李慧鋒 ，石 雄，黃 翔，張玳維，劉悅磊，張 臻，朱文進，朱芷葳

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.河北師范科技學(xué)院動物科技學(xué)院，河北昌黎 066600）

可變剪切是調(diào)節(jié)基因表達和產(chǎn)生蛋白組多樣性的重要機制。真核細胞基因中存在著大量的可變剪切，動物細胞中也存在著組織特異性[1-2]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物1（Peroxisome Proliferator-Activated ReceptorγCoactivator 1，PGC-1）基因在動物多個器官中有著十余種不同的可變剪切體，這些剪切體中產(chǎn)生不同蛋白，導(dǎo)致其實現(xiàn)的基因功能存在差異[3]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor，BDNF）基因在雞腦部不同部位具有多個的剪切體表達，不同可變剪切的表達可能具有影響DNA甲基化水平的功能[4]。在小鼠肝臟中，支架蛋白基因可變剪切體APPL1sv過量表達會引起肥胖和糖尿病發(fā)生，如果抑制APPL1sv的表達將會大幅度降低高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗和小鼠肝臟葡萄糖生成[5]。禽類在不同的生理功能時期也受到可變剪切這種調(diào)控方式的影響。對肌肉組織的多項研究表明，肌肉生長抑制素（Myostatin）基因的可變剪切可以影響雞、鴨和鵪鶉的肌纖維形成[6-8]。周敏等[9]研究得出雞血管活性腸肽受體1（Vasoactive Intestinal Peptide Receptor 1，VIPR-1）基因在4個時期6個組織中都有不同可變剪接體表達。肝臟作為各種物質(zhì)的代謝器官，對于從飼料中吸收的營養(yǎng)物質(zhì)代謝、脂類物質(zhì)合成等起重要作用。李慧鋒等[10]就蛋雞產(chǎn)蛋前后時期肝臟表達差異的基因進行分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)脂蛋白186等一些在產(chǎn)蛋前后肝臟中表達量差異顯著的基因直接與脂類代謝有關(guān)。但哪些肝臟基因在不同的生理時期會發(fā)生可變剪切差異，以及這些基因的可變剪切差異影響肝臟的哪些功能，目前仍缺乏深入的研究。本實驗基于蛋雞在產(chǎn)蛋前后的肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對基因的可變剪切事件、可變剪切方式在肝臟組織中不同生理時期的差異性及其與對肝臟功能的影響進行分析，以期為禽類不同生理時期肝臟功能的調(diào)節(jié)變化在基因可變剪切差異方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計 為排除環(huán)境、飼料營養(yǎng)等因素對母雞開產(chǎn)前后肝臟功能差異的影響，本實驗選用4個全同胞家系的白來航母雞，每個全同胞家系6只母雞，共24只，在完全相同的飼料營養(yǎng)和飼養(yǎng)條件下，全期單籠飼養(yǎng)，自由飲水采食。從第17周開始，每個全同胞家系中推測出的首次產(chǎn)蛋前1周和記錄的產(chǎn)蛋后1周的2個生理時期的母雞共6只，進行屠宰取肝臟樣品并測定相關(guān)生長數(shù)據(jù)。為降低實驗中推測產(chǎn)蛋前1周存在的判定風(fēng)險，本研究通過設(shè)定冗余的全同胞家系和每個家系不少于6只母雞的辦法來確保屠宰測定的全同胞中處于產(chǎn)蛋前1周的母雞至少有3個生物學(xué)重復(fù)。最終，獲得符合來自3對全同胞母雞各自處于產(chǎn)蛋前1周和產(chǎn)蛋后1周的6個肝臟樣品，用于總RNA提取。

1.2 RNA樣本的提取和測序 新鮮采取的1 g肝臟樣品在盛有液氮的研缽中研磨至粉末狀，加Trizol裂解、經(jīng)氯仿和異丙醇等多步提取總RNA，沉淀于乙醇。提取的產(chǎn)蛋前和產(chǎn)蛋后2個生理階段的6只白來航蛋雞的肝臟RNA樣品送上海派森諾生物科技股份有限公司采用Illumina Hiseq高通量測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 測序結(jié)果分析 通過上機測序得到的原始測序數(shù)據(jù)以FASTQ格式儲存。測序所得到轉(zhuǎn)錄本序列質(zhì)量較高，將長度小于50 bp序列、序列中含有不定堿基等低質(zhì)量序列按照數(shù)據(jù)過濾。經(jīng)過標準處理的序列片段用HISAT2軟件比對到Ensembl數(shù)據(jù)庫公布的雞參考基因組序列。

