向炬富 ，劉紅羽，趙 靜，鄢 冉，王政業(yè)，王 軍*，呂文發(fā)*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林長春 130118；2.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國際合作聯(lián)合重點實驗室，吉林長春 130118；3.長春職業(yè)技術(shù)學院現(xiàn)代農(nóng)學院，吉林長春 130118；4.長春市九臺區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，吉林長春 130118）

奶牛子宮內(nèi)膜炎是臨床上常見的繁殖障礙性疾病之一，主要是由于奶牛產(chǎn)后生殖道擴張、病原微生物持續(xù)侵入感染發(fā)病，如致病性大腸桿菌（EPEC）。大腸桿菌通過黏附于子宮內(nèi)膜上皮細胞激發(fā)相關(guān)炎癥通路，從而導致大量細胞因子（IL-6、IL-8和IL-10）釋放[1-2]。子宮內(nèi)膜炎常導致母畜妊娠中斷、屢配不孕，嚴重時可致使奶牛繁殖能力喪失，造成大量經(jīng)濟損失。對于大腸桿菌引起的奶牛子宮內(nèi)膜炎，臨床上主要的治療方法是應用抗生素，但長期使用會引起藥品殘留、環(huán)境污染等問題[3-4]。乳酸菌制劑已被證明具有抗炎和提高機體免疫力的潛力，有望替代抗生素成為治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的新一代藥劑[5]。有研究表明，乳酸菌的益生作用主要表現(xiàn)在與病原菌的營養(yǎng)競爭，以及代謝產(chǎn)物的抑菌作用[6]。乳酸菌通過強力附著于奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞，可以更好且持續(xù)地發(fā)揮其益生效果[7]。殼聚糖及其衍生物常被用于藥物的載體，可運載細菌特異性靶向目的細胞，且已被證明具有一定的抗炎作用[8-9]。為挑選出能夠有效抵御大腸桿菌的乳酸菌，有研究表明從健康奶牛子宮內(nèi)分離的乳酸菌能夠生產(chǎn)抑菌的有效物質(zhì)[10]。為進一步探究乳酸菌對細胞炎癥的影響，本研究挑選了3株分離自健康奶牛子宮的優(yōu)勢乳桿菌，即魏斯氏乳桿菌（L.weissella）、唾液乳桿菌（L.salivarius）和約氏乳桿菌（L.johnsonii），研究其對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞炎癥的影響，并探究其與殼聚糖季銨鹽（Chitosan Quaternary Ammonium Salt，CQN）的聯(lián)合作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基均購自賽奧克生物科技有限公司。DEPC水、胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/ F-12（1:1）均購自上海生工生物工程有限公司。Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII均購自大連TaKaRa公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將凍存的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞系（ATCC提供）置于37℃水浴鍋中快速復蘇，然后添加含10% 胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，置于5% 二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。細胞計數(shù)，每個大皿達到20萬個即可分組處理。

1.3 細菌培養(yǎng) 約氏乳桿菌、唾液乳桿菌、魏斯氏乳桿菌和致病性大腸桿菌均由本實驗室提供。將凍存的3株乳桿菌放至室溫，用接種環(huán)蘸取菌液在MRS固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h后用接種環(huán)挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h達1010CFU/mL，純化3次后予以備用。將凍存的大腸桿菌放至室溫，用接種環(huán)蘸取菌液在LB固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h后用接種環(huán)挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h達1010CFU/mL，純化3次后予以備用。

1.4 細胞活力檢測 將不同濃度的大腸桿菌（105、106、107、108CFU/mL）懸浮于含1%胎牛血清的無雙抗培養(yǎng)液中處理細胞24 h。稱取1 g殼聚糖季銨鹽（北京酷爾化學科技有限公司提供）溶于100 mL純水，梯度稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001 mg/mL后處理細胞24 h。按照乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供）說明書操作，檢測大腸桿菌處理和乳桿菌處理對細胞活力的影響。

1.5 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞炎癥模型建立 大皿細胞培養(yǎng)至20萬個，添加105CFU/mL和106CFU/mL的大腸桿菌懸液分別處理3、6、9、12、24 h，收集上清液，ELISA盒子（上海酶聯(lián)提供）檢測細胞因子IL-6和IL-8的變化以確定炎癥的發(fā)生。

1.6 細胞因子分析 細胞炎癥模型建立完成后，分組進行不同處理。對照組：正常培養(yǎng)的細胞；E.coli組：106CFU/mL大腸桿菌處理3 h致炎；LAB組：致炎后單獨添加108CFU/mL乳桿菌處理12 h；CQN組：致炎后單獨添加0.01 mg/mL殼聚糖季銨鹽處理12 h；LAB+CQN組：致炎后添加乳桿菌和殼聚糖季銨鹽混合處理12 h。處理完畢后3000 r/min離心10 min后取上清，按照說明書進行操作，ELISA盒子（上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供）檢測細胞因子IL-6、IL-8和IL-10的變化。

1.7 RT-qPCR分析 細胞處理后棄上清，PBS沖洗3次，Trizol法提取細胞RNA，然后按照試劑盒要求（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）對提取的樣本RNA進行反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR法檢測IL-6和IL-8的mRNA表達。熒光定量PCR反應體系：10 μL GreenTMPremix Ex TaqTMII，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，0.4 μL ROX reference Dye II，2 μL cDNA。熒光定量PCR所需引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.8 細菌黏附檢測 將細胞爬片（φ15 mm，NEST）置于24孔板中，分別加入等量的細胞過夜培養(yǎng)，不同處理后進行革蘭染色，油鏡下觀察細菌黏附情況。PBS沖洗3次后用胰蛋白酶將細胞吹落，稀釋涂布平板進行細菌計數(shù)，黏附率表示為每個細胞黏附的細菌數(shù)（CFU/個）。

