韓福慧 ，李 倩，欒兆進(jìn)，王國義，柳 楠，賀建寧，薛 明

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.包頭市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古包頭 014013；3.赤峰市敖漢種羊場，內(nèi)蒙古赤峰 024300；4.全國畜牧總站，北京 100125）

在骨骼肌的生長發(fā)育過程中，骨骼肌細(xì)胞需經(jīng)歷增殖、分化、再生等過程，除已知生肌調(diào)節(jié)因子家族（MRFs）和肌細(xì)胞增強因子家族（MEF2）起調(diào)控作用外[1]，越來越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞增殖分化過程中扮演重要角色。miRNA作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，通過與靶基因mRNA的非編碼區(qū)的種子序列堿基互補配對結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA降解或阻遏其翻譯[2]。miR-206可通過抑制ld（MyoD抑制劑）的表達(dá)促進(jìn)肌細(xì)胞生成素（MyoGenin，MyoD）的表達(dá)，從而促進(jìn)成肌細(xì)胞分化[3-4]。miR-24在分化的成肌細(xì)胞中高表達(dá)，TGF-β/Smad3可以通過抑制miR-24的表達(dá)來抑制成肌細(xì)胞的分化[5]。miR-374b主要在胃癌、肺癌和乳腺癌等癌癥發(fā)生的過程中促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]。馬志遠(yuǎn)[7]研究顯示miR-374b負(fù)向調(diào)控小鼠成肌細(xì)胞的分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Ma等[8]研究表明，miR-374b直接靶向Myf6基因并負(fù)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞生成。Myf6基因作為MRFs家族的成員，在肌肉細(xì)胞分化過程中起重要作用[9]，并通過與衛(wèi)星細(xì)胞和肌纖維的融合在肥大肌肉生長中發(fā)揮作用[10]。

目前對miR-374b的研究多集中在對癌細(xì)胞和小鼠成肌細(xì)胞增殖分化的影響，但是否對綿羊等家畜成肌細(xì)胞增殖分化有影響鮮有報道。因此，本研究通過過表達(dá)和抑制miR-374b后Myf6基因的變化及其對綿羊成肌細(xì)胞增殖分化的影響，驗證在綿羊肌細(xì)胞中miR-374b與Myf6基因的關(guān)系，為肉羊分子育種提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集 選擇健康70日齡的南非肉用美利奴羊1只，將其從青島奧特種羊場連同子宮一起帶回?zé)o菌操作實驗室。

1.2 成肌細(xì)胞分離培養(yǎng) 將帶回細(xì)胞間的綿羊子宮剪開，取出胎羊，迅速剪下胎羊后腿用PBS沖洗數(shù)次，移入無菌超凈臺中，剔除皮膚、筋膜等組織后，采用I型膠原酶和胰酶兩步酶消化法分離細(xì)胞，結(jié)合差速貼壁純化得到成肌細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化 細(xì)胞傳代后，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時，棄去完全培養(yǎng)基，用PBS（含雙抗）清洗，加入配好的分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化，每天換液1次；觀察記錄分化第0（未加分化培養(yǎng)液時）、24、72、120小時細(xì)胞形態(tài)變化，并依次收集細(xì)胞，放-80℃冰箱暫存，用于總RNA提取。

1.4 不同分化時期實時熒光定量PCR采用Trizol提取不同分化時期細(xì)胞總RNA，采用核酸蛋白分析儀（Eppendorf）測量RNA濃度，Myf6、MyHC、MyoG、MyoD基因按照羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，取cDNA進(jìn)行qRT-PCR，GAPDH基因為內(nèi)參。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。miR-374b按照microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書進(jìn)行，以5sRNA為內(nèi)參，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；PCR反應(yīng)95℃ 12 s，62℃ 40 s，共40個循環(huán)，62℃時采集熒光信息。采用2-ΔΔCt計算進(jìn)行單因素方差分析，引物序列見表1。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 挑選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到85%～90%時，棄去完全培養(yǎng)基，用PBS（無雙抗）清洗，胰酶消化后加完全培養(yǎng)基終止消化，離心后棄去上清，清洗2次，加入純培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液加到六孔板中，再加入完全培養(yǎng)基至每孔最終液體為2 mL；待六孔板中的細(xì)胞生長貼壁至30%～40%時，用PBS（無雙抗）清洗2遍，換純培養(yǎng)基；按照micoRNA mimics、inhibitor和陰性對照說明書，對六孔板中的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后12 h除去純培養(yǎng)基，然后每孔加入2 mL分化培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞，放入-80℃冰箱保存，用于總RNA和蛋白提取。