1.4 可變剪切分析 本研究使用rMATs軟件[11]對每個樣品的可變剪切事件進行分類和表達量統(tǒng)計。rMATs為Python軟件，在終端下輸入：wget http://rnaseqmats.sourceforge.net/rmats4.0.2/index.html下載rMATs程序。使用rMATs分別按照3個生物學(xué)重復(fù)對比包含全同胞母雞的產(chǎn)蛋前后2個樣本的文件。對rMATs輸出的5種可變剪切事件的結(jié)果文件進行對比整理，得出產(chǎn)蛋前1周和后1周母雞肝臟中發(fā)生的外顯子跳躍（Skipped Exon，SE）、外顯子互斥（Mutually Exclusive Exons，MXE）、可變5'端位點（Alternative 5' Splice Site，A5SS）、可變3'端位點（Alternative 3'Splice Site，A3SS）和內(nèi)含子保留（Retained Intron，RI）5種可變剪切事件。進一步用rMAT軟件對可變剪切事件進行差異分析，選取P-值的多重假設(shè)檢驗校正，將FDR＜0.05的可變剪切事件認為是肝臟基因在產(chǎn)蛋前1周和后1周具有顯著差異的可變剪切事件，并得出發(fā)生可變剪切差異的基因列表。

1.5 獲得的可變剪切基因功能分析 應(yīng)用在線DAVID軟件[12]對發(fā)生可變剪切差異的所有基因進行功能富集分析。富集分析得出的基因?qū)㈡溄拥終EGG、SWISSPROT等數(shù)據(jù)庫給出所涉及的代謝途徑或功能注釋信息，綜合多種結(jié)果分析與肝臟中營養(yǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)的重要功能基因。

2 結(jié)果

在參考基因組上對比分析獲得的Reads，結(jié)果表明，產(chǎn)蛋前1周3個肝臟組織樣品讀長（Reads）比對到基因區(qū)域的Reads占所有Reads的百分比，即基因組的比對率分別為86.70%、87.05% 和87.58%，產(chǎn)蛋后1周3個肝臟樣品Reads的對比率分別為89.52%、84.38%和88.84%。這2組數(shù)據(jù)經(jīng)卡方檢驗其P值為0.955 0，表明產(chǎn)蛋前后可變剪切的基因數(shù)量總數(shù)在基因組水平上沒有差異。分析得到可變剪切事件在產(chǎn)蛋前后分別為14 518和14 683個，涉及的基因分別為5 274個和5 337個，可變剪切涉及的基因占基因組全部已知基因的31.62%。平均每個基因有2.75個剪切體轉(zhuǎn)錄本。本文分析了雞肝臟在首次產(chǎn)蛋前后的5種可變剪切方式。由表1可見，外顯子跳躍事件最多，產(chǎn)蛋前后分別有11 669個和11 807個，5' 可變剪切位點事件最少，產(chǎn)蛋前后分別有325個和336個。這2組數(shù)據(jù)經(jīng)卡方檢驗分析得出產(chǎn)蛋前1周和后1周在可變剪切總量和各種可變剪切的數(shù)量上都沒有顯著差異。在雞肝臟基因表達組的可變剪切類型中，外顯子跳躍是主要剪切方式，占所有可變剪切事件80.4%，是蛋白質(zhì)形成差異的主要機制。

