孟金柱，安清明，趙成剛，趙園園

（銅仁學院農林工程與規(guī)劃學院，貴州銅仁 554300）

哺乳動物的卵泡是生殖系統(tǒng)的重要組成部分，它在控制發(fā)情周期、發(fā)情行為，確保卵母細胞能力及后期胚胎存活率、排卵后黃體功能和孕酮合成[1-3]等方面起著重要作用。卵泡顆粒細胞可以特異表達17β-羥基類固醇脫氫酶受體，細胞色素P450芳構化酶受體和FSH等各種激素受體，并且將膜細胞分泌的雄激素轉化為雌激素（E2）分泌到卵泡液并輸送到血液中，在卵泡的發(fā)育過程中起著至關重要的作用[4]。

綿羊[5]、奶牛[6]和豬[7]等多種動物的轉錄調控機制已經通過轉錄組測序被發(fā)現(xiàn)。對水牛不同大小的卵泡顆粒細胞進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)免疫調節(jié)可能會參與卵泡的成熟和排卵，例如細胞毒性受到自然殺傷細胞的介導、同種異體排斥反應、抗原處理和呈遞、趨化因子信號通路等[8]。本研究旨在通過對貴州白山羊優(yōu)勢卵泡和從屬卵泡中的顆粒細胞進行轉錄組測序，篩選出卵泡發(fā)育上調相關基因，對篩選促進山羊卵泡顆粒細胞增殖、調控E2分泌的關鍵因子以及探討調控優(yōu)勢卵泡被選擇的潛在機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集 選取10只1歲齡健康的貴州白山羊，分別注射前列腺素2α（PGF2α）使其同期發(fā)情，同時每天使用B超儀檢測卵泡直徑大小，直到發(fā)情出現(xiàn)3 d后，從中挑選3只卵巢卵泡發(fā)育較好的山羊屠宰并采集優(yōu)勢卵泡（DF，直徑4.5～6 mm）與從屬卵泡（SF，直徑3～4.5 mm）。用1 mL注射器分別抽取DF和SF中的卵泡液后，剪開卵泡壁，刮取顆粒細胞（GCs）。

1.2 總RNA提取、文庫構建及測序 用Trizol法分別提取3只山羊DF及SF顆粒細胞中的總RNA，用RNeasy mini kit （Qiagen）純化，Agilent Bioanalyzer 2100檢測完整性，Qubit 2.0 Flurometer測量濃度后，交由北京諾和致源生物信息科技有限公司進行文庫構建、Illumina Hiseq 2500平臺測序，獲得原始reads。

1.3 數據處理及分析 通過FastQC （http://www.bioinfor matics.babraha m.ac.uk/projects/fastqc/）將獲得的原始reads過濾后獲得高品質的干凈reads。采用Trinity（http://trinityrnaseq.sourceforge.net/）將干凈reads從頭組裝得到unigenes序列。應用SOAP V2.0平臺將獲得的unigenes比對到山羊的RefSeq （ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/001/704/415/GCF_001704415.1_ARS1/）數據庫中，獲得mRNA。使用DESeq2軟件對獲得的mRNA進行差異表達分析并篩選出上調表達基因。使用DAVID軟件對得到的上調表達基因進行GO分析及KEGG信號通路分析。

1.4 反轉錄及引物合成 將轉錄組測序留存的總RNA反轉錄為cDNA，反應條件參照產品（北京全式金）說明書進行：42℃孵育15 min，85℃加熱5 s，用Primer 5.0設計具有代表性的4個上調表達基因的引物（表1），并使用β-actin作為內參基因，交由北京華大基因有限公司合成。

表1 供試引物序列

1.5 熒光定量PCR鑒定 Real-time PCR用于鑒定轉錄組測序中貴州白山羊DF與SF顆粒細胞中差異表達上調mRNA的相對表達量。設置5個樣本重復和3個技術重復，根據產品說明書構建20 μL PCR反應體系：模板cDNA 4 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR MIX 10 μL，H2O 5 μL，PCR反應程序：95℃預變性1 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40個循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計分析 各基因在DF和SF顆粒細胞中的相對表達量采用2－ΔΔCT來計算，并經β-actin校正后，采用平均值±標準誤來表示，應用SPSS17.0軟件進行顯著性分析。

2 結果

2.1 貴州白山羊卵泡顆粒細胞中上調表達基因的篩選 將測序結果比對到山羊的RefSeq數據庫后得到33 896個基因，其中FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）≥1的基因有13 644個。使用DESeq2軟件對這13 644個基因進行差異表達分析，設置參數：log2（DF FPKM/SF FPKM）＞0.5，P＜0.05，共獲得695個差異表達基因，其中233個表達顯著上調基因，聚類分析熱圖表明樣本之間的差異表達基因重復性較好（圖1），表2中列出了差異表達倍數最高的10個上調基因及其功能。

表2 貴州白山羊DF和SF中上調基因及其功能分析

2.2 山羊卵泡顆粒細胞中上調基因GO功能富集 通過對233個表達顯著上調mRNA進行GO功能富集分析，共分為三大類別44組：參與生物學過程（BP）的基因占72.7%，其中參與RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控過程的基因數達16個；參與細胞組分（CC）的基因占13.6%，其中參與原子核相關功能組分的基因有38個；參與分子功能的基因占13.6%，其中與ATP結合功能相關的基因有24個（圖2）。

