 微生物病原學鑒定：參照《臨床檢驗操作規(guī)程》[13]中的規(guī)定，采用VITEK-2全自動微生物鑒定系統(tǒng)對送檢痰液標本中的微生物進行病原鑒定。

1.2.3 Th17、Treg 細胞數(shù)量及IL-17、IL-22水平檢測：采集患者空腹靜脈血3 ml，加入淋巴細胞分離液后梯度離心得到外周血單個核淋巴細胞(PBMCs)，隨后采用流式細胞術(shù)對患者外周血中的Th17、Treg 細胞數(shù)量進行檢測，由軟件自動得出其結(jié)果。血清IL-17、IL-22水平檢測采用ELISA法，均按照試劑盒說明書中規(guī)定的步驟進行。

2 結(jié) 果

2.1 COPD患者急性加重期病原分布 62例急性加重期患者痰液標本共分離出病原65株，其中革蘭陰性44株，占67.69%，包括銅綠假單胞菌18例，肺炎克雷伯菌11例，大腸埃希菌9例，其他細菌6例；革蘭陽性菌21株，占32.31%，包括金黃色葡萄球菌8例，肺炎鏈球菌7例，其他細菌6例。

2.2 3組肺功能指標比較 加重期組、穩(wěn)定期組FEV1、FEV1/Pred、FVC、FEV1/FVC均低于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；加重期組FEV1、FEV1/Pred、FVC、FEV1/FVC均低于穩(wěn)定期組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 3組肺功能指標比較

2.3 3組血清Th17、Treg細胞水平改變比較 加重期組Th17水平高于健康對照組(P<0.01)，穩(wěn)定期組與健康對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；加重期組、穩(wěn)定期組Treg均低于、Th17/Treg均高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；加重期組Th17、Th17/Treg高于穩(wěn)定期組，Treg低于穩(wěn)定期組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 3組血清Th17、Treg細胞水平改變比較

2.4 3組血清炎性因子改變比較 加重期組、穩(wěn)定期組IL-17、IL-22、TGF-β1均高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；加重期組IL-17、IL-22、TGF-β1均高于穩(wěn)定期組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 3組血清炎性因子改變研究

2.5 外周血Th17、Treg細胞水平對COPD患者急性加重期細菌感染診斷價值分析 ROC分析結(jié)果表明，Th17、Treg及Th17/Treg水平對COPD患者急性加重期發(fā)生細菌感染具有良好的診斷價值(AUC均>0.75，P均<0.05)，見表4。

表4 外周血Th17、Treg細胞水平對COPD患者急性加重期細菌感染診斷價值分析

3 討 論

細菌感染是導致COPD患者急性加重的主要原因，由于抗菌藥物的廣泛使用，不同地區(qū)、醫(yī)院之間病原分布可能存在差異，了解其分布變化對醫(yī)生抗感染治療的合理用藥和減少菌株耐藥的出現(xiàn)具有重要的價值。本研究結(jié)果顯示，AECOPD發(fā)生細菌感染以革蘭陰性菌感染為主，這與已有的報道一致[14-17]。AECOPD患者往往伴隨著常年的香煙煙霧對肺部和呼吸道的長期刺激，使得呼吸道上皮細胞化生，增加了COPD疾病期間的黏膜炎性反應(yīng)，也影響了機體對微生物的免疫反應(yīng)。動物模型實驗結(jié)果表明[18]，香煙煙霧暴露產(chǎn)生的T細胞可能具有致病性，將接觸香煙煙霧小鼠產(chǎn)生的T細胞轉(zhuǎn)移到重組激活基因2(Rag-2)缺陷型小鼠中可以誘導肺氣腫表型，而與隨后的受體小鼠吸煙無關(guān)。本研究結(jié)果中COPD穩(wěn)定期組和加重期組吸煙指數(shù)明顯高于健康對照組，提示常年大量的吸煙習慣是導致AECOPD的直接原因。