對rMAT結(jié)果進行篩選，將FDR ≤0.05的事件判定為差異可變剪切事件，本次研究共發(fā)現(xiàn)20個基因在產(chǎn)蛋前后1周發(fā)生了差異可變剪切，其中1個為功能未知的長鏈非編碼RNA（ENSGALG00000053982）。在這些基因中共發(fā)現(xiàn)4種可變剪切事件在產(chǎn)蛋前后產(chǎn)生差異，各有2個基因發(fā)生了3'和5'端可變剪切位點事件，在內(nèi)含子保留事件中沒有找到差異的可變剪切，在選擇跳躍可變剪切類型中發(fā)生了1個差異事件，在外顯子跳躍類型中有16個差異跳躍可變剪切事件（表2）。不同的基因有著不同的剪切拼接體，其中BF2和MTTPL基因外顯子跳躍類型剪切體在產(chǎn)蛋前1周和后1周肝臟中的表達拷貝數(shù)最多。產(chǎn)蛋后BF2和MTTPL基因跳躍類型剪切體的表達量分別是產(chǎn)蛋前的3.99倍和3.47倍。產(chǎn)蛋后NAV2基因剪切體的表達量為產(chǎn)蛋前的4.83倍，但其拷貝數(shù)量較少。跳躍的剪切體拷貝數(shù)總體數(shù)量較少，多個基因的跳躍剪切體拷貝數(shù)在產(chǎn)蛋前后數(shù)量變化較小。外顯子選擇性跳躍MXE的差異基因BF2的正常剪切體拷貝數(shù)在產(chǎn)蛋后有所增加，其選擇性跳躍的剪切體拷貝數(shù)在產(chǎn)蛋后增加較大，為產(chǎn)蛋前拷貝數(shù)的4.44倍。

表1 蛋雞肝臟中可變剪切事件發(fā)生的類型與數(shù)量

表2 蛋雞肝臟中產(chǎn)蛋前后外顯子可變剪切差異的基因

應(yīng)用DAIVD分析軟件在線對所有可變剪切類型的19個已知基因進行功能富集分析，得出細胞內(nèi)吞代謝途徑受到4個差異可變剪切基因的影響（P=0.003 9，F(xiàn)DR=0.049 0），經(jīng)KEGG代謝途徑分析，這4個基因分別是E3泛素蛋白連接酶（Neural Precursor Cell Expressed，Developmentally Down-Regulated 4，NEDD4）、E3泛素蛋白連接酶（SMAD specific E3 Ubiquitin Protein Ligase 1，SMURF1）主要組織相容復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex Class I Antigen，BF2) 和成纖維細胞生長因子受體（Fibroblast Growth Factor Receptor，F(xiàn)GFR3）。這4個基因在細胞內(nèi)吞代謝途徑中定位于細胞膜上（圖1），它們均與肝臟細胞膜內(nèi)吞小泡的形成有著直接的關(guān)系。

3 討論

在雞的基因組上，50%～60%雞的基因存在著可變剪切現(xiàn)象，每一基因約有2.3個可變的轉(zhuǎn)錄本[13]。本次研究結(jié)果表明肝臟組織樣品讀長（Reads）與基因組的比對率最低為84.38%，說明雞肝臟的轉(zhuǎn)錄組表達了所有基因中的大部分基因。這與Li等[14]報道20周齡青年雞和30周齡產(chǎn)蛋雞的基因比對率分別為83.0%和84.2%的結(jié)果較為一致。在整個基因組水平上，產(chǎn)蛋前后可變剪切的基因數(shù)量總數(shù)沒有顯著性差異。本研究得到的可變剪切事件在產(chǎn)蛋前后分別為14 518個和14 683個，涉及的基因分別為5 274個和5 337個，可變剪切涉及的基因占基因組全部已知基因的31.62%，這一結(jié)果與Tang等[13]的報道差異較大，主要由于其所做的生物信息學(xué)研究分析了2005年GenBank中的雞胚胎和成年雞器官的EST序列，樣品來源廣泛，其中涉及肝臟的樣品有7個，共6 124條EST序列。本實驗得到的肝臟數(shù)據(jù)量遠遠大于當(dāng)時的數(shù)據(jù)量，可得出肝臟中的可變剪切涉及的基因數(shù)要比Tang等所預(yù)計的較少，同時，不同組織中的可變剪切基因也存在差異。平均每個基因有2.75個剪切體轉(zhuǎn)錄本。對比雞基因組2018年3月的組裝序列GRCg6a，16 878個確定的基因，基因轉(zhuǎn)錄本39 288個，平均每個基因有2.33個剪切體轉(zhuǎn)錄本。說明可變剪切在肝臟中發(fā)生的可變剪切事件比整個基因組上發(fā)生的可變剪切頻率高。

