李芳玉 ，黃光云，王自豪，滕少花，曹艷紅，孫俊麗，雷初朝，廖玉英*

（1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西家畜遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

家養(yǎng)山羊是在人類生產(chǎn)生活中發(fā)揮重要作用的家畜品種之一。通過山羊形態(tài)多樣性研究，《中國(guó)羊品種志》提出彎角野山羊（Capra aegagrus）和旋角野山羊（Caprafalconeri）是現(xiàn)代家養(yǎng)山羊的野生祖先[1]。由于哺乳動(dòng)物mtDNA具有母系遺傳、不重組、進(jìn)化速度相對(duì)較快等特點(diǎn)，因此mtDNA是研究動(dòng)物遺傳多樣性和起源進(jìn)化的重要遺傳標(biāo)記?；趍tDNA序列研究發(fā)現(xiàn)，全世界山羊共有7個(gè)支系（A-G）[2-7]。利用現(xiàn)代生物技術(shù)研究山羊的分子遺傳多樣性，對(duì)了解山羊的起源、分化以及山羊的品種資源保護(hù)和利用有重要作用。

都安山羊和隆林山羊均為廣西壯族自治區(qū)的地方肉用山羊品種，具有抗逆性強(qiáng)、耐粗飼的優(yōu)點(diǎn)[1]。但近年來，由于生態(tài)環(huán)境惡化和選留種不科學(xué)等原因，都安山羊和隆林山羊出現(xiàn)生產(chǎn)質(zhì)量下降和品質(zhì)退化的現(xiàn)象[8]，因此，保護(hù)這2個(gè)地方山羊品種資源刻不容緩。本研究采用PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序和生物信息學(xué)方法，對(duì)都安山羊和隆林山羊共58個(gè)個(gè)體的mtDNA D-loop區(qū)全序列進(jìn)行檢測(cè)，以研究這2個(gè)地方山羊品種的遺傳多樣性和母系起源，為我國(guó)地方山羊品種資源的保護(hù)和育種利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及基因組DNA的提取 在廣西壯族自治區(qū)大化縣養(yǎng)殖場(chǎng)采集35只都安山羊，在隆林縣隆林山羊保種場(chǎng)采集23只隆林山羊的耳組織樣，所采個(gè)體符合品種特征，為避開樣本個(gè)體間的親緣關(guān)系，本研究根據(jù)家系信息來采取山羊耳組織樣品，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，用常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，稀釋濃度至10～20 ng/μL，保存?zhèn)溆?。從NCBI網(wǎng)站上查找并下載2條野山羊序列作為對(duì)照，一條為彎角野山羊序列（登錄號(hào)：AB044306）；另一條為旋角野山羊序列（登錄號(hào)：AB004076）。下載家山羊mtDNA D-loop區(qū)全序列A、B、C及D支系各1條做對(duì)照，登錄號(hào)分別為AB004082、KM464500、AB110555和AB110587。

1.2 引物合成和擴(kuò)增 本研究引用劉若余等[9]和郝榮超等[10]對(duì)中國(guó)山羊mtDNA D-loop區(qū)全序列研究所用的引物。上游引物F：5′-CAGTCGAACATCCCTACATTA TTATTGG-3′，下游引物R：5′-TTAGTCTTATTGATTT GGAGGGCGTTA-3′，中間引物I：5′-ATGCGTATCC CGTCCACTAGATC-3′，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR體系25 μL：2×PrimeSTAR Max Premix（上海寶生物公司）10.5 μL，上、下游物（10 pmol/μL）各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，超純水12.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃復(fù)性 60 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠（含GoldView核酸染料）電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增效果進(jìn)行檢查。將符合要求的PCR產(chǎn)物送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析 用seqman對(duì)山羊mtDNA D-loop全序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接和校正。用MEGA7將都安山羊和隆林山羊的mtDNA D-loop序列與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，并輔以人工校正。用MEGA7構(gòu)建這2個(gè)山羊品種的單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。用DnaSP6軟件計(jì)算山羊的mtDNA D-loop單倍型多樣度、核酸多樣度以及平均核酸差異數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 都安山羊和隆林山羊mtDNA D-loop全序列長(zhǎng)度和堿基構(gòu)成 從35只都安山羊和23只隆林山羊mtDNA D-loop區(qū)的PCR產(chǎn)物中隨機(jī)選取10個(gè)樣本，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，條帶明亮清晰，沒有雜帶，長(zhǎng)度在1 000～2 000 bp（圖1）。通過測(cè)序測(cè)定58個(gè)個(gè)體的mtDNA D-loop全序列長(zhǎng)為1 212～1 213 bp，其中有42個(gè)個(gè)體為1 212 bp，16個(gè)個(gè)體為1 213 bp，這是由于在1 074 bp處插入1個(gè)堿基C造成的。4種堿基A、T、G和C平均百分比分別為31.3%、28.8%、13.9%和26.0%。A+T含量為60.1%，G+C含量為39.9%，A+T含量顯著高于G+C含量。