T淋巴細胞是COPD中炎性反應(yīng)的關(guān)鍵成分，Th17細胞是最近描述的效應(yīng)T細胞亞群，主要分泌包括IL-17、IL-22、TGF-β1在內(nèi)的多種細胞因子，幾種炎性因子與自身免疫性疾病的發(fā)病機制有緊密聯(lián)系。 IL-17是一種促炎性細胞因子，其家族由6個成員組成，但抗菌活性主要與IL-17A、IL-17F和IL-17A / F異二聚體成員有關(guān)[19-20]。IL-17可通過趨化因子CXCL8和CCL20的分泌來調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)細胞(包括嗜中性粒細胞和淋巴細胞)向炎性反應(yīng)組織的募集[21]。此外，IL-17對大多數(shù)實質(zhì)細胞具有影響，包括表達IL-17受體的巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)，并且IL-17介導的信號傳導誘導靶細胞產(chǎn)生各種炎性介質(zhì)，例如TNF-α和IL- 6[22-23]。此外，IL-17在鼠肺上皮細胞中的過表達會導致單核細胞積聚并產(chǎn)生黏液，IL-17轉(zhuǎn)基因小鼠誘導了許多趨化因子和MMP-9的表達[24]。在香煙煙霧引起的肺氣腫動物模型中，暴露于慢性煙霧的小鼠在BAL中具有明顯更高的IL-17和IFN-γ產(chǎn)生細胞數(shù)量。相比之下，COPD患者和對照組的痰中IL-17水平無明顯差異[25]。Th17細胞還產(chǎn)生IL-22，IL-22與類風濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬等慢性炎性疾病有關(guān)，并且在宿主防御肺部細胞外細菌感染中起重要作用[26]。研究表明，COPD患者支氣管上皮細胞中IL-22陽性細胞的數(shù)量增加，在細菌感染期間，IL-22與IL-17A協(xié)同作用以誘導抗菌肽和趨化因子的產(chǎn)生[27]。在COPD患者或鼠肺氣腫模型中，肺細胞CD4或CD8 T細胞的擴增具有寡克隆性，戒煙之后，這種反應(yīng)仍然持續(xù)。對T細胞受體(TcR)的分析也揭示了COPD患者肺部CD4 T細胞的寡克隆性。這些研究表明，由抗原特異性T細胞向肺部募集所介導的細胞免疫可能在COPD的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[28-30]。

目前沒有直接證據(jù)表明Th17/Treg參與了COPD患者發(fā)生的氣道阻塞，但是大多數(shù)臨床研究表明，COPD中Th17細胞數(shù)量和細胞因子水平與對照組相比明顯更高[31-32]。由于小鼠的最大呼氣流量的測量較為困難，有學者使用了對甲膽堿吸入后的抵抗力的測量作為FEV1在小鼠模型中的替代指標，以評估小鼠實驗模型中的氣道阻塞，結(jié)果表明，COPD患者氣道對吸入的甲膽堿反應(yīng)頻繁，并且與氣道阻塞有關(guān)[33]，同時不同的鼠模型均顯示氣道高反應(yīng)性的發(fā)展呈IL-17A依賴性，這與暴露于香煙中的COPD小鼠的組織學結(jié)果一致[34]，從而證實了IL-17可參與COPD的高氣道反應(yīng)。此外，在COPD患者的痰液中也觀察到IL-17A濃度與中性粒細胞計數(shù)呈正相關(guān)，IL-17A對于暴露于香煙煙霧中的小鼠小氣道纖維化和炎性反應(yīng)至關(guān)重要，這表明該細胞因子在COPD期間對氣道阻塞具有促進作用[35]。這些實驗數(shù)據(jù)表明，發(fā)生持續(xù)性炎性反應(yīng)的肺部組織通過免疫細胞產(chǎn)生的Th17細胞因子及中性粒細胞的募集而參與了COPD患者氣道阻塞的發(fā)展，從而導致了AECOPD的發(fā)生。本研究結(jié)果還顯示了外周血Th17/Treg細胞水平對COPD患者急性加重期細菌感染具有一定的診斷價值，由于病例數(shù)相對較少，各統(tǒng)計結(jié)果可能存在一定的偏倚，機體Th17/Treg平衡作為COPD患者免疫靶向的治療仍有待進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

侯英宇：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；劉晨陽：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;張丹梅：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;楊敏：進行統(tǒng)計學分析