本研究得出雞肝臟中存在著各種可變剪切的類型，主要類型為外顯子跳躍，這種剪切類型占到所有可變剪切類型的80.4%。在雞產(chǎn)蛋前后1周肝臟中差異可變剪切的20個基因中，發(fā)生外顯子跳躍的基因有16個。Li等[14]報道20周齡青年雞和30周齡產(chǎn)蛋雞肝臟的可變剪切類型主要為內(nèi)含子滯留（RI32%）和外顯子跳躍（SE24%）?？赡軆煞矫嬖?qū)е铝诉@2個研究的結(jié)果不同：首先是可變剪切情況較為復(fù)雜，肝臟轉(zhuǎn)錄組中實際存在的可變剪切形式較多，不同分析軟件由于編譯的算法之間不同導(dǎo)致得出的結(jié)果存在著一定差異；其次為樣本差異，本研究采用全同胞設(shè)計，在首次產(chǎn)蛋前1周和后1周選取的肝臟樣品來源于1對全同胞姐妹，盡可能降低了樣本個體之間的差異。

本研究用rMAT軟件分析得出20個差異的可變剪切基因，通過對除去功能未知的長鏈非編碼RNA以外19個差異剪切基因進行功能富集分析，得出產(chǎn)蛋前后1周有4個可變剪切差異基因涉及細胞內(nèi)吞作用的代謝途徑。細胞內(nèi)吞（Endocytosis）是從細胞表面除去配體、營養(yǎng)物質(zhì)、質(zhì)膜蛋白和脂質(zhì)，并將這些大分子物質(zhì)或其他物質(zhì)（如細菌病毒等）包被成為囊泡進入細胞內(nèi)部的方式。大部分物質(zhì)進入細胞的主要途徑是網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞，這種類型細胞內(nèi)吞在組織器官的發(fā)育過程中對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有至關(guān)重要的作用。細胞內(nèi)吞作用涉及到細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、細胞生長和分化、神經(jīng)突觸的活化和傳遞、細胞趨化以及免疫反應(yīng)等多種細胞生理活動[15]。

在4個涉及細胞內(nèi)吞作用的可變剪切差異基因中，有2個是E3泛素蛋白連接酶基因NEDD4和SMURF1，這2個基因均屬于HECT（Homologous to E6AP C Terminus）家族的基因，該家族具有HECT結(jié)構(gòu)域，其中保守的Cys殘基可與E2泛素偶聯(lián)酶攜帶的泛素形成硫酯鍵，E2先將泛素傳遞給E3，再由E3傳遞給底物。NEDD4蛋白可以通過與其C2結(jié)構(gòu)域與網(wǎng)格蛋白γ2高親和力的結(jié)合使網(wǎng)格蛋白γ2泛素化來誘導(dǎo)細胞內(nèi)吞作用[16]。成纖維細胞生長因子3（Fibroblast Growth Factor Receptor 3，F(xiàn)GFR3）蛋白能夠介導(dǎo)網(wǎng)格蛋白依賴和非依賴型的細胞內(nèi)吞，但FGFR3誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)持續(xù)的時間比FGFR1誘導(dǎo)的時間短[17]。

主要組織相容性復(fù)合體MHC-II參與的細胞內(nèi)吞代謝途徑是由一種稱為分子伴侶恒定鏈(Invariantchain，Ii)蛋白的引導(dǎo)，使細胞表面MHC-II與網(wǎng)格蛋白等形成復(fù)合體一起內(nèi)化，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中組裝并向內(nèi)質(zhì)體運輸，交換內(nèi)質(zhì)體中的抗原肽，并迅速循環(huán)回質(zhì)膜[18]。MHC抗原BF2有5種SE可變剪切形式，同時還有一種MXE可變剪切形式，這些可變剪切表達的剪切體形式在產(chǎn)蛋前1周到產(chǎn)蛋后1周的表達拷貝數(shù)都是增加的，其中1種可變剪切體的表達拷貝數(shù)從1 698升高到6 772，產(chǎn)蛋后1周的絕對量為產(chǎn)蛋前的3.98倍，MXE正常外顯子連接剪切體拷貝數(shù)在產(chǎn)蛋前后分別為6 956和7 990，升高1.15倍，其跳躍連接剪切體拷貝數(shù)則從924拷貝升到4 103拷貝，有4.44倍的變化。不同的剪切體在不同組織中表達，其功能可能存在著一定差異。雞肝臟不同生理時期的1-?；视?3-磷酸O-酰基轉(zhuǎn)移酶2（1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 2，AGPAT2）基因研究表明，該基因的2個轉(zhuǎn)錄本能夠在不同程度上促進磷脂酸以及甘油三酯的合成[19]。Han等[20]采用定量PCR技術(shù)研究了珍珠雀卵黃蛋白原/ 低密度脂蛋白受體 (Vitellogenin/Very Low Density Lipoprotein Receptor，VTG/VLDL-R)mRNA在不同組織和卵母細胞生長不同階段的轉(zhuǎn)錄表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VTG/VLDL-RmRNA在卵黃原卵母細胞和骨骼肌中高水平表達短型LR8-型剪切體，而在肝臟和骨骼肌中也可檢測到不同的LR8+型剪切體。這種組織間的不同剪切體差異是如何被調(diào)控的，以及這些差異是否會影響該VTG/VLDL-R功能的實現(xiàn)或者VTG/VLDL-R功能在效率上是否有差異等問題仍需進一步研究。