1.6 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞實時熒光定量PCR提取RNA、反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR步驟同1.4。

1.7 Western blot檢測 將收集的細(xì)胞從-80℃冰箱取出，低速離心后吸出多余殘留液體，測定蛋白濃度，按蛋白濃度倍數(shù)添加裂解液稀釋蛋白使各蛋白濃度在同一水平，加入裂解液后輕輕吹打混勻，靜置裂解30 min；期間依次配置分離膠和濃縮膠，將Marker和所需樣品緩慢加入泳道；蛋白經(jīng)凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜于PVDF膜，加封閉液室溫?fù)u床封閉2.5～3 h；加一抗（1:1 000），4℃，過夜；PVDF膜1×TBST搖床清洗3次后加二抗（1:2 000），室溫孵育1 h，注意避光；PVDF膜1×TBST搖床清洗3次，超純水搖床清洗2次；PVDF膜上加顯色液（A液:B液=1:1），覆上保鮮膜，凝膠成像儀上曝光，Image J 1.39U進(jìn)行目的條帶的光密度值分析。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 成肌細(xì)胞的體外分化 如圖1所示，細(xì)胞分化第24小時細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，誘導(dǎo)分化第72、120小時出現(xiàn)大量肌管。

2.2 不同分化時期基因表達(dá)量 如圖2所示，隨著細(xì)胞分化時間的增長，Myf6基因表達(dá)量也隨之增長，在分化第0小時與第24小時差異不顯著，第72、120小時與第0、24小時差異極顯著。而miR-374b基因的表達(dá)趨勢為先上升后下降，在分化第0、24、72小時呈遞增趨勢（P＜0.01），分化第120小時miR-374b基因的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著下降，但仍高于生長期表達(dá)量。

由圖3可知，增殖標(biāo)志基因MyoD在分化24 h表達(dá)量最高，極顯著高于其他3個時期；120 hMyoD表達(dá)量次之，與0 h差異不顯著，顯著高于72 h；分化標(biāo)志基因MyHC、MyoG在細(xì)胞增殖期及分化初期表達(dá)量最低，在分化72 h和120 h時表達(dá)量呈現(xiàn)極顯著上升。以上結(jié)果說明，綿羊成肌細(xì)胞分化成功。

2.3miR-374b調(diào)控Myf6及各標(biāo)志基因的表達(dá) 如圖4所示，miR-374b過表達(dá)載體（mimics）轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后，miR-374bmRNA表達(dá)量極顯著高于陰性對照組，而Myf6基因mRNA表達(dá)量極顯著低于陰性對照組，Myf6基因蛋白表達(dá)量極顯著低于陰性對照組。結(jié)果表明，成肌細(xì)胞過表達(dá)miR-374b后顯著抑制了Myf6基因的表達(dá)。

由圖5可知，miR-374b過表達(dá)后MyHC基因mRNA表達(dá)量極顯著低于陰性對照組，MyoG、MyoD基因表達(dá)量與陰性對照組差異不顯著。

如圖6所示，miR-374b抑制載體（inhibitor）轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后，miR-374b表達(dá)量極顯著低于陰性對照組，而Myf6基因表達(dá)量極顯著高于陰性對照組；Myf6基因蛋白表達(dá)量極顯著高于陰性對照組。結(jié)果表明，成肌細(xì)胞抑制miR-374b后使得Myf6基因的表達(dá)顯著上升。

由圖7可知，轉(zhuǎn)染miR-374b抑制載體后，MyHC、MyoD基因表達(dá)量極顯著高于陰性對照組，MyoG基因表達(dá)量顯著低于陰性對照組。

3 討論

細(xì)胞在分化過程中最先被激活形成成肌細(xì)胞，成肌細(xì)胞繼續(xù)增殖并沿著一定方向生長，它們平行排列并融合形成肌管，隨著分化程度的加深，肌絲生長成為肌原纖維，細(xì)胞核移至周圍后形成肌纖維[11]。本實驗采用酶消化法分離細(xì)胞，相較于組織塊分離法獲得細(xì)胞更加迅速，極大地縮短了實驗用時，同時采用差速貼壁純化成肌細(xì)胞，2 h后換液，可有效排除其他貼壁細(xì)胞的干擾，保證成肌細(xì)胞的均一。在誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化時，分化第72小時細(xì)胞已明顯分化融合形成肌管，在小鼠中分化第72小時可以觀察到少量肌管的出現(xiàn)，到第96小時有大量肌管，這可能與物種差異有關(guān)[7]。