2.2 都安山羊和隆林山羊mtDNA D-loop區(qū)全序列多態(tài)性分析 通過對(duì)都安山羊和隆林山羊共58個(gè)個(gè)體的mtDNA D-loop區(qū)全序列進(jìn)行測(cè)序分析，檢測(cè)到83個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（圖2），定義32個(gè)單倍型，其中都安山羊有22個(gè)單倍型，隆林山羊有16個(gè)單倍型，二者有6個(gè)單倍型是共享的。都安山羊和隆林山羊的單倍型多樣度分別為0.956和0.960，其核苷酸多樣度均為0.018，其平均核苷酸差異數(shù)（k）分別為21.2和21.5。

2.3 都安山羊和隆林山羊mtDNA D-loop序列的聚類分析將都安山羊和隆林山羊32個(gè)mtDNA D-loop區(qū)單倍型與旋角野山羊、彎角野山羊以及家養(yǎng)山羊A、B、C和D支系對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行聚類分析（圖3），發(fā)現(xiàn)都安山羊和隆林山羊分為2個(gè)支系，分別為A支系和B支系，其中A支系包含彎角野山羊，而旋角野山羊作為外群，單獨(dú)聚為一支。

3 討論

本研究測(cè)定的35只都安山羊和23只隆林山羊的mtDNA D-loop區(qū)全序列長(zhǎng)為1 212～1 213 bp。劉若余等[9]測(cè)定了9個(gè)中國(guó)山羊品種共128個(gè)個(gè)體的mtDNA D-loop區(qū)序列，結(jié)果得出9個(gè)中國(guó)山羊品種的單倍型多樣度均高于0.9，表明中國(guó)山羊遺傳多樣性豐富。郝榮超等[10]測(cè)定了10個(gè)中國(guó)南部山羊品種140個(gè)個(gè)體的mtDNA D-loop區(qū)序列，其平均單倍型多樣度和核苷酸多樣度分別為0.988、0.021，說明中國(guó)山羊具有豐富的遺傳多樣性。在都安山羊和隆林山羊中共發(fā)現(xiàn)83個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，32個(gè)單倍型，其單倍型多樣度分別為0.956和0.960，核苷酸多樣性均為0.018，說明都安山羊和隆林山羊也具有豐富的遺傳多樣性。

由于山羊最初家養(yǎng)的地方與彎角野山羊的地理分布（中亞西亞的諸多山脈）有高度的相關(guān)性，因此有研究者推測(cè)彎角山養(yǎng)是最可能的母系起源[11]。通過mtDNA D-loop區(qū)序列研究，發(fā)現(xiàn)中國(guó)山羊共有4個(gè)支系（A-D）[7,9-10,12]。李祥龍等[13]研究中國(guó)18個(gè)地方山羊品種的mtDNA RFLP多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)2個(gè)基本單倍型I和II，提出中國(guó)山羊可能是彎角野山羊與旋角野山羊的混合起源，由于該文并沒有使用彎角野山羊與旋角野山羊樣本進(jìn)行分析，因此，李祥龍等[13]提出的中國(guó)山羊混合起源學(xué)說僅僅是推測(cè)。劉若余等[10]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)山羊品種主要為A和B支系，且只在西藏山羊中發(fā)現(xiàn)C和D 2個(gè)支系。此外，有研究對(duì)來自不同地理區(qū)域的中國(guó)山羊品種進(jìn)行分析，在太行、內(nèi)蒙古等地區(qū)的山羊品種中檢測(cè)到D支系，而其他地區(qū)的家山羊品種則為A和B支系[12]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，都安山羊和隆林山羊32個(gè)單倍型分為A和B 2個(gè)支系，說明都安山羊和隆林山羊有2個(gè)母系起源，其中彎角野山羊與A支系聚在一起，而旋角山羊單獨(dú)聚為一支，說明彎角野山羊是都安山羊和隆林山羊的母系起源，尚未有證據(jù)表明旋角山羊?qū)Χ及采窖蚝吐×稚窖虻哪赶颠z傳有貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)35只都安山羊和23只隆林山羊的mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明都安山羊和隆林山羊具有豐富的遺傳多樣性；通過構(gòu)建NJ發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)都安山羊和隆林山羊主要分為A支系和B支系，其中A支系與彎角野山羊聚在一起，而旋角野山羊單獨(dú)聚為一支，說明彎角野山羊是都安山羊和隆林山羊的母系祖先。