MHCBF2基因剪切體拷貝數(shù)增加說明肝細胞的胞吞作用在產(chǎn)蛋后比產(chǎn)蛋前有所增強。肝臟細胞通過增加胞吞作用加速一些營養(yǎng)物質(zhì)進入肝臟細胞，快速合成大量產(chǎn)蛋所需的各類物質(zhì)，以滿足生理狀態(tài)變化的需要。在雌激素控制下，肝臟中合成這些卵黃化合物在雞性成熟時被強烈誘導(dǎo)。產(chǎn)蛋開始后，大量卵黃脂質(zhì)和蛋白質(zhì)前體在肝臟合成，然后分泌到血液中，到達卵巢，轉(zhuǎn)移到卵母細胞中。有研究表明肝臟中合成和分泌的脂蛋白和大多數(shù)卵黃前體蛋白也是通過卵母細胞表面特定受體的內(nèi)吞過程被卵母細胞所吸收[21]。在肝臟中，雞性成熟時肝臟載脂蛋白的表達增加40倍，開產(chǎn)蛋雞的肝臟脂肪生成和血脂比青年雞分別增加了15倍和20倍[22-23]。肝臟細胞內(nèi)吞作用在脂肪合成代謝中所起的作用有著十分重要的研究價值。

本研究得到蛋雞在產(chǎn)蛋前后肝臟轉(zhuǎn)錄組中的可變剪切差異基因，這些基因涉及了多種肝細胞的功能，其中細胞內(nèi)吞作用受到了多個可變剪切差異基因的影響。本研究中得到的可變剪切差異基因不同的剪切體及其表達的拷貝數(shù)可能會影響到物質(zhì)通過胞吞作用進入肝臟細胞的效率。這些可變剪切是否通過胞吞作用影響肝臟細胞對營養(yǎng)物質(zhì)（如脂類、糖類物質(zhì)）的吸收和傳化還需在細胞水平上進一步研究。

4 結(jié)論

本研究得出雞肝臟中的基因表達在產(chǎn)蛋前后存在著各種可變剪切的類型，主要類型為外顯子跳躍。蛋雞部分肝臟基因表達的可變剪切方式也在其首次產(chǎn)蛋前1周和產(chǎn)蛋后1周發(fā)生了較大變化，比起基因表達量差異的變化，基因可變剪切方式的變化在總體數(shù)量上較少。在蛋雞首次產(chǎn)蛋前后，4個定位于細胞膜上的可變剪切體表達差異基因NEDD4、SMURF1、BF2和FGFR3通過細胞內(nèi)吞代謝途徑影響了肝臟對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本研究可以為基因表達層面上研究產(chǎn)蛋前后肝臟生理功能和深入理解肝臟細胞內(nèi)吞作用對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)化提供一些剪切體功能研究基礎(chǔ)。

致謝：本研究在試驗設(shè)計和試驗動物等方面得到了中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊寧和李俊英等多位老師的幫助，在轉(zhuǎn)錄組分析部分得到了山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李旭凱老師的幫助。在此對所有幫助過此項試驗工作的老師和同學(xué)表示衷心的感謝！