生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）家族及肌細(xì)胞增強因子（MEF2）家族分別在骨骼肌發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用[12]。MRFs家族由MyoD、MyoG、Myf5和Myf64個基因組成，它們在不同的染色體位置上具有不同的表達(dá)模式[13]。Myf5和MyoD是初級的肌肉調(diào)節(jié)因子，其決定是否可以激活靜息肌肉衛(wèi)星細(xì)胞以成為有著分化功能的肌肉干細(xì)胞。因此，它們參與肌肉細(xì)胞的定型，并且一般在成肌細(xì)胞增殖和分化中表達(dá)[14]。MyoG和Myf6基因為次級肌源性調(diào)節(jié)因子，其在分化和融合過程中表達(dá)，主要功能是誘導(dǎo)成肌細(xì)胞的分化和融合成肌管[15]。因此，MyoG基因可用作細(xì)胞分化的標(biāo)記基因[16]。因此，本實驗通過對MyoG、MyoD、Myf6等標(biāo)志基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，從而揭示miR-374b對成肌細(xì)胞增殖分化調(diào)控作用。

本研究結(jié)果表明，miR-374b表達(dá)量隨著分化時間的增加呈先增長后下降趨勢，這預(yù)示著miR-374b可能在成肌細(xì)胞分化的前期和后期發(fā)揮了不同的生物學(xué)功能，有待于進(jìn)一步研究；同時其變化趨勢與在小鼠成肌細(xì)胞分化研究中miR-374b表達(dá)量結(jié)果一致[7]；Myf6及分化標(biāo)志基因MyHC、MyoG表達(dá)呈持續(xù)增長趨勢，MyoG基因在細(xì)胞分化初期表達(dá)量較低，在細(xì)胞分化末期大量表達(dá)，符合該基因表達(dá)模式[7]。

在本研究中，miR-374b過表達(dá)組（抑制組）相對于陰性對照組極顯著上調(diào)（下調(diào)），說明轉(zhuǎn)染實驗成功。過表達(dá)miR-374b后，Myf6基因表達(dá)量極顯著下調(diào)；抑制miR-374b后，Myf6基因出現(xiàn)極顯著上調(diào)的現(xiàn)象。Myf6基因在肌肉發(fā)育中結(jié)合在肌肉特異基因的啟動子上，開啟這些基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)肌肉分化[9]。因此本實驗說明在綿羊中miR-374b抑制成肌細(xì)胞分化是通過直接靶定在Myf6基因的3'UTR，參與Myf6基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)實現(xiàn)的，這與在小鼠中研究結(jié)果相同[8]。同時本研究中抑制miR-374b的表達(dá)后MyoD基因表達(dá)量極顯著高于陰性對照組，MyoG基因表達(dá)量顯著低于陰性對照組，可能是因為MyoG基因的干擾伴隨有Myf6基因的高表達(dá)，Myf6基因?qū)yoG有部分代償作用，而Myf6基因的干擾并未伴隨有MyoG基因的高表達(dá)，Myf6與MyoG基因的代償作用是單向的而非相互的，這與文獻(xiàn)中結(jié)果一致[17]。

4 結(jié)論

miR-374b表達(dá)量隨著分化時間的增加呈先增長后下降趨勢，可能在細(xì)胞分化前后發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能；Myf6及各分化標(biāo)志基因隨著細(xì)胞分化時間增長，mRNA表達(dá)量隨之增長，綿羊成肌細(xì)胞分化成功。對成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-374b的過表達(dá)及抑制載體的結(jié)果說明miR-374b負(fù)向調(diào)控MyHC、Myf6基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制成肌細(xì)胞分化。Myf6可能對MyoG基因有部分代償作用。綜上結(jié)果表明，在綿羊成肌細(xì)胞中miR-374b也可通過靶定Myf6基因，進(jìn)而負(fù)向調(diào)控成肌細(xì)胞分化，抑制綿羊骨骼肌生長。