2.3 山羊卵泡顆粒細胞中上調基因KEGG信號通路分析為進一步獲得與促進山羊卵泡發(fā)育相關的信號通路，通過kobas軟件對上調表達基因進行KEGG信號通路分析，共發(fā)現(xiàn)20條通路（圖3），在這些通路中，富集最為顯著的是核糖體通路。

2.4 山羊卵泡顆粒細胞中上調基因驗證結果分析 通過功能分析，最終從上調表達基因中篩選出4個具有代表性的在山羊卵泡發(fā)育過程中可能會起正調控作用的基因（表3）。相對熒光定量結果顯示，CALM2、TUT7和PDLIM3在DF和SF中的表達趨勢與轉錄組測序結果一致，且TUT7和CALM2在DF顆粒細胞中的表達量顯著高于SF（圖4）。

3 討論

表3 抑制貴州白山羊卵泡發(fā)育的候選基因

哺乳動物在發(fā)育過程中，卵巢上最大的卵泡即未來的優(yōu)勢卵泡持續(xù)生長、成熟并排出卵子[9-10]。有腔卵泡的生長表現(xiàn)為通過在時間和空間上的有序組織來促進對促性腺激素的響應，這首先導致卵泡募集，并伴隨著卵泡波的出現(xiàn)，然后促進優(yōu)勢卵泡生長成為排卵卵泡[11-12]。本研究通過對貴州白山羊DF和SF顆粒細胞進行轉錄組測序，篩選出233個上調表達基因。其他研究者也在不同物種中發(fā)現(xiàn)卵泡發(fā)育相關基因，如陸婷婷等[13]對川中黑山羊大、小卵泡進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)403個差異表達的基因，其中，顯著上調的有281個，顯著下調的有122個。郝慶玲[14]對牛（發(fā)生偏差前的第一大卵泡）PDF1和（發(fā)生偏差前的第二大卵泡）PDF2的研究發(fā)現(xiàn)608個差異表達的基因，并從中找出11個與卵泡發(fā)育密切相關的基因。沈曼曼[15]研究蛋雞卵泡發(fā)育，發(fā)現(xiàn)在小黃卵泡和F6卵泡中差異表達的基因有1 380個，其中，上調基因490個，下調基因890個。

本實驗分別對上調表達基因進行GO、KEGG分析，共篩選出4個具有代表性的基因，可能會促進卵泡的發(fā)育，熒光定量結果顯示，CALM2、TUT7和PDLIM3在DF和SF中的表達趨勢與轉錄組測序結果一致，且TUT7和CALM2在DF顆粒細胞中的表達量顯著高于SF。

在小鼠的研究中，TUT7通過介導mRNA的3' 端尿苷化，來消除卵母細胞生長過程中的轉錄本，對卵母細胞成熟和生育能力都至關重要[16]。在斑馬魚[17]和非洲爪蟾[18]的研究中發(fā)現(xiàn)，阻止TUT7的翻譯會導致原腸胚在形成過程中發(fā)生缺陷，尿苷缺陷型的胚胎不能逐步淘汰壞死的轉錄本，導致后期合子不能正常轉錄，而尿苷化會促進轉錄組重編程，進而驅動早期胚胎的發(fā)育轉變。鈣調蛋白（CALM）是一種普遍存在的Ca2+結合蛋白，調節(jié)大量Ca2+敏感的生物事件，包括Ca2+轉運、細胞內信號和轉錄調節(jié)[19-20]。轉基因小鼠實驗證明，過表達細胞核Ca2+-CaM依賴激酶II（CaMKII），心臟肥大發(fā)病率顯著增加[21]。抑制細胞核內CAMKII的活性使得轉基因小鼠的心臟比非轉基因小鼠小[22]。此外，CAMKII還參與了細胞凋亡信號的傳遞，CAMKII選擇性抑制劑可顯著抑制細胞凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，TUT7、CALM在卵泡DF顆粒細胞中的含量顯著高于SF中，推測其在山羊卵泡發(fā)育過程中可能促進卵泡顆粒細胞的生長，進而會導致卵泡的優(yōu)勢化。關于PDLIM3和LUM在卵泡中的研究尚未見報道，本研究結果顯示，PDLIM3在貴州白山羊DF顆粒細胞中的表達量高于SF中，但差異不顯著，暗示其可能不是促進卵泡成為優(yōu)勢卵泡的關鍵調控因子。

4 結論

本研究在貴州白山羊DF與SF中的顆粒細胞獲得233個上調表達mRNA。通過功能分析，篩選出2個可能與山羊卵泡發(fā)育相關的上調表達基因，并進行熒光定量PCR驗證，TUT7和CALM2在DF顆粒細胞中的表達量顯著高于在SF顆粒細胞中的表達量，推測這些基因在山羊卵泡發(fā)育過程中可能會促進卵泡的發(fā)育，最終導致優(yōu)勢卵泡被選擇。