1.9 統(tǒng)計分析 采用Graghpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，所有結(jié)果均表示為平均值±標準差，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義，P＞0.05表示差異沒有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌和殼聚糖季銨鹽對細胞活力的影響 通過對LDH釋放量的檢測來評估大腸桿菌和殼聚糖季銨鹽對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞活力的影響。由圖1-A可得，107、108CFU/mL的大腸桿菌對細胞均有顯著的損傷作用；而105、106CFU/mL的大腸桿菌無明顯損傷作用。由圖1-B可得，添加10、1 mg/mL的CQN極顯著降低了細胞活率，而0.1、0.01、0.001 mg/mL的處理并未對細胞顯示出損傷影響。

2.2 大腸桿菌誘導細胞炎癥發(fā)生 選擇105CFU/mL和106CFU/mL的大腸桿菌處理細胞，通過評估細胞因子的變化來確定炎癥的發(fā)生。如圖2所示，添加105CFU/mL的大腸桿菌處理6 h后，炎性因子IL-6（P＜0.05）和IL-8（P＜0.01）的分泌量均上升；而添加106CFU/mL的大腸桿菌處理3 h后即可觀察到炎性因子的顯著上升，且在24 h內(nèi)持續(xù)升高。結(jié)果表明，105CFU/mL的大腸桿菌處理6 h后或106CFU/mL的大腸桿菌處理3 h后，均可引起奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞的持續(xù)性炎癥。

2.3 不同處理對細胞因子的影響 如圖3所示，單獨添加魏斯氏乳桿菌、唾液乳桿菌和約氏乳桿菌處理均顯著降低了細胞因子IL-6的蛋白和mRNA表達（圖3-A、B），但對趨化因子IL-8的表達無顯著影響（圖3-C、D）。單獨添加CQN處理也顯著降低了IL-6的表達，而對IL-8無影響。約氏乳桿菌加CQN混合處理同時降低了IL-6和IL-8的表達（P＜0.05），而其他乳桿菌加CQN混合處理的抑炎效果并不明顯。IL-10是體內(nèi)的抑炎因子，炎性因子IL-6、IL-8與其比值反映了體內(nèi)細胞因子的平衡。相比其他處理組，約氏乳桿菌加CQN混合處理使得細胞因子的平衡恢復至常態(tài)，具有較好的抗炎效果（圖3-E、F）。

2.4 細菌黏附的變化 通過對細菌黏附的檢測觀察到，CQN的添加極顯著提升了約氏乳桿菌的黏附率（P＜0.001），但約氏乳桿菌和CQN混合處理并沒有顯著降低大腸桿菌的黏附率（圖4）。

3 討論

奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞作為抵抗病原菌侵染的第一道防線，對機體健康有著非常重要的作用[11]。大腸桿菌侵染內(nèi)膜上皮細胞引起奶牛子宮內(nèi)膜炎，從而阻礙受精和胚胎植入，甚至可能導致孕畜早期流產(chǎn)[12]。本研究結(jié)果表明，利用大腸桿菌可誘導奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞發(fā)生持續(xù)性炎癥，添加約氏乳桿菌和CQN治療后可顯著改善炎癥。

本試驗首先添加了不同濃度的大腸桿菌對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞進行長時間的處理，發(fā)現(xiàn)106CFU/mL的大腸桿菌處理3 h后，細胞因子IL-6和IL-8的表達顯著上升，且在24 h內(nèi)持續(xù)上升，確定了奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞炎癥的持續(xù)發(fā)生。致炎處理后，單獨添加乳桿菌和單獨CQN處理細胞12 h后均顯著降低了IL-6的釋放，但是未降至正常水平，且對IL-8的釋放無顯著影響，這可能是由于持續(xù)性的炎癥需要更長時間的治療。Wang等[13]在添加植物乳桿菌處理炎癥細胞時也觀察到相似現(xiàn)象，于是將治療時間延長后發(fā)現(xiàn)促炎因子的顯著下調(diào)。然而，本試驗發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌和CQN混合添加處理炎癥細胞后，細胞因子IL-6、IL-8和IL-10均恢復至正常水平，這表明乳桿菌和CQN混合后大大提高了其抗炎效果。有研究表明，大腸桿菌依賴菌體表面黏蛋白黏附于細胞膜進行侵染[4]。因此，本研究對大腸桿菌和約氏乳桿菌的黏附細胞的狀態(tài)進行了觀察，發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌和CQN混合處理盡管沒有顯著降低大腸桿菌對細胞的黏附率，但是抑制了其生長，并且CQN的添加顯著增強了約氏乳桿菌的黏附率，這可能是導致細胞炎癥減緩的重要原因之一。Inturri等[14]研究發(fā)現(xiàn)，長雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌的聯(lián)合使用可有效降低革蘭氏陰性菌的黏附性能。大量研究表明，乳桿菌聯(lián)合中藥、維生素和一些糖類可以有效減緩炎癥的發(fā)生并提高機體的免疫功能[15-17]。這些證據(jù)均表明，乳桿菌聯(lián)合多種物質(zhì)將會是高效治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的新走向。盡管本研究發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌和殼聚糖季銨鹽的混合處理可以有效抑制細胞因子的上升，但其是基于細胞層面的體外研究，且機制尚不明確，需要更深入的研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，約氏乳桿菌聯(lián)合CQN顯著減緩了大腸桿菌誘導的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞炎癥，可用